［KH－3D］林茂，李進(jìn)華，唐慶，廖美蘭，王華新，龍定建

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧530002)

三苞唇柱苣苔離體培養(yǎng)體系的建立

［KH－*3D］林茂，李進(jìn)華，唐慶，廖美蘭，王華新，龍定建*

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧530002)

以三苞唇柱苣苔(Chirita tribracteata W．T．Wang)的幼嫩葉片為外植體，開展外植體消毒滅菌、葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及分化、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及植株玻璃化的研究。結(jié)果表明:葉片的滅菌方法可采用乙醇浸泡10 s結(jié)合升汞浸泡12～16 s;葉片的最佳愈傷組織誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2．0 mg/L+NAA 0．1 mg/L;繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1．0 mg/L+IBA 0．1～0．5 mg/L或者M(jìn)S+6-BA 1．0 mg/L+NAA 0．1～0．5 mg/L;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0．1～0．3 mg/L，生根率為100．00%;培養(yǎng)基中不添加6-BA或添加低濃度的6-BA或者添加適量活性炭均可減輕植株的玻璃化。

三苞唇柱苣苔;離體培養(yǎng);玻璃化

三苞唇柱苣苔(Chirita tribracteata W．T．Wang)為多年生草本植物，屬苦苣苔科唇柱苣苔屬。三苞唇柱苣苔生于石灰?guī)r山洞中或石灰?guī)r石山山腳，喜陰濕，花期為6月。該物種的模式產(chǎn)地為石灰?guī)r山洞，在分布上具有一定的特殊性和局限性。由于該物種對生境要求嚴(yán)格，分布范圍又極其狹窄，使得該種成為珍稀瀕危物種。在目前發(fā)現(xiàn)的居群中，植株數(shù)量不多，但居群更新良好。三苞唇柱苣苔具有很高的觀賞價值，花量大，易爆盆，極具室內(nèi)觀賞盆花開發(fā)前景，由于其具有極高的藥用價值，頻受人類活動的干擾，導(dǎo)致其生境受到破壞。因此，對該種進(jìn)行資源保護(hù)及開發(fā)利用研究，尤其是加強(qiáng)繁育及種質(zhì)資源的研究有一定必要性和迫切性?？嘬奶浦参锏姆N子都極小，不易收集貯藏，常規(guī)的播種繁育受到了一定的限制，尤其是在繁育規(guī)模和速度上。組織培養(yǎng)具有繁殖數(shù)量多、速度快的特點，是實現(xiàn)快速繁殖、資源保存的有效途徑。近年來關(guān)于苦苣苔科植物的離體培養(yǎng)研究逐年增加，關(guān)于唇柱苣苔屬植物的組培快繁研究也陸續(xù)報道［1－6］，而關(guān)于三苞唇柱苣苔的組織培養(yǎng)方面的研究不多，僅有余海霞［7］、韋嘯［8］、黃素梅［9］進(jìn)行了相關(guān)報道，并成功建立了組培快繁體系。三苞唇柱苣苔的外植體以幼嫩葉片［7，9］、帶腋芽花梗［8－9］、花瓣［9］為主，但黃素梅認(rèn)為花梗易被誘導(dǎo)出不定芽，而幼葉、花瓣未能誘導(dǎo)出不定芽?，F(xiàn)以三苞唇柱苣苔的幼嫩葉片為外植體，對離體培養(yǎng)各階段的適宜培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以期建立離體培養(yǎng)體系，為其種質(zhì)保存、繁育提供理論依據(jù)，并為三苞唇柱苣苔的引種栽培、種質(zhì)開發(fā)及可持續(xù)利用提供科技支持。

表1 外植體的滅菌方法Table 1The methods of sterilization on explant

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 材料以野生三苞唇柱苣苔的幼嫩葉片為材料，由廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院園林花卉所提供。

1．1．2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件MS培養(yǎng)基中，白砂糖含量為30 g/L，瓊脂4 g/L，pH 5．8～6．0。1/2MS培養(yǎng)基的大量元素含量為MS培養(yǎng)基的一半，白砂糖為15 g/L，其余成分及含量同MS培養(yǎng)基，pH 5．8～6．0。培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照時間為12 h/d，光照強(qiáng)度為2000 lx。

1．2 試驗方法

1．2．1 外植體的消毒滅菌以三包唇柱苣苔的健康植物為母株，取其幼嫩葉片，用洗潔精浸泡葉片10 min后，在自來水下沖洗，邊沖洗邊用軟毛刷輕輕刷洗幼嫩葉片，隨后轉(zhuǎn)入超凈工作臺上操作。在工作臺上，按照表1中乙醇和升汞的滅菌時間進(jìn)行消毒滅菌，乙醇和升汞滅菌后，用無菌水沖洗3～4次，將葉片切成20 mm×20 mm的大小，接種到MS的培養(yǎng)基上。每種滅菌方法的處理葉片數(shù)為20片，重復(fù)3次。15 d后統(tǒng)計葉片污染、成活情況，并計算污染率、成活率:污染率(%)=污染數(shù)/接種數(shù)×100 %;發(fā)芽率(%)=萌發(fā)數(shù)/接種數(shù)×100%。

1．2．2 愈傷組織誘導(dǎo)與分化將未污染的葉片切成5 mm×5 mm的大小，葉片四周切除部分組織，使其四周帶有傷口，然后接種在含有不同激素種類和濃度的培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基的接種量為20片，重復(fù)3次。每天觀察愈傷誘導(dǎo)情況，連續(xù)觀察25 d后，統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)數(shù)以及分化數(shù)，并計算愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織分化率。

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)/接種數(shù)×100

愈傷組織分化率(%)=發(fā)生分化的愈傷數(shù)/接種數(shù)×100

1．2．3 繼代增殖培養(yǎng)將愈傷分化獲得的組培芽，接種在添加了不同激素組合配比的繼代增殖培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基的接種量為20株，重復(fù)3次。每天觀察組培芽的繼代增殖情況，連續(xù)觀察25 d后，統(tǒng)計新芽數(shù)，并計算增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=新芽數(shù)/接種數(shù)

1．2．4 生根培養(yǎng)當(dāng)植株小苗高度為3～4 cm時，將其接種在不同的生根培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基的接種量為20株，重復(fù)3次。每天觀察小苗的生根以及生長情況，連續(xù)觀察20 d后，統(tǒng)計生根數(shù)、根數(shù)，并計算生根率。

生根率(%)=生根數(shù)/接種數(shù)×100

1．2．5 組培苗玻璃化的預(yù)防以MS為基本培養(yǎng)基，將健壯的組培芽分別接種在含有不同6-BA濃度、不同活性炭、的培養(yǎng)基上，如表2、3。每種培養(yǎng)基的接種量為20株，重復(fù)3次。每天觀察植株的生長情況，連續(xù)觀察20 d后，統(tǒng)計玻璃化數(shù)，并分析6-BA濃度、不同活性炭對組培苗玻璃化影響。

玻璃化率(%)=玻璃化苗數(shù)/接種數(shù)×100

1．3 統(tǒng)計分析

使用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行差異顯著性測驗(Duncan’s多重比較)，數(shù)據(jù)用平均值表示。

表2 6-BA對玻璃化的影響Table 2Effects of 6-BA on vitrification

表3 活性炭對玻璃化的影響Table 3Effects of activated carbon on vitrification

2 結(jié)果與分析

2．1 外植體的消毒滅菌

從表4可看出，T1的污染率顯著高于其余8個處理的污染率，T1的成活率顯著低于T2、T3、T4的成活率;T8、T9的污染率顯著低于其余7個處理的污染率，T8、T9的成活率也顯著低于T2、T3、T4的成活率。T2、T3的污染率無顯著差異，分別為51．67%、46．47%;T2、T3的成活率無顯著差異，2個處理的成活率顯著高于其他處理，分別為28．33%、31．67 %。由此表明，不同消毒處理方式對外植體的影響不同。在相同的乙醇滅菌時間下，隨著升汞滅菌時間的增加，污染率降低，成活率則表現(xiàn)出不同的變化:乙醇滅菌時間短，成活率呈上升趨勢，乙醇滅菌時間長，成活率呈下降趨勢。在相同的升汞滅菌時間下，隨著乙醇滅菌時間的增加，污染率在降低，成活率的變化趨勢無規(guī)律。綜上可知，乙醇、升汞的滅菌時間對三苞唇柱苣苔的外植體影響大，滅菌時間短，污染率高，滅菌時間長，成活率偏低，其中，乙醇滅菌時間10 s結(jié)合升汞滅菌12～16 s，可以成功獲得三苞唇柱苣苔的無菌外植體。

表4 不同消毒處理方式對三苞唇柱苣苔外植體的影響Table 4Effects of different methods of sterilization on explants of the Chirita tribracteata W．T．Wang

2．2 愈傷組織誘導(dǎo)與分化

從表5可知，I3、I6的愈傷誘導(dǎo)率分別為96．67 %、98．33%，顯著高于I1、I4，I3、I6的愈傷誘導(dǎo)率。I2、I5的愈傷誘導(dǎo)率無顯著差異。I3的愈傷分化率顯著高于I1、I4、I5、I6，I3的愈傷分化率與I2的無顯著差異，I3的愈傷分化率為96．67%。由此可得，不同種類和濃度的生長素對三苞唇柱苣苔均可誘導(dǎo)出愈傷組織，并且隨著生長素濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率呈上升趨勢;但不同的生長素對愈傷組織分化率的影響不同，2，4-D的愈傷分化率顯著低于NAA的愈傷分化率。可見，生長素NAA對愈傷的誘導(dǎo)和分化均有顯著作用。當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2．0 mg/L+ NAA 0．1 mg/L，愈傷誘導(dǎo)率為96．67%，愈傷分化率為96．67%，愈傷組織在葉片的切口處發(fā)生，分化出的組培芽較多。

2．3 繼代增殖培養(yǎng)

由表6可看出，Z11的增殖系數(shù)為12．10，顯著高于Z1、Z2、Z7的增殖系數(shù)，但Z11培養(yǎng)基上的植株生長差，植株出現(xiàn)玻璃化、黃化的現(xiàn)象。Z1、Z2、Z7、Z8的增殖系數(shù)無顯著差異，且植株生長健壯，植株玻璃化少。由此可知，不同激素配比對三苞唇柱苣苔的繼代增殖培養(yǎng)影響不同，當(dāng)6-BA的濃度為1．0mg/L時，增殖系數(shù)雖然較低，但植株健壯，植株玻璃化程度不高。而隨著6-BA的濃度的升高，增殖系數(shù)也升高，但此時的植株大部分生長細(xì)弱，出現(xiàn)玻璃化甚至黃化的現(xiàn)象。綜上可得出，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1．0 mg/L+IBA 0．1～0．5 mg/L或者M(jìn)S+6-BA 1．0 mg/L+NAA 0．1～0．5 mg/L上，植株生長健壯，植株的玻璃化少。

2．4 生根培養(yǎng)

從表7可看出，各處理間的生根率無顯著差異，生根率均為100．00%。R1、R2的根數(shù)顯著低于與其余處理的根數(shù)。由此表明，三苞唇柱苣苔的生根率不受基本培養(yǎng)基、激素種類和濃度的影響，即在不添加任何激素的MS、1/2MS培養(yǎng)基上均可誘導(dǎo)不定根的形成。但激素的有無對根數(shù)的影響存在顯著差異，在不添加任何激素的MS、1/2MS培養(yǎng)基的根數(shù)顯著偏低，而在添加了激素的MS、1/2MS培養(yǎng)基上，根數(shù)隨著激素濃度增加而增加。尤其是在1/2MS培養(yǎng)基上添加IBA濃度為0．1～0．3 mg/L時，生根最佳，植株健壯，生根極快，根白，有側(cè)根。綜上所述，三苞唇柱苣苔最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0．1～0．3 mg/L，生根率為100．00%，植株生長健壯，生根極快，根系白色，并帶有側(cè)根。

表5 三苞唇柱苣苔的愈傷組織誘導(dǎo)與分化Table 5Callus induction and callus differentiation of the Chirita tribracteata W．T．Wang

表6 不同激素配比對三苞唇柱苣苔的繼代增殖培養(yǎng)的影響Table 6Effects of different hormone combinations on proliferation culture of the Chirita tribracteata W．T．Wang

表7 不同激素配比對三苞唇柱苣苔的生根培養(yǎng)的影響Table 7Effects of different hormone combinations on rooting culture of the Chirita tribracteata W．T．Wang

表8 不同6-BA濃度對三苞唇柱苣苔玻璃化的影響Table 8Effects of different concentrations of 6-BA on vitrification of the Chirita tribracteata W．T．Wang

2．5 組培苗玻璃化的預(yù)防

2．5．16 -BA對玻璃化的影響由表8可看出，B1的玻璃化率顯著低于其他處理，玻璃化率為0，B2的玻璃化率顯著低于B3、B4、B5、B6，B3的玻璃化率顯著低于B4、B5、B6，B4、B5、B6的玻璃化率無顯著差異，其中B6的玻璃化率最高，為86．67%。由此表明，6-BA是影響三苞唇柱苣苔植株玻璃化的因素之一，隨著6-BA濃度的增加，植株的玻璃化率逐漸增加，當(dāng)6-BA的濃度達(dá)到3．0 mg/L以上時，玻璃化率增加不顯著。因此，為有效預(yù)防植株發(fā)生玻璃化，可在培養(yǎng)基中不添加6-BA，但考慮到增殖培養(yǎng)的目的是大量擴(kuò)繁，適當(dāng)添加6-BA有利于新芽的獲得，因此，當(dāng)6-BA與NAA比例適宜時，即培養(yǎng)基為MS+ 6-BA1．0 mg/L+NAA 0．1 mg/L時，可有效減輕植株玻璃化。

2．5．2 活性炭對玻璃化的影響由表9可看出，A1的玻璃化率顯著高于其他處理，玻璃化率為56．67 %，A2的玻璃化率顯著高于A4、A5、A6，A2、A3的玻璃化率無顯著差異，A4、A5、A6的玻璃化率無顯著差異，其中A6的玻璃化率最低，為26．67%。由此表明，活性炭是影響植株玻璃化的因素之一，隨著活性炭濃度的增加，植株的玻璃化率逐漸降低，當(dāng)活性炭的濃度達(dá)到1．0 mg/L以上時，玻璃化率降低不顯著。因此，在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加活性炭可以有效減輕植株的玻璃化率。

表9 活性炭對玻璃化的影響Table 9Effects of activated carbon on vitrification of the Chirita tribracteata W．T．Wang

3 討論與結(jié)論

苦苣苔科植物的特征之一是葉片具有茸毛，這給外植體的消毒滅菌帶來極大的困難。本研究的幾種處理均未達(dá)到很好的消毒效果，原因之一可能是葉片帶茸毛從而影響了消毒效果，這與韋嘯［8］等看法是一致的。在前人的研究中，有采用70%乙醇滅菌30 s，0．1%HgCl2滅菌4 min對荔波唇柱苣苔進(jìn)行滅菌，外植體污染率30%，成活率為57%［2］，也有采用70%乙醇滅菌30 s后再用0．1%HgCl2表面消毒7 min，其污染率僅為26．7%，成活率達(dá)73．3%［8］，后者達(dá)到較高成活率的原因可能是其以花梗為外植體。本試驗選擇幼嫩葉片為外植體，是基于葉片取材容易，對母株傷害小為出發(fā)點，但有研究認(rèn)為唇柱苣苔屬其他植物以花梗作為外植體進(jìn)行離體快繁的效果好于幼葉［9］，甚至有將帶苞片的花蕾作為外植體進(jìn)行組培快繁的［10］。

植物組織培養(yǎng)中植株出現(xiàn)呈半透明狀、脆弱易破碎的現(xiàn)象稱為玻璃化［11］。發(fā)生玻璃化的植株所含葉綠素及蛋白質(zhì)含量低，不利于移栽成活，其原因可能與培養(yǎng)的環(huán)境條件有關(guān)，培養(yǎng)基水勢過高，培養(yǎng)容器相對濕度大，培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素濃度高所致。細(xì)胞分裂素濃度過高導(dǎo)致玻璃化的研究前人報道較多。對大苞短毛唇柱苣苔葉片進(jìn)行誘導(dǎo)時，當(dāng)TDZ濃度高于0．5 mg/L時，不定芽玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重［1］。趙佐敏［12］指出隨著6-BA濃度的增加，非洲菊外植體分化出的玻璃化苗比例呈遞增趨勢，此結(jié)論在香石竹［13］等的組培中也得到驗證?，F(xiàn)有的研究表明，苦苣苔科植物的組織培養(yǎng)中發(fā)生玻璃化頻率高。在本研究中，玻璃化的現(xiàn)象嚴(yán)重，通過實驗發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中不添加6-BA或適當(dāng)添加低濃度的6-BA可以有效緩解玻璃化現(xiàn)象，這與黃素梅［9］的研究結(jié)果是一致的。玻璃苗發(fā)生的百分率隨6-BA濃度的增加而增加。此外，在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加活性炭也可以減輕植株的玻璃化。

本試驗以葉片為外植體，成功建立了三苞唇柱苣苔的立體培養(yǎng)體系，外植體的滅菌方法可采用乙醇浸泡10 s結(jié)合升汞浸泡菌12～16 s;葉片的最佳愈傷組織誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2．0 mg/L +NAA 0．1 mg/L，愈傷誘導(dǎo)率為96．67%，愈傷分化率為96．67%;繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1．0 mg/L+IBA 0．1～0．5 mg/L或者M(jìn)S+6-BA 1．0 mg/L+NAA 0．1～0．5 mg/L;最佳生根培養(yǎng)基為1/ 2MS+IBA 0．1～0．3 mg/L，生根率為100．00%;培養(yǎng)基中不添加6-BA或添加低濃度的6-BA或者添加適量活性炭均可減輕植株的玻璃化。

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(責(zé)任編輯 王冠玉)

Study on in Vitro Propagation Technology of Chirita tribracteata W．T．Wang

LIN Mao，LI Jin-hua，TANG Qing，LIAO Mei-lan，WANG Hua-xin，LONG Ding-jian*
(Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute，Guangxi Nanning 530002，China)

The leaves of Chirita tribracteata W．T．Wang were used as material，and the disinfectant method，callus induction，callus differentiation，proliferation subculture，rooting culture and vitrification of plant were studied．The results showed that the disinfectant method was 75%ethanol for 10s with 0．1%HgCl2for 12－16 min．The suitable medium of callus inducing and differentiation from leaves was MS+6-BA 2．0 mg/L+NAA 0．1 mg/L，the suitable medium of proliferation culture was MS+6-BA 1．0 mg/L+IBA 0．1－0．5 mg/L or MS+6-BA 1．0 mg/L+NAA 0．1－0．5 mg/L;the optimum medium for rooting was 1/2MS+IBA 0．1－0．3 mg/L，rooting rate was 100．00%．The vitrification of the plant could be reduced by adding 6-BA or adding low concentration 6-BA or adding the appropriate amount of activated carbon in the medium．

Chirita tribracteata W．T．Wang;In vitro;Vitrification

S543

A

1001－4829(2017)1－0199－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．034

2016－08－21

國家林業(yè)局部門預(yù)算廣西項目(桂林護(hù)預(yù)2015007);廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目(林科201405號)

林茂(1980－)，男，廣西來賓人，工程師，主要從事花卉栽培、遺傳育種以及園林工程研究，E-mail:49888178@qq．com，*為通訊作者，E-mail:1805507895@qq．com。