徐楗熒，趙雪燕，王磊，楊嫦玉，蔡桂豐

(珠海市婦幼保健院生殖中心，珠海 519000)

AIH治療失敗后行IVF-ET患者卵泡液中抗精子抗體和抗心磷脂抗體表達(dá)情況及妊娠結(jié)局

徐楗熒*，趙雪燕，王磊，楊嫦玉，蔡桂豐

(珠海市婦幼保健院生殖中心，珠海 519000)

目的 探討夫精人工授精(AIH)治療失敗后行IVF-ET患者，卵泡液中抗精子抗體(AsAb)和抗心磷脂抗體(AcAb)表達(dá)情況及妊娠結(jié)局。 方法 回顧性分析2014年1月～10月在我院生殖中心AIH≥3次失敗后行IVF-ET的79個(gè)周期，其中30個(gè)周期行IVF-ET后無(wú)優(yōu)質(zhì)胚胎移植或未妊娠者納入A組，49個(gè)周期行IVF-ET后成功妊娠者作為對(duì)照B組，比較兩組臨床資料、獲卵、受精及優(yōu)質(zhì)胚胎情況；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)兩組卵泡液中AsAb和AcAb的表達(dá)。 結(jié)果 兩組年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、激素等臨床資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。A組受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著低于B組 (P<0.01)；A組平均獲卵數(shù)和卵裂率低于B組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。卵泡液中AsAb和AcAb在A組陽(yáng)性率均顯著高于B組(P<0.01)。 結(jié)論 AIH≥3次未妊娠后行IVF-ET卵泡液中AsAb和AcAb陽(yáng)性表達(dá)，可能影響受精、優(yōu)質(zhì)胚胎形成和胚胎種植生殖環(huán)節(jié)。

夫精人工授精； 體外受精-胚胎移植； 抗精子抗體； 抗心磷脂抗體； 妊娠結(jié)局

(JReprodMed2017，26(4)：341-344)

不孕的病因和機(jī)制非常復(fù)雜，近年來(lái)有關(guān)免疫與不孕的關(guān)系已引起研究學(xué)者的高度重視，并成為生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。免疫因子抗精子抗體(antisperm antibodies，AsAb)和抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibodies，AcAb)與不孕及流產(chǎn)關(guān)系密切，目前較多臨床研究提示血液和宮頸粘液中AsAb和AcAb陽(yáng)性表達(dá)導(dǎo)致不孕和孕早期流產(chǎn)[2-6]。但是，卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況及與不孕的關(guān)系國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。本研究回顧性分析反復(fù)夫精人工授精(AIH)治療失敗后行IVF-ET患者79個(gè)周期，探討免疫因子AsAb和AcAb表達(dá)情況及妊娠結(jié)局。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

回顧性分析2014年1月～10月在我院生殖中心行IVF-ET的79個(gè)周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往行AIH≥3次失?。?2)超聲檢查未發(fā)現(xiàn)卵巢囊腫或者行腹腔鏡檢查排除子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)及盆腔粘連；(3)無(wú)生殖道及子宮器質(zhì)性疾病，宮腔無(wú)病變；(4)既往無(wú)家族性特殊病種史，無(wú)免疫系統(tǒng)疾病、血液病、血栓性疾病及其他系統(tǒng)疾病史。其中30個(gè)周期行IVF-ET后無(wú)優(yōu)質(zhì)胚胎移植或未妊娠者納入A組，包括繼發(fā)不孕9個(gè)周期，原發(fā)不孕21個(gè)周期；49個(gè)周期行IVF-ET后成功妊娠者作為對(duì)照組(B組)，包括繼發(fā)不孕20個(gè)周期，原發(fā)不孕29個(gè)周期。根據(jù)男方取卵當(dāng)天取出精子的情況決定受精方式，A組25個(gè)周期行常規(guī)IVF，5個(gè)周期行卵母細(xì)胞漿單精子注射(ICSI)；B組45個(gè)周期行常規(guī)IVF，4個(gè)周期行ICSI。病因包括輸卵管因素、多囊卵巢綜合征、排卵障礙、男方少、弱、畸形精子癥等。

二、研究方法

1. 控制性促排卵方案：應(yīng)用長(zhǎng)效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，博福—益普生，法國(guó))長(zhǎng)方案降調(diào)節(jié)，月經(jīng)第3天后給予重組卵泡刺激素(rFSH，默克雪蘭諾，德國(guó))和/或尿人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG，廣州麗珠)進(jìn)行控制性促排卵，根據(jù)患者情況及卵泡長(zhǎng)勢(shì)調(diào)整劑量。兩組患者均于用藥期間行陰道超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，并測(cè)定血清LH、E2及孕酮(P)水平。當(dāng)至少有1個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm或者2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥17 mm時(shí)，皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤，默克雪蘭諾，德國(guó))250 μg。

2.取卵及移植：注射重組人絨毛膜促性腺激素后34～36 h陰道超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)。卵母細(xì)胞培養(yǎng)3～6 h后行IVF或者ICSI，受精16～20 h觀察受精卵原核形成情況，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察胚胎卵裂情況，取卵后第3天對(duì)胚胎進(jìn)行分級(jí)并行胚胎移植。

3. 胚胎分級(jí)[7]：根據(jù)卵裂速度、碎片量、卵裂球形態(tài)及均勻度等情況，將胚胎分為四級(jí)。A級(jí)：胚胎卵裂球呈圓或卵圓形，大小均勻，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻清晰，透明帶完整，無(wú)碎片或碎片<5%；B級(jí)：卵裂球形狀略不規(guī)則，大小略不同，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片6%～20%；C級(jí)：卵裂球大小明顯不均，可有明顯形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片21%～50%，透明帶完整；D級(jí)：卵裂球大小嚴(yán)重不均，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，碎片>50%。A級(jí)和B級(jí)胚胎定為優(yōu)質(zhì)胚胎。

4. 妊娠結(jié)局判定：所有患者均于取卵后每天肌注60 mg黃體酮注射液 (湖北制藥)行黃體支持。胚胎移植后第14天測(cè)定血清中HCG水平，>50 U/L 者為生化妊娠，繼續(xù)黃體支持。移植后第28～35天行陰道超聲檢查見(jiàn)到胎芽及胎心血管搏動(dòng)者為臨床妊娠。

5. 標(biāo)本取材：行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)時(shí)負(fù)壓抽吸卵泡液10～20 ml，避免血液污染，收集淡黃色卵泡液到無(wú)菌管中。室溫靜置10～15 min，每份標(biāo)本分裝兩個(gè)無(wú)菌管置于-20℃冰箱備用，用于ELISA實(shí)驗(yàn)。

6. ELISA法檢測(cè)AsAb和AcAb表達(dá)情況：ELISA試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，用于檢測(cè)人卵泡液中AsAb和AcAb蛋白表達(dá)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。應(yīng)用酶標(biāo)儀(iMark型，BIO-RAD公司，美國(guó))以450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(optical density，OD值)，每個(gè)標(biāo)本同批次均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算OD平均值。P/N=標(biāo)本平均OD值/陰性對(duì)照OD值，P/N≥2.1為陽(yáng)性，P/N<2.1為陰性，陰性對(duì)照小于0.10時(shí)以0.10計(jì)算。

7.觀察指標(biāo)：比較兩組患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)性激素、啟動(dòng)日及HCG性激素水平，獲卵及受精情況，妊娠結(jié)局情況，卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，兩組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組一般情況比較

兩組患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)T、啟動(dòng)日FSH、LH及HCG日LH、E2相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05) (表1)。

二、兩組獲卵及受精情況比較

A組的受精率低于B組，差異有顯著性意義(P<0.01)；A組的平均獲卵數(shù)和卵裂率均低于B組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)。A組中9個(gè)周期因移植日無(wú)優(yōu)質(zhì)胚胎未行移植，其中6個(gè)周期因無(wú)正常受精而無(wú)優(yōu)質(zhì)胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著低于B組(P<0.01) (表2)。

三、兩組妊娠結(jié)局情況

A組患者行ET均未妊娠，其中5個(gè)周期因移植日卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)高風(fēng)險(xiǎn)、孕酮升高等因素取消新鮮胚胎移植，后行FET未妊娠。B組中10個(gè)周期因上述因素未行新鮮胚胎移植，后行FET成功妊娠；2個(gè)周期為新鮮胚胎移植周期未成功，后行FET成功妊娠。B組3個(gè)周期孕早期流產(chǎn)(占6.12%)，2個(gè)周期宮外孕。

四、兩組卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況比較

兩組卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況比較，A組的AsAb和AcAb 陽(yáng)性率均高于B組，比較有顯著性差異(P<0.01) (表3)。

表1 兩組一般情況比較(x-±s)

表2 兩組獲卵及受精情況比較 [(x-±s)，%]

注：與A組比較，*P<0.01

討 論

生殖免疫學(xué)是近年來(lái)發(fā)展極快的新興學(xué)科，從免疫學(xué)的角度研究生殖過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，并為生殖醫(yī)學(xué)開(kāi)拓新的診斷和防治途徑。隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)患者機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的某些抗體導(dǎo)致不孕。免疫性不孕發(fā)病率波動(dòng)于5%～79%，血液中及卵泡液中存在各種抗體引起免疫紊亂，導(dǎo)致精子與卵母細(xì)胞受精、配子形成、胚胎發(fā)育及著床等各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，可能是引起不孕的原因[8-10]。

在免疫性不孕中，最常見(jiàn)的是AsAb所導(dǎo)致的生殖障礙[11]?？咕涌贵w主要生物學(xué)效應(yīng)[12]：妨礙精子正常發(fā)生；干擾精子獲能和頂體反應(yīng)；引起精子凝集與制動(dòng)；發(fā)揮細(xì)胞毒性作用；抑制精子穿透宮頸粘液；限制精子與卵母細(xì)胞粘附；阻止精子與卵母細(xì)胞結(jié)合并干擾受精過(guò)程；干擾胚胎著床并影響胚胎存活。精子獲能過(guò)程涉及精子膜蛋白磷酸化和脂質(zhì)再分布。頂體反應(yīng)是精子膜與外頂體膜融合，使頂體素和透明質(zhì)酸酶等頂體內(nèi)容物暴露的胞吐過(guò)程。卵泡液中AsAb能夠阻止精子與透明帶結(jié)合，抑制頂體反應(yīng)[13]。但是，血液及卵泡液中AsAb是否與IVF-ET妊娠結(jié)局有關(guān)尚存在爭(zhēng)議[14]。本研究通過(guò)檢測(cè)反復(fù)AIH失敗患者行IVF-ET后卵泡液中AsAb表達(dá)情況，提示AsAb陽(yáng)性表達(dá)的患者受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均降低。受精過(guò)程涉及精子與卵丘細(xì)胞的相互作用、精子與卵透明帶的初級(jí)結(jié)合、次級(jí)結(jié)合以及精子與卵細(xì)胞膜的結(jié)合。頂體透明質(zhì)酸酶能分解卵丘的基質(zhì)，促進(jìn)精子穿透卵丘，同時(shí)能增加精子Ca2+，使精子對(duì)其后卵透明帶誘發(fā)的頂體反應(yīng)更敏感。精子與透明帶的結(jié)合涉及特異性蛋白或糖的相互作用。抗精子抗體能阻斷上述過(guò)程，從而影響受精。

表3 兩組卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況比較(%)

注：與A組比較，*P<0.01

自身免疫是指機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)自身抗原和(或)自身致敏性淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。如果自身抗體或自身致敏性淋巴細(xì)胞攻擊自身組織、細(xì)胞導(dǎo)致其產(chǎn)生病理改變和功能障礙時(shí)即為病理性自身免疫?？沽字贵w是一組針對(duì)各種帶有負(fù)電荷的磷脂及其結(jié)合蛋白成分而產(chǎn)生的自身免疫抗體，主要有AcAb。AcAb通過(guò)抑制細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分化為合體滋養(yǎng)細(xì)胞使胎盤β-HCG合成和分泌減少，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，減弱滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕能力，干擾子宮螺旋動(dòng)脈血管重鑄等方面影響胚胎著床及種植。有研究顯示，AcAb抗體陽(yáng)性者其IVF-ET周期妊娠率及胚胎種植率下降[15]。本研究顯示，反復(fù)AIH失敗患者行IVF-ET后，無(wú)優(yōu)質(zhì)胚胎移植或未妊娠者卵泡液中AcAb抗體陽(yáng)性率為36.7%，行ET或者FET成功妊娠者卵泡液中AcAb抗體陽(yáng)性率為10.2%。無(wú)優(yōu)質(zhì)胚胎移植或未妊娠者卵泡液中AcAb抗體陽(yáng)性率顯著高于成功妊娠者，比較有顯著性差異(P<0.01)。反復(fù)AIH失敗患者行IVF-ET卵泡液中AsAb和AcAb陽(yáng)性表達(dá)，可能影響受精、優(yōu)質(zhì)胚胎形成和胚胎種植生殖環(huán)節(jié)。

[1] Deroux A，Dumestre-Perard C，Dunand-Faure C，et al. Female infertility and serum auto-antibodies：a systematic review [J]. Clin Rev Allergy Immunol，2016 Sep 14. [Epub ahead of print].

[2] Naz RK，Butler TS. Antibodies to prostate-specific antigen in immunoinfertile women and men [J]. J Reprod Immunol，2013，97：217-222.

[3] Restrepo B，Cardona-Maya W. Antisperm antibodies and fertility association [J]. Actas Urol Esp，2013，37：571-578.

[4] Chighizola CB，de Jesus GR. Antiphospholipid antibodies and infertility[J]. Lupus，2014，23：1232-1238.

[5] Couto E，Barini R，Pinto e Silva JL，et al. Anticardiolipin antibody in recurrent spontaneous aborting and fertile women [J]. Sao Paulo Med J，1998，116：1760-1765.

[7] 蔡桂豐，許偉標(biāo)，阮永銘，等. 體外受精-胚胎移植中影響胚胎著床的因素分析[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2013，22：190-193.

[8] Suri A. Sperm specific proteins-potential candidate molecules for fertility control [J]. Reprod Biol Endocrinol，2004，2：10.

[9] Shibahara H，Koriyama J，Shiraishi Y，et al. Diagnosis and treatment of immunologically infertile women with sperm-immobilizing antibodies in their sera [J]. J Reprod Immunol，2009，83：139-144.

[10] Esteves SC，Schneider DT，Verza S Jr. Influence of antisperm antibodies in the semen on intracytoplasmic sperm injection outcome [J]. Int Braz J Urol，2007，33：795-802.

[11] 全國(guó)免疫性不孕不育癥專題研討會(huì)紀(jì)要. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2003，12：44-45.

[12] 羅麗蘭. 不孕與不育(第2版) [M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：99-102.

[13] Marín-Briggiler CI，Vazquez-Levin MH，Gonzalez-Echeverría F，et al. Effect of antisperm antibodies present in human follicular fluid upon the acrosome reaction and sperm-zona pellucida interaction [J]. Am J Reprod Immunol，2003，50：209-219.

[14] Vujisic′ S，Lepej SZ，Jerkovic′ L，et al. Antisperm antibodies in semen，sera and follicular fluids of infertile patients：relation to reproductive outcome after in vitro fertilization [J]. Am J Reprod Immunol，2005，54：13-20.

[15] Ying Y，Zhong YP，Zhou CQ，et al. A retrospective study on IVF outcome in patients with anticardiolipin antibody：effects of methylprednisolone plus low-dose aspirin adjuvant treatment [J]. J Reprod Immunol，2012，94：196-201.

[編輯：郭永]

Relationship between pregnancy outcome and expression of AsAb and AcAb in follicular fluid in IVF-ET patient after AIH failure

XUJian-Ying*，ZHAOXue-Yan，WANGLei，YANGChang-Yu，CAIGui-Feng

ZhuhaiMaternalandChildren’sHospitalandHealthInstitute，Zhuhai519000

Objective：To investigate the relationship between pregnancy outcome and the expression of antisperm antibodies (AsAb)and anticardiolipin antibodies (AcAb) in follicular fluid in the IVF-ET patients after the failure of assisted insemination with husband sperm (AIH).Methods：The data of 79 IVF-ET cycles of infertile patients after ≥ 3 times of AIH failure in the reproductive medical centre of our hospital from Jan. to Oct. 2014 were analyzed. Thirty cycles had no high-quality embryos transfer or no pregnancy in group A，and 49 cycles had successful pregnancy in group B. The clinical data，number of oocytes retrieved，fertilization rate and number of high-quality embryos were compared between the two groups. The expressions of AsAb and AcAb protein in follicular fluid were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and compared between the two groups.Results：There was no statistically differences in age，duration of infertility，body mass index (BMI) and hormone levels (P>0.05). The fertilization rate and high-quality embryo number in group A were significantly lower than those in group B (P<0.01). The number of oocytes retrieved and cleavage rate were lower in group A than those in group B，but the differences were not significant (P>0.05). The positive rates of AsAb and AcAb in group A were significantly higher than those in group B (P<0.01).Conclusions：The positive expression of AsAb and AcAb in follicular fluid had negative effects on the fertilization，formation of high-quality embryo and embryo implantation in IVF-ET patients after ≥ 3 times of AIH failure.

AIH； IVF-ET； AsAb； AcAb； Pregnancy outcome

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.010

2016-09-09；

2016-11-12

珠海市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2014018)

徐楗熒，女，山東人，博士，副主任醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

)