俞琦++梁建東++王平+田維毅

【摘要】目的：觀察梔子對大鼠腸道菌群和血清細胞因子的影響。方法：將40只大鼠隨機分成正常對照組、抗生素對照組和梔子高/中/低劑量組，抗生素對照組和梔子高、中、低劑量組分別給予鹽酸林可霉素和不同劑量梔子水提物灌胃，正常對照組代以生理鹽水，連續(xù) 14d。觀察各組大鼠一般情況，檢測大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和腸桿菌菌群數(shù)量，及血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、γ-干擾素（IFN-γ）表達水平。結(jié)果：與正常對照組比較，抗生素對照組和梔子中、高劑量組大鼠出現(xiàn)腹瀉，體質(zhì)量明顯下降（P<001）；抗生素對照組大鼠腸道內(nèi)4種菌群數(shù)量均發(fā)生明顯改變（P<005或P<001）；梔子中、高劑量組大鼠腸桿菌菌群數(shù)明顯降低（P<005或P<001），雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌菌群無明顯變化；梔子中劑量組大鼠血清TNF-α水平明顯下降（P<005）；梔子高劑量組大鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯降低（P<005或P<001）。結(jié)論：梔子對腸道菌群有一定影響，但不引起腸道菌群失調(diào)，梔子可下調(diào)血清TNF-α和IL-6水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

【關鍵詞】梔子；大鼠；腸道菌群；細胞因子

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）07-0029-03

中藥梔子（Gardenia jasminoides Ellis）是茜草科植物梔子的干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，臨床主要用于急性黃疸型肝炎、膀胱炎、目赤腫痛、上消化道出血等癥[1]。梔子性味苦、寒，歸心、肺、三焦經(jīng)，為常見的苦寒藥物。歷代醫(yī)藥學家認為其苦寒礙胃，有耗氣傷陰之弊?，F(xiàn)代研究表明[2]，苦寒中藥可通過干預腸道菌群的種類、數(shù)量、比例、定位等生態(tài)因素，影響腸道代謝和免疫防御等功能。本研究擬建立不同劑量的梔子水提物灌胃模型，觀察梔子對大鼠腸道中4種優(yōu)勢菌群和血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、γ-干擾素（IFN-γ）表達的影響，探討苦寒藥梔子對腸道生物學功能的調(diào)節(jié)作用，為其臨床的合理使用提供科學依據(jù)。

1儀器與材料

11動物SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重（200±20）g，購于重慶滕鑫生物技術有限公司，許可證號：SCXK-（軍）2012-0011。

12材料梔子購于北京同仁堂貴陽藥店，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院生藥教研室鑒定為正品。鹽酸林可霉素注射液（河南天方藥業(yè)有限公司，批號070120049），雙歧桿菌BS培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂（青島海博生物技術有限公司），伊紅美藍瓊脂（EMB培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司），大鼠TNF-α、IL-6和IFN-γ ELISA檢測試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

13[JP2]儀器SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州凈化）；厭氧培養(yǎng)袋（日本三菱）；371型培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；ELX800全自動酶標儀（美國BioTek公司）；高速低溫離心機 5804D（德國Eppendorf公司）。[JP]

2方法

21中藥水提物的制備按照規(guī)范制劑要求，常規(guī)制備梔子水提液，調(diào)整濃度相當于生藥2g/mL冷藏備用。

22動物分組及處理取40只大鼠隨機分成正常對照組、抗生素對照組及梔子高、中、低劑量組，每組8只。梔子水提液以成年人（按60kg計算）常規(guī)用藥劑量的等效劑量為中劑量，大劑量為中劑量 5倍，小劑量為中劑量的 1/5。即梔子高、中、低劑量組分別以75、15、03g/kg灌胃給藥，抗生素對照組給予鹽酸林可霉素灌胃[3]，各組給藥體積為2mL/只，正常對照組給予等體積生理鹽水，每日1 次，連續(xù) 14d。

23一般情況觀察觀察和記錄各組大鼠活動、飲食、排便情況，用藥第1天、第7天、第14天稱量各組大鼠體質(zhì)量，記錄大鼠體質(zhì)量變化。

24主要菌群分析末次給藥24h后，大鼠股靜脈取血，4℃靜置過夜，離心取上清，置于-20℃冰箱待測。參照文獻[4]，處死各組大鼠，剪開腹腔，無菌操作取盲腸內(nèi)容物01g，[JP2]放入無菌試管內(nèi)，加09mL生理鹽水，均勻震蕩15min，將震蕩好的溶液進行10倍系列稀釋至10-9，根據(jù)預實驗結(jié)果選用合適的稀釋度，分別接種于各種培養(yǎng)基中，雙歧桿菌：BS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)72 h；乳桿菌：MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h；腸桿菌：EMB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h；腸球菌：膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂，37℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)菌落，根據(jù)稀釋度換算每g糞便中的細菌數(shù)，結(jié)果以菌落形成單位/克（CFU/g）的對數(shù)表示，即lg CFU/g。[JP]

25血清細胞因子水平檢測取凍存血清，采用ELISA法，測定TNF-α、IL-6和IFN-γ水平，操作步驟按試劑盒說明書進行。

26統(tǒng)計分析應用SPSS 190軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x[TX-*3]±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統(tǒng)計意義。

3結(jié)果

31梔子對大鼠一般情況的影響正常對照組和梔子低劑量組大鼠進食和飲水量正常，被毛光滑致密，無腹瀉；梔子中劑量組大鼠進食量逐漸下降，活動減少，毛色光澤度降低，出現(xiàn)腹瀉，排稀便。抗生素對照組和梔子高劑量組大鼠進食飲水明顯減少，腹瀉較重，畏寒倦怠，被毛凌亂無光澤。灌胃后，隨時間延長各組大鼠體質(zhì)量逐漸上升，但抗生素對照組、梔子高劑量組上升緩慢，且在用藥后期呈現(xiàn)下降趨勢。與正常對照組比較，用藥第7 天，抗生素對照組和梔子高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P<005）；用藥第14 天，抗生素對照組和梔子中、高劑量組大鼠體質(zhì)量均明顯下降（P<001）。

4討論

苦寒藥物是最常用的中藥類別之一，在臨床各科有著廣泛應用。苦寒藥大多有瀉下之功，長期或大量使用容易導致腹部隱痛、腹脹、腹瀉等癥狀。人和動物胃腸道定居著種類復雜和數(shù)量龐大的正常微生物群，它們與機體間形成了互利共生的關系，保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，并對機體的物質(zhì)代謝和免疫防御起著重要作用。包括藥物在內(nèi)的某些因素導致正常菌群的數(shù)量和比例發(fā)生大幅度改變時即為菌群失調(diào)，常引起急慢性腹瀉和免疫功能紊亂等表現(xiàn)[5]。梔子是臨床常用的苦寒中藥，為了探討梔子對腸道微生態(tài)和機體免疫的影響，本研究觀察了口服梔子水提物對大鼠4種優(yōu)勢腸道菌群和血清細胞因子表達的影響。

結(jié)果顯示，梔子中、高劑量可引起大鼠腹瀉、體質(zhì)量減輕，提示連續(xù)服用較大劑量梔子具有明顯的瀉下作用。梔子低劑量對4種腸道優(yōu)勢菌群無影響，中、高劑量對大鼠腸道內(nèi)腸桿菌有一定抑制作用，但不影響雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌的數(shù)量，提示梔子的應用沒有導致大鼠菌群失調(diào)，而是起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。雙歧桿菌和乳桿菌被認為是腸道的益生菌，可維持腸道的健康環(huán)境，并通過競爭性抑制阻礙致病菌的黏附與定植，其產(chǎn)生的有機酸等代謝產(chǎn)物還能抑制或殺死有害生物[6]。梔子保持雙歧桿菌、乳桿菌菌群的相對穩(wěn)定，提示該藥對腸粘膜可能有重要的保護效應。

TNF-α、IL-6和IFN-γ是由多種免疫細胞分泌的炎性細胞因子，介導機體組織細胞的生長、分化和功能調(diào)控，調(diào)節(jié)機體免疫并引起炎癥反應。羅霞等[7]、孫必強等[8]認為菌群失調(diào)與炎癥因子的釋放水平相關。研究顯示，抗生素對照組大鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平均顯著升高，提示菌群失調(diào)可能與炎癥反應的發(fā)生有關，與文獻研究一致[7-8]。實驗結(jié)果顯示，梔子未導致明顯菌群失調(diào)，但不同程度地抑制了大鼠血清中TNF-α和IL-6的釋放，提示該藥對機體細胞因子的釋放具有不同程度的調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。

參考文獻

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[2][JP3] 吳云，陳瑞，田維毅.苦寒中藥對腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的研究進展[J].中國微生態(tài)學雜志，2015，27（2）：235-239.[JP]

[3] 于蓮，張靈芝，馬淑霞，等.納米山藥多糖合生元結(jié)腸靶向微生態(tài)調(diào)節(jié)劑對菌群失調(diào)大鼠細胞因子和凋亡蛋白表達影響[J].中國新藥雜志，2016，25（24）：2871-2875.

[4] 林曦，謝曉煌，吳仕嬌，等.甲嘎松湯對急性肝損傷小鼠腸道菌群及細胞因子的影響[J].中醫(yī)藥導報，2016，22（10）：10-17.

[5] 祝司霞.腸道菌群失調(diào)與疾病[J].科技信息，2012（25）：446.

[6] 王福穎.德氏乳桿菌微膠囊性能評價及對腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究[D].哈爾濱： 黑龍江大學，2014.

[7] 羅霞，羅爽，鄭彥懿，等.腸道菌群失調(diào)增加小鼠腸上皮內(nèi)T淋巴細胞活化和促炎細胞因子分泌[J].細胞與分子免疫學雜志，2016，32（8）：1031-1035.

[8]孫必強，周英，劉衛(wèi)東，等.不同劑型七味白術散對腸道菌群失調(diào)小鼠腸黏膜和血清 TNF-α，IL-6的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（4）：95-100.