姜 華， 李燕超， 姜 一

(1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081； 2.天津出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢測中心，天津 300456)

蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌多樣性的季節(jié)變化

姜 華1， 李燕超1， 姜 一2

(1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081； 2.天津出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢測中心，天津 300456)

以稀釋平板法和形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定法對蘆葦(Phragmitesaustralis)進(jìn)行了根際土壤可培養(yǎng)真菌的分離鑒定及季節(jié)變化對其種群結(jié)構(gòu)影響的分析.結(jié)果表明：春、夏、秋、冬四季蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌菌落總數(shù)分別是5 243、5 003、6 388和4 970，種類數(shù)分別為9屬21種、8屬18種、11屬22種和6屬21種；真菌的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)值,從大到小的次序均為秋>春>夏>冬，而均勻度指數(shù)為春>夏>冬>秋，多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)在秋季表現(xiàn)最高，但數(shù)值波動較大，均勻度指數(shù)差別較小.蘆葦根際土壤中的真菌資源豐富，共分離出15 屬54 種真菌，優(yōu)勢屬為曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、擬青霉屬(Paecilomyces)、木霉屬(Trichoderma)和鏈格孢屬(Alternaria)；金孢屬(Chrysosporium)、伏革菌屬(Corticium)、粘帚霉屬(Gliocladium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)和根霉屬(Rhizopus)是無植被土壤中沒有的菌屬.蘆葦對土壤真菌多樣性具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，其根際土壤真菌的種類是無植被土壤的1.2倍，數(shù)量是無植被土壤的4倍.

蘆葦；根際土壤；真菌多樣性

蘆葦(Phragmitesaustralis)屬于禾本科(Gramineae)蘆葦屬(PhragmitesAdans)多年生草本植物，主要生長于溫帶和熱帶地區(qū)，世界各地分布廣泛，我國主要分布在東北、內(nèi)蒙古、新疆和華北等地.蘆葦是造紙及建材原料，被譽(yù)為“第二森林”，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值；根可入藥，有解毒、利尿、清涼、鎮(zhèn)嘔等藥用功能；也具有重要的生態(tài)價值，能涵養(yǎng)水源、調(diào)節(jié)氣候，保護(hù)濕地生態(tài)環(huán)境，抗逆性強(qiáng)、生態(tài)幅廣，可在湖濱、池塘、沼澤、河岸、灘涂、河口等淺水濕地形成密集的單優(yōu)群落，甚至在荒漠、鹽堿地也廣泛分布[1-3].土壤微生物影響著礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收與釋放、土壤有機(jī)質(zhì)的分解、碳、氮循環(huán)和成土過程[4].豐富多樣的微生物群落是保持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要因素，其數(shù)量與分布在一定程度上反映了土壤肥力狀況.因此，研究和保護(hù)土壤微生物多樣性對保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義.鑒于蘆葦?shù)纳鷳B(tài)及經(jīng)濟(jì)價值，前人對此曾進(jìn)行了蘆葦耐鹽基因的研究[5]、蘆葦對重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)功能研究[6]，以及蘆葦病蟲害防治、蘆葦資源及分布與生長狀況調(diào)查、蘆葦對環(huán)境保護(hù)及污水處理、蘆葦?shù)纳砑吧鷳B(tài)結(jié)構(gòu)、蘆葦資源的開發(fā)利用、蘆葦加工設(shè)備等研究[7]，但有關(guān)蘆葦微生物等方面的研究報道較少.本文旨為查明蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌的種群構(gòu)成，以及它們對季節(jié)變化的響應(yīng)，為蘆葦資源養(yǎng)護(hù)及污染土壤的蘆葦-微生物修復(fù)提供理論依據(jù)及優(yōu)勢菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 蘆葦(P. australis)采自遼寧省大連市甘井子區(qū)營城子鎮(zhèn)鹽場.

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 采用虎紅固體培養(yǎng)基進(jìn)行真菌分離，馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)進(jìn)行真菌純化；DNA Marker(DL2000)、dNTP、Taq DNA 聚合酶、buffer等均購自大連TaKaRa 公司；引物合成、DNA測序由上海生工生物工程公司完成；所需試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 土樣的采集 采樣地位于遼寧省大連市甘井子區(qū)營城子鎮(zhèn)鹽場.該區(qū)除了大面積的蘆葦外，還有遼寧堿蓬等植物.分別于2015年的春(5 月9日)、夏(7 月9日)、秋(9月8日)、冬(12月14日)四季，采用五點采樣法，采集深10 cm左右的根系上的土壤(以無植被土壤為對照)[8]，3次重復(fù).

1.2.2 真菌的分離純化與計數(shù) 土樣進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，以涂布平板法接種土樣稀釋液.用移液槍吸取200 μL的10-4～10-2土壤稀釋液于虎紅(孟加拉紅)平板上，涂布，3次重復(fù).培養(yǎng)3～5 d 后進(jìn)行真菌菌落計數(shù)[8]，再以PDA培養(yǎng)基進(jìn)行真菌的純化.

1.2.3 真菌鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定：依據(jù)菌落和個體形態(tài)特征，參照真菌分類鑒定指標(biāo)進(jìn)行[9].

(2)分子生物學(xué)鑒定：對于難以產(chǎn)生分生孢子、以形態(tài)學(xué)特征難以確認(rèn)的可疑菌株進(jìn)行分子鑒定[10].提取菌株DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度；使用真菌通用引物ITS1和ITS4，進(jìn)行菌株rDNA-ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增；PCR 純化產(chǎn)物委托生物公司進(jìn)行DNA序列測定，測序結(jié)果在 NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST序列比對和同源性分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株種類.

1.2.4 統(tǒng)計分析[8]

(1)分離頻率

分離頻率(%)= 某一真菌分離物的總數(shù)(株)/所有分離物的總數(shù)(株)×100%.

(2)真菌種群多樣性：采用Shannon多樣性指數(shù)(H′)、Pielou均勻度(J)指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)(R)來測定.公式為

H′=-∑PilnPii=1,2…n；J=H′/ln(S)；R=(S-1)/lnN.

式中：Pi為第i種的個體數(shù)占總個體數(shù)的比例，可用Pi=Ni/N求出；Ni為第i種物體個體數(shù)，N為總個體數(shù)，S為每個樣品的物種總數(shù).

(3)Jaccard相似性指數(shù)：是用來比較2個樣本之間真菌種類組成的相似程度，公式為：Cj=c/(a+b-c).當(dāng)Cj為0.00～0.25時，為極不相似；當(dāng)Cj為0.25～0.50時，為中等不相似；當(dāng)Cj為0.50～0.75時，為中等相似；當(dāng)Cj為0.75～1.00時，為極相似.

2 結(jié)果及分析

2.1 蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌種群構(gòu)成對季節(jié)的響應(yīng)

于春、夏、秋、冬4個季節(jié)采樣，檢測蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌菌落總數(shù)，其結(jié)果分別為5 243、5 003、6 388和4 970；真菌種類數(shù)分別為9屬21種、8屬18種、11屬22種和6屬21種；共分離鑒定出15屬54種真菌.4個季節(jié)的蘆葦根際土壤中，分離出的真菌種類數(shù)量依次是秋季>春季>冬季>夏季，秋季種類數(shù)量最多、夏季最少，且四季的優(yōu)勢菌屬也略有不同.春季的9個屬分別是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、擬青霉屬(Paecilomyces)、木霉屬(Trichoderma)、毛殼屬(Chaetomium)、帚霉屬(Scopulariopsis)、金孢屬(Chrysosporium)、毛霉屬(Mucor)和鐮孢屬(Fusarium)；優(yōu)勢屬為青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和擬青霉屬(Paecilomyces).夏季8個屬分別有木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、鏈格孢屬(Alternaria)、青霉屬(Penicillium)、毛霉屬(Mucor)、伏革菌屬(Corticium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和鐮孢屬(Fusarium)；優(yōu)勢屬為木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和鏈格孢屬(Alternaria).秋季11屬包括木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、粘帚霉屬(Gliocladium)、根霉屬(Rhizopus)、枝孢屬(Cladosporium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、毛霉屬(Mucor)、毛殼屬(Chaetomium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和鐮孢屬(Fusarium)；優(yōu)勢屬為木霉屬 (Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium).冬季6屬包括木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、鐮孢屬(Fusarium)和帚霉屬(Scopulariopsis)；優(yōu)勢屬為木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus).結(jié)果見表1.

表1 季節(jié)對蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量及種群構(gòu)成的影響

在春、夏、秋、冬4個季節(jié)中，蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌的Shannon多樣性指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù),從大到小的次序排列為秋季>春季>夏季>冬季，而Pielou均勻度指數(shù)則不同，為春季>夏季>冬季>秋季；Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)在秋季均為最高，而均勻度指數(shù)則是春季最高，并且在4個季節(jié)中，多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)的數(shù)值波動較大，均勻度指數(shù)相對差異較小且秋季和冬季的數(shù)值相近.說明季節(jié)對蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)影響較大、對均勻度指數(shù)影響較小.比較4個季節(jié)可培養(yǎng)真菌種類的相似性指數(shù)，可得出相似性指數(shù)(Cj)值春季和夏季為 0.545 5、春季和秋季為 0.538 5、春季和冬季為0.500 0、夏季和秋季為 0.461 5、夏季和冬季為0.400 0、秋季和冬季為0.307 7，其中，春季與夏季和秋季為中等相似，其他季節(jié)為中等不相似(見表2).

表2 季節(jié)對蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌種群多樣性指數(shù)的影響

2.2 蘆葦對土壤可培養(yǎng)真菌多樣性保護(hù)作用的分析

表3為不同季節(jié)下的無植被土壤中的可培養(yǎng)真菌種群構(gòu)成及數(shù)量.對比蘆葦根際土壤和無植被土壤真菌種群構(gòu)成可知，蘆葦根際土壤含有伏革菌屬、粘帚霉屬、踝節(jié)菌屬、金孢屬和根霉屬等真菌，它們是無植被土壤中沒有的菌屬；而無植被土壤中也含有一些蘆葦根際土壤中沒有的菌屬：枝頂孢屬、散孢菌屬和白僵菌屬.對比表1和表3可知，蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌種類是無植被土壤的1.2倍，數(shù)量是無植被土壤的4.0倍.蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌與無植被土壤可培養(yǎng)真菌多樣性指數(shù)(H′)的R/S值為1.03～2.20，均勻度指數(shù)的R/S值為0.93～1.20；蘆葦根際土壤可培養(yǎng)真菌的多樣性指數(shù)高于無植被土壤，但均勻度指數(shù)與無植被土壤的相似.2種土壤所含的真菌種類差異性較大，且種群構(gòu)成也不同(見表4).因此，蘆葦根際土壤相對于無植被土壤具有豐富的真菌資源，蘆葦對土壤真菌多樣性的保護(hù)具有重要作用.

表3 季節(jié)對無植被土壤可培養(yǎng)真菌種群構(gòu)成及數(shù)量的影響

表4 蘆葦根際土壤與無植被土壤中的可培養(yǎng)真菌多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)的比較

注：R/S為根際土壤/無植被土壤的數(shù)值比

3 討 論

本課題組前期研究得知[11]，蘆葦內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬為鐮孢菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)和鏈格孢屬(Alternaria)，而本文研究的蘆葦根際土壤真菌的優(yōu)勢屬有鏈格孢屬(Alternaria)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、擬青霉屬(Paecilomyces)和木霉屬(Trichoderma).可見蘆葦內(nèi)生真菌種類和根際土壤真菌種類相似，但根際土壤中真菌種類的多樣性較高.本課題組成員邵璐等人[8]曾對生長于同一地域的遼寧堿蓬根際土壤真菌多樣性進(jìn)行過研究，查明了遼寧堿蓬根際土壤真菌的優(yōu)勢屬有青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、木霉屬(Trichoderma)、 曲霉屬(Aspergillus)和鐮孢屬(Fusarium)；本文采集的蘆葦根際土樣與遼寧堿蓬根際土樣來自于同一采樣區(qū)，2種植物的根際是否有它們獨特的菌種資源，本文予以查明.對比蘆葦和遼寧堿蓬根際土壤中的真菌種類，優(yōu)勢菌屬都有青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和木霉屬(Trichoderma)；無植被土壤中也含有這些菌屬，說明這些菌屬對環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，受生態(tài)條件影響較小，是土壤中重要的優(yōu)勢種群[12].蘆葦不同于遼寧堿蓬的菌屬有帚霉屬(Scopulariopsis)、粘帚霉屬(Gliocladium)、毛殼屬(Chaetomium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、伏革菌屬(Corticium)、根霉屬(Rhizopus)和金孢屬(Chrysosporium)；本研究還查明了蘆葦根際土壤中的真菌種類資源豐富，其中金孢屬、伏革菌屬、粘帚霉屬、踝節(jié)菌屬和根霉屬是無植被土壤中沒有的菌屬.

蘆葦?shù)目鼓嫘暂^強(qiáng)，素有“禾草森林”之稱[13]，是構(gòu)建人工濕地、修復(fù)污染土壤的常用植物[14].蘆葦?shù)男迯?fù)是以根際效應(yīng)為主，其根際恰當(dāng)?shù)奈⑸镱惾簽橥寥牢廴疚锝到馓峁┝擞辛Φ谋Ｕ蟍8].本研究從蘆葦根際土壤中分離出了15 屬54 種真菌，說明了真菌資源的多樣性和豐富性.在蘆葦根系分泌物滋養(yǎng)下，一定孕育著豐富的、有經(jīng)濟(jì)價值的微生物種類資源，期望今后能從中篩選到更多的真菌、細(xì)菌、放線菌等有益菌種，為蘆葦生境的養(yǎng)護(hù)及以蘆葦-微生物修復(fù)被污染土壤提供理論依據(jù)及有益菌株.Ma Fang等人[14]曾以變性梯度凝膠電泳(DGGE)法研究了濕地蘆葦根際的微生物群落特征，證明了微生物在蘆葦根際的恒常性和可變性與濕地生態(tài)系統(tǒng)的時空變化有關(guān)，根際的微生物群落似乎在很大程度上受營養(yǎng)生長期的影響.本文對蘆葦根際土壤中可培養(yǎng)的真菌進(jìn)行了檢測及季節(jié)對其多樣性的影響分析，其結(jié)果也說明了蘆葦根際土壤中的可培養(yǎng)真菌數(shù)量及種類受季節(jié)即營養(yǎng)生長期的影響較大.

[1] CHAMBERS R M，MCYERSON L A，SALTONATALL K.Expansion ofPhragmitesaustralisinto tidal wetlands of north America[J].Aquatic Botany，1999，64(3/4):261-273.

[2] ZHU X Y，WANG S M，ZHANG C L.Responses of different ecotypes of reed growing in the Hexi Corridor to natural drought and salinity[J].Plant Physiology Communications，2003，39(4):371-376.

[3] LI J G，LI G B，LIU F，et al.Reed resource and its ecological function and utilization in Baiyangdian Lake[J].South-to-North Water Transfers and Water.Science and Technology，2004，2(5):37-40.

[4] RUTIGLIANO F A,ASCOLI R D,VIRZO DE SANTO A.Soil microbial metabolism and nutrient status in a Mediterranean area affected by plant cover[J].Soil Biology & Biochemistry,2004,36(11):1719-1729.

[5] HOLMES G D,HALL N E, GENDALL A R, et al.Using transcriptomics to identify differential gene expression in response to salinity among AustralianPhragmitesaustralisclones[J].Frontiers in Plant Science,2016,6(7)：1-12.

[6] FENG H,QIAN Y, GALLAGHER F J, et al.Synchrotron micro-scale measurement of metal distributions inPhragmitesaustralisandTyphalatifoliaroot tissue from an urban brownfield site[J].Journal of Environmental Sciences,2016,41(3):172-182.

[7] 王振慶，王麗娜，吳大千，等．中國蘆葦研究現(xiàn)狀與趨勢[J]．山東林業(yè)科技，2006(6)：85-87，74.

[8] 邵璐，姜華．遼寧堿蓬根際土壤真菌多樣性的季節(jié)變化及其耐鹽性[J]．生態(tài)學(xué)報，2016，36(4):1050-1057．

[9] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979:495-496,501.

[10] 姜華，楊策，石鑫.大連市銀杏葉斑病病原菌鑒定[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2014，37(3)：396-401.

[11] 葉馨，陸蕾，叢珊，等.蘆葦內(nèi)生真菌的多樣性分析[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016(1)：5-8.

[12] BOSSIO D A,SCOW K M,GUNAPALA N，et al.Determinants of soil microbial communities:effects of agricultural management,season and soil type on phospholipids fatty acis profiles[J].Microbial Ecology, 1998,36(1):1-12.

[13] 吳潔婷.濕生蘆葦根際微生物群落結(jié)構(gòu)與功能研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2011.

[14] MA F,WU J T,WANG L,et al.Characterization of the microbial community in the Rhizosphere ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin ex.Steudel growing in the Sun Island Wetland[J].Water Environment Research,2014,86(3):258-268.

[15] 莊瑤，孫一香，王中生，等.蘆葦生態(tài)型研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報,2010，30(8):2173-2181.

Seasonal variation of soil fungal diversity in the rhizosphere ofPhragmitesaustralis

JIANGHua1,LIYanchao1,JIANGYi2

(1.College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China；2.Animal & Plant & Foodstuffs Inspection Center, Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Tianjin 300456， China)

In this paper, rhizosphere soil fungis were isolated and identified by using dilution-plate method, morphological analysis and molecular biology identification method, and the effect of season on fungi were analyzed. The results show that in spring, summer, autumn and winter, the number of fungal colonies involved in the rhizosphere soil is 5 243,5 003,6 388 and 4 970 respectively. They belong to 9 genera 21 species, 8 genera 18 species, 11 genera 22 species and 6 genera 21 species, respectively, totally there were 54 genera and 15 species of fungi isolated.The dominant genera areAspergillus,Penicillium,Paecilomyces,Trichoderma, andAlternaria.The Shannon diversity index and richness index of rhizosphere fungi from different seasons were ranked as autumn>spring>summer>winter,while the evenness index was spring>summer>winter>autumn. It can be seen that the diversity and richness index showed the highest performance in autumn, but the numerical value fluctuated greatly, and the evenness index showed a little difference.P. australis fungi resources are abundant in rhizosphere soil.Among them,Chrysosporium,Corticium,Gliocladium,TalaromycesandRhizopusare the genera which can not be found in the non-vegetation soil;The total species ofP. australis rhizosphere fungi is 1.2 times than those without vegetation covering,and the quantity is 4 times of non-vegetation soil.P. australis plays an important role in the protection of soil fungal diversity.

Phragmitesaustralis;rhizosphere soil;fungal diversity

2016-11-25 作者簡介：姜華(1959-),女，黑龍江富裕人，遼寧師范大學(xué)教授，博士.

1000-1735(2017)01-0089-06

10.11679/lsxblk2017010089

S763.15

A