吳晨　趙曉東　宦冉　孫麗娟　單潔　李亞

【摘 要】目的：研究慢性應(yīng)激后小鼠海馬和前腦皮層BDNF表達的變化，探討小鼠學(xué)習(xí)記憶功能變化的機制。方法：建立多因素慢性應(yīng)激小鼠模型，通過Morris水迷宮檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠海馬和前腦皮層BDNF表達水平的時序變化。結(jié)果：與對照組小鼠比較，慢性應(yīng)激后即刻和24h組小鼠在水迷宮中的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退（P<0.05， P<0.01），海馬CA1、CA3、DG和前腦皮層BDNF的表達明顯減少（P<0.05，P<0.01）；而慢性應(yīng)激后一周組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有部分恢復(fù)，海馬各區(qū)和前腦皮層BDNF的表達亦有所增加，無顯著性差異。結(jié)論：BDNF在海馬和前腦皮層表達的下調(diào)，可能與慢性應(yīng)激后小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的損傷有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】慢性應(yīng)激；學(xué)習(xí)記憶；BDNF；海馬；前腦皮層

【Abstract】Objective：To explore the mechanism of learning-memory function alteration in mice after chronic stress， and the expressions of brain derived neurotrophic factor（BDNF） of prefrontal cortex （PFC） and hippocampus （HP） in mice.Methods：The chronic stress mice model was established by using multiple chronic unpredictable stressors.The abilities of learning-memory were measured using Morris water maze task.The expression of BDNF in PFC and HP were tested by immunohistochemical method.Result：The spatial learning-memory function in mice were significantly decreased （P<0.05， P<0.01） in immediately and 24h after stress groups， compared with control group mice.Meanwhile，the expression of BDNF in the CA1，CA3，DG of HP and PFC were significantly reduced （P<0.05，P<0.01）.A week after stress， the spatial learning-memory function in mice was partly enhanced，the expression of BDNF in HP and PFC were partly increased，and there was no significant difference.Conclusion：The impairment of learning-memory function induced by chronic stress in mice，which may be nearly associated with the down-regulated expression of BDNF.

【Key words】Chronic stress；Learning and memory；BDNF；Hippocampus；Prefrontal cortex

研究證實，長期的慢性應(yīng)激狀態(tài)，可引起機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，腦內(nèi)出現(xiàn)產(chǎn)生廣泛的神經(jīng)化學(xué)及形態(tài)學(xué)改變，動物的行為和學(xué)習(xí)記憶功能明顯減退[1]。已有許多研究報道，海馬和前額葉皮層是學(xué)習(xí)記憶信息儲存和整合的關(guān)鍵腦區(qū)，并且在機體應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控中也具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可引起海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和丟失、亦可引起前額葉皮層體積變小、樹突萎縮及神經(jīng)元丟失等變化[2]，進而影響海馬和前額葉皮層的功能。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員之一。研究報道，BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最廣、含量最高的神經(jīng)營養(yǎng)因子，特別是海馬、杏仁核、紋狀體和皮層等部位都有豐富的表達，對神經(jīng)細胞具有營養(yǎng)、支持和保護作用。BDNF可增強動物腦內(nèi)神經(jīng)細胞間的突觸聯(lián)系，從而使學(xué)習(xí)記憶功能增強[3]。本研究建立多因素慢性應(yīng)激動物模型，檢測慢性應(yīng)激后小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化，并且測定小鼠海馬和前腦皮層神經(jīng)元BDNF表達的動態(tài)變化，探討B(tài)DNF在慢性應(yīng)激所致小鼠學(xué)習(xí)記憶功能變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

昆明種3月齡健康小白鼠，SPF級，體重22±2g，雌雄各半，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）20140007。實驗小鼠在實驗室適應(yīng)一周。自由飲水進食。隨機分為對照組和慢性應(yīng)激組。

1.2 慢性應(yīng)激動物模型制備

慢性應(yīng)激組小鼠采用7種不同應(yīng)激源，實驗周期28天。為高臺（高1.6m，直徑0.05m，1h/次）、足底電擊（電壓36V，15秒/次，每次間隔1分鐘，共30次）、通宵照明（10h）、冰水游泳（8oC冷水中游泳，3min）、禁食（36h）、禁水（24h）、斜籠擁擠（36h）。每天隨機給予一種刺激；對照組小鼠在相同飼養(yǎng)環(huán)境中正常飼養(yǎng)，不接受任何實驗應(yīng)激源刺激。在慢性應(yīng)激后即刻、應(yīng)激后24h及一周進行水迷宮實驗和BDNF檢測。

1.3 Morris水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶能力

采用Morris水迷宮進行兩組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力檢測。Morris 水迷宮為一圓形水池（直徑80cm，高50cm），水溫控制在25±1℃。水迷宮被均等分為四個象限，在第一象限（目標(biāo)象限）水面下1cm放置一塑料平臺，在其對面第三象限池壁中間位置放置一明顯標(biāo)記物。測試程序包括定位航行和空間搜索兩部分。檢測歷時3天，其中前2天為定位航行，將小鼠分別從水迷宮的四個象限中心位置面向池壁輕輕放入水中，記錄小鼠找到平臺所需要的時間，即逃避潛伏期（Escape latency）。第3天為空間搜索試驗，撤掉平臺，將小鼠在第三象限池壁的中心點放入水中，記錄小鼠在各個象限的游泳時間，總時間上限為120s。檢測小鼠對平臺（目標(biāo)象限）的記憶能力。

1.4 小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達

小鼠腹腔注射0.4%的戊巴比妥鈉麻醉，暴露心臟，經(jīng)心先灌注生理鹽水，再以事先冰上預(yù)冷的多聚甲醛溶液（4%）灌注，完整取腦；置于固定液中后固定，梯度酒精脫水、透明和石蠟包埋，對腦組織進行連續(xù)冠狀切片（片厚5μm）。采用SABC（鏈霉素過氧化復(fù)合物）免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色劑進行免疫組化染色，BDNF多克隆抗體，購于武漢博士德生物工程有限公司。以PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作陰性對照。采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析處理系統(tǒng)，分析計算海馬CA1、CA3區(qū)、齒狀回（DG）和前腦皮層（PFC）BDNF陽性神經(jīng)元的數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準差（M±s）來表示，逃避潛伏期采用重復(fù)測量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳時間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較以LSD法分析。其他數(shù)據(jù)組間比較用非配對t 檢驗分析。P<0.05 時說明有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 慢性應(yīng)激后小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的變化

統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示（表1），在定位航行中，兩組小鼠隨訓(xùn)練周期其逃避潛伏期均顯著降低（對照組F=9.638，P<0.01；應(yīng)激后即刻F= 6.366，P<0.01）。與對照組比較，應(yīng)激后即刻、24h和應(yīng)激后一周小鼠的逃避潛伏期均長于對照組小鼠（P<0.05，P<0.01）。

2.2 慢性應(yīng)激后小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達

小鼠免疫組化結(jié)果（表3），與對照組比較，在應(yīng)激后即刻應(yīng)激組小鼠PFC和海馬CA1、CA3、DG區(qū)BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著減少（P<0.05，P<0.01）；在應(yīng)激后24h，僅在PFC和海馬CA1、DG區(qū)BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少（P<0.05）；而應(yīng)激后一周則無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激后小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達減少，應(yīng)激后一周有部分恢復(fù)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激能夠在一定程度上損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。有研究報道，多因素的慢性應(yīng)激可引起前額葉皮層和海馬的選擇性損傷，從而導(dǎo)致動物學(xué)習(xí)記憶障礙、癡呆、抑郁等[1]。已經(jīng)明確，海馬和前額葉皮層功能最復(fù)雜的腦區(qū)之一，在空間學(xué)習(xí)記憶、情緒、工作記憶以及行為計劃和組織等方面具有重要作用，同時也是參與應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)。慢性應(yīng)激后，可引起海馬神經(jīng)元突觸可塑性發(fā)生改變，空間學(xué)習(xí)記憶損傷[4]。研究報道，在不同應(yīng)激刺激狀態(tài)下，可引起動物的工作記憶功能明顯受損[5]。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員。有研究報道，BDNF能維持成熟神經(jīng)細胞的生存、生長、分化和凋亡，促進神經(jīng)細胞的修復(fù)和再生[6]，增加神經(jīng)細胞間的突觸聯(lián)系，能有效防止神經(jīng)元的變性及死亡[7]。研究表明，BDNF廣泛參與動物的學(xué)習(xí)記憶等認知功能，在神經(jīng)元可塑性的調(diào)控中具有重要作用[3]。研究報道，BDNF mRNA高表達區(qū)在海馬、上丘和內(nèi)側(cè)前額葉皮層，并且在海馬內(nèi)其表達量最豐富[8]。本實驗室早先的研究顯示，慢性應(yīng)激后，小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為以及空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低，并且海馬各區(qū)及前腦皮層BDNF表達降低[9]。在本研究中，慢性應(yīng)激引起小鼠水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，腦內(nèi)海馬各區(qū)和前腦皮層BDNF的表達顯著降低，但慢性應(yīng)激后各項指標(biāo)有部分恢復(fù)。結(jié)果提示，海馬及前腦皮層神經(jīng)元BDNF表達的下調(diào)，可能參與了慢性應(yīng)激后小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的損傷機制。

【參考文獻】

[1]Lupien SJ，McEwen BS，Gunnar MR， et al.Effects of stress throughout the lifespan on the brain，behaviour and cognition[J].Nat Rev Neurosci，2009，10（6）： 434-445.

[2]Cerqueira JJ，Pego JM，Taipa R，et al.Morphological correlates of corticosteroid-induced changes in prefrontal cortex-dependent behaviors[J].J Neurosci，2005，25 （34）：7792-7800.

[3]Bekinschtein P，Cammarota M，Izquierdo I，et al.Reviews：BDNF and memory formation and storage[J].Neuroscientist，2008，14（2）：147-156.

[4]Hill M N，Hunter R G，McEwen B S.Chronic stress differentially regulates cannabinoid CB1 receptor binding in distinct hippocampal subfields[J].Europ J Pharmacol，2009，614（1-3）：66-69.

[5]Arnsten AF.Stress signalling pathways that impair prefrontal cortex structure and function[J].Nat Rev Neurosci，2009，10（6）：410-422.

[6]Greenberg ME，Xu BJ，Lu B，et al.New insights in the biology of BDNF synthesis and release：Implications in CNS function[J].J Neurosci，2009，29（41）：12764-12767.

[7]Roceri M，Cirulli F，Pessina C，et al.Postnatal repeated maternal deprivation produces age-dependent changes of brain-derived neurotrophic factor expression in selected rat brain regions[J].Biol Psychiatry，2004，55：708-714.

[8]Peters J，Dieppa-Perea LM，Melendez LM，et al.Induction of fear extinction with hippocampal- infralimbic BDNF[J].Science，2010，328（5983）：1288-1290.

[9]徐蕓，孔宏，宋倩，等.慢性應(yīng)激對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及海馬和前額葉皮層BDNF表達的影響[J].曲阜師范大學(xué)學(xué)報，2009，35：85-89.

[責(zé)任編輯：田吉捷]