苗陽陽，周彤，師尚禮，康文娟,張運(yùn)婷(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅 蘭州730070)

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硼對根瘤菌在紫花苜蓿體內(nèi)運(yùn)移和定殖及對幼苗生長的影響

苗陽陽，周彤，師尚禮*，康文娟,張運(yùn)婷
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅 蘭州730070)

通過向青色熒光蛋白(CFP)標(biāo)記的兩種根瘤菌菌液EnsifermelilotiLZgn5f (gn5f) 和Ensifermeliloti12531f (12531f)內(nèi)添加不同濃度硼并接種于苜蓿幼苗根部，研究硼對熒光標(biāo)記根瘤菌在甘農(nóng)5號紫花苜蓿幼苗體內(nèi)運(yùn)移和定殖的動態(tài)變化及接種對苜蓿幼苗生長的影響。結(jié)果表明，添加1 mg/L硼較利于12531f生長， 100 mg/L硼較利于gn5f生長。添加適宜濃度硼對苜蓿幼苗體內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌運(yùn)移和定殖具有促進(jìn)作用，兩種熒光標(biāo)記根瘤菌在根部定殖數(shù)量較多，其中添加100 mg/L硼15 d時根部12531f數(shù)量最高，達(dá)2184.99 cfu/g，添加0.5 mg/L硼60 d時gn5f數(shù)量最高，達(dá)58307.11 cfu/g；同時可向地上運(yùn)移，主要運(yùn)移并定殖于下部莖葉內(nèi)，1 mg/L硼利于12531f在下部莖葉內(nèi)定殖，100 mg/L硼利于gn5f在下部莖內(nèi)定殖。對照各部位未檢測到兩種熒光標(biāo)記根瘤菌。添加硼處理的單株結(jié)瘤數(shù)、單株根瘤重、單株葉片數(shù)、株高、根長、地上鮮重、地上干重、根鮮重和根干重均高出對照和單獨(dú)接菌處理，1 mg/L硼+12531f處理高出對照和單獨(dú)接菌處理，范圍在21.31%～909.28%之間；100 mg/L硼+gn5f處理高出對照和單獨(dú)接菌處理，范圍在15.07%～1424.24%之間；雖然單獨(dú)接種12531f抑制了葉綠素的形成，但添加1 mg/L硼后其含量則升高，分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理18.31%和36.86%(P<0.05)，而接種gn5f則促進(jìn)了葉綠素的合成，添加100 mg/L硼后含量分別顯著高出對照和單獨(dú)接種處理24.41%和12.92%(P<0.05)。因此，1 mg/L硼與12531f混合接種，100 mg/L硼與gn5f混合接種對根瘤菌在苜蓿幼苗體內(nèi)運(yùn)移和定殖及對幼苗的生長具有促進(jìn)作用，為苜蓿種植提供了依據(jù)。

熒光標(biāo)記根瘤菌；硼；紫花苜蓿；運(yùn)移和定殖；促生效應(yīng)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，以其耐干旱、耐貧瘠、品質(zhì)好、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特性被譽(yù)為“牧草之王”[1]。適量施用化肥可提高苜蓿產(chǎn)量，改善品質(zhì)，但長期施用會使環(huán)境污染，土壤條件惡化，并對生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害[2]。根瘤菌可與豆科植物共生形成根瘤，并在植物根部結(jié)瘤固氮，將大氣中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的有機(jī)氮，還可以內(nèi)生菌的形式存在于植物組織中形成特殊的微生境[3]。已有的研究表明，苜蓿接種根瘤菌可促進(jìn)結(jié)瘤，提高固氮能力，是提高產(chǎn)量和品質(zhì)的重要措施[4-5]。苜蓿播種時進(jìn)行根瘤菌接種已在美國、加拿大和澳大利亞等國家普遍使用[6-8]，主要的接種方法為施用根瘤菌菌劑拌種或包衣種子，但接種效果并不穩(wěn)定[9]，作物種類與根瘤菌種類及外在特殊的自然環(huán)境、接種方法與土著根瘤菌的競爭及多種生物與非生物的脅迫均可影響接種根瘤菌的結(jié)瘤能力，使部分根瘤菌難以高效地與豆科植物結(jié)瘤固氮，難以達(dá)到應(yīng)有的增產(chǎn)效果[10-11]。因此如何提高根瘤菌的接種效果對苜蓿生產(chǎn)具有重要意義。

大量微生物可以定殖于植物根際，有些還可以內(nèi)生菌的形式定殖于植物體內(nèi)并進(jìn)行大量繁殖[12-13]。根瘤菌能否成功侵染植物根部成為根瘤菌劑接種效果的一個主要因素。而與外源菌相比，內(nèi)生菌在競爭結(jié)瘤方面有明顯優(yōu)勢，因此在豆科植物高成本的接種背景下對內(nèi)生菌的研究就具有較強(qiáng)的理論與實(shí)踐意義。近年來，已有大量關(guān)于健康植物組織內(nèi)生菌的分離、鑒定及定殖過程的研究[14-15]，且發(fā)現(xiàn)具有抗病蟲害、促進(jìn)植物生長、提高固氮能力的作用[14-18]。已發(fā)現(xiàn)內(nèi)生根瘤菌可定殖于苜蓿、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)等植物體內(nèi)[19-21]，但內(nèi)生根瘤菌在種子及植株體內(nèi)的分布不是恒定的，會受土壤養(yǎng)分、溫度、水分及田間管理、種子保存時間、供試植物材料、菌株遺傳特性等因素影響[11,21-24]。有關(guān)內(nèi)生根瘤菌在植物體內(nèi)的運(yùn)移途徑、動態(tài)變化、定殖部位及對種子和植物組織內(nèi)微生物群落影響的研究較少。陳丹明等[25]首次發(fā)現(xiàn)苜蓿種子內(nèi)攜帶有根瘤菌。李劍峰等[21-22]和張淑卿[23]發(fā)現(xiàn)苜蓿內(nèi)生根瘤菌主要存在于根系的毛根，同時大量存在于與種子形成的有關(guān)部位。在苜蓿芽苗、幼苗及田間營養(yǎng)生長階段，苜蓿各組織內(nèi)均有內(nèi)生根瘤菌的存在，但因侵染宿主根部后向地上部位遷移時會遇到阻礙或屏障導(dǎo)致定殖數(shù)量減少。通過添加LaCl3、生長素(IAA)、胞外多糖等外源物質(zhì)可以減弱根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運(yùn)移與定殖時遇到的防御反應(yīng)，從而提高了根瘤菌在苜蓿各組織內(nèi)的定殖數(shù)量[22]。

研究發(fā)現(xiàn)，適量硼可增加苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)、提高種子產(chǎn)量并改善營養(yǎng)品質(zhì)[26-29]。由此可見硼在提高根瘤菌固氮效率、增加作物產(chǎn)量、提高蛋白質(zhì)含量方面已表現(xiàn)出一定效果。硼可促進(jìn)IAA合成，利于其在植物組織內(nèi)的擴(kuò)散和運(yùn)輸[30]。而IAA能增大細(xì)胞壁膜透性，促進(jìn)養(yǎng)分的釋放與根系根瘤菌的侵染，同時降低植物防衛(wèi)系統(tǒng)的胞壁降解酶的活性，使入侵微生物易于定殖在植物組織內(nèi)[22,31-32]。

近年來有關(guān)硼對根瘤菌影響的研究主要集中在結(jié)瘤效率和促進(jìn)作物生長方面，而關(guān)于硼對根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運(yùn)移和定殖影響的研究尚未報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過添加不同濃度硼來研究其對熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運(yùn)移和定殖及對苜蓿幼苗生長的影響，為提高接種效果，促進(jìn)大量內(nèi)生根瘤菌定殖于植物體內(nèi)并向繁殖器官轉(zhuǎn)移，形成攜帶目的根瘤菌的種子提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試根瘤菌：由草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的熒光標(biāo)記根瘤菌Ensifermeliloti12531f (12531f)和EnsifermelilotiLZgn5f (gn5f)。其原始菌株分別為Ensifermeliloti12531f(購自中國科學(xué)院微生物保藏中心——分離自非本苜蓿植株體內(nèi)的外源根瘤菌)，EnsifermelilotiLZgn5 (gn5)(分離自甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子的內(nèi)源根瘤菌，經(jīng)中國科學(xué)院微生物鑒定保藏中心測序鑒定)，其最終來源是上代苜蓿植株的內(nèi)生根瘤菌，通過垂直傳代進(jìn)入種子。所有菌種于TY(Yeast Tryptone Agar)固體穿刺管中[33]4 ℃保存后以三親本雜交法導(dǎo)入青色熒光蛋白質(zhì)粒標(biāo)記構(gòu)建標(biāo)記菌株待用[34]。

供試苜蓿種子：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供甘農(nóng)5號紫花苜蓿(MedicagosativaGannong No.5)種子，凈度為97%，發(fā)芽率為84%。

供試硼：購自于蘭州博域生物科技有限責(zé)任公司的硼酸，含量不少于99.5%。

培養(yǎng)基：采用TY培養(yǎng)基進(jìn)行菌種的保存、活化、培養(yǎng)及苜蓿各組織內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量的檢測。配方為胰蛋白胨:5 g；酵母粉:3 g；CaCl2·6H2O:1.3 g；蒸餾水1000 mL；pH:7.0；121 ℃高溫滅菌26 min；固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L。

營養(yǎng)液：Hoagland有氮營養(yǎng)液[35]和Hoagland無氮營養(yǎng)液[36]，以1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH=7.0±0.1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 硼濃度篩選及培養(yǎng)基的制備 設(shè)置硼酸濃度為0、0.01、0.5、1、10和100 mg/L。硼酸置于無菌三角瓶中，無菌操作臺內(nèi)紫外殺菌1 h后無菌水溶解并過無菌濾膜(直徑0.22 μm)3次，爾后按需要的濃度加入配制好的40 mL TY液體培養(yǎng)基中。

1.2.2 熒光標(biāo)記根瘤菌菌液制備 將TY固體穿刺管保存的兩種熒光標(biāo)記根瘤菌活化后接入50 mL TY液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600 nm=0.5～0.8，將該菌液按10%濃度加入不同硼濃度的液體培養(yǎng)基內(nèi)。待上述培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600 nm=0.5～0.8后將其轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管中，8000 r/min離心10 min，棄上清，留沉淀，加入等體積的無菌水，在渦旋振蕩器上充分打散，制成菌懸液待用。

1.2.3 苜蓿幼苗的培養(yǎng)及接種 試驗(yàn)于2014年4月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行。選取健康飽滿的甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子，置于已滅菌的50 mL三角瓶內(nèi)，碘伏(購自蘭州博域生物科技有限責(zé)任公司，有效碘含量0.45%～0.55%)浸泡3 min，無菌水清洗4次，每次1 min。以上操作均在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行。

細(xì)沙洗凈150 ℃高溫持續(xù)烘干5 h后121 ℃滅菌26 min，連續(xù)滅菌5次，待冷卻后裝入75%乙醇消毒且杯底扎有網(wǎng)眼的塑料杯(直徑6.0 cm、高7.5 cm， 400 g/杯)，將其放入水培盒中(長31 cm，寬19 cm，高10.5 cm)。每杯播種40粒已消毒的種子，表面覆蓋干沙2 cm左右。未接種熒光標(biāo)記根瘤菌液前，每處理水培盒內(nèi)加700 mL Hoagland有氮營養(yǎng)液，使其由杯底自下而上浸濕[37]。

待苜蓿幼苗長出真葉后，每杯定苗25株，將已制好的1.2.2菌懸液澆于盆栽表面，25 mL/杯。每處理重復(fù)6次，以無菌蒸餾水接種處理為對照。幼苗生長過程中用無菌蒸餾水補(bǔ)充水分，接種后每15 d澆灌500 mL/盒 Hoagland無氮營養(yǎng)液，至60 d幼苗收獲。按表1設(shè)置試驗(yàn)處理。

表1 試驗(yàn)處理Table 1 Treatments for experiment

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 熒光標(biāo)記根瘤菌生長的測定 于接種后1、3、5和7 d的相同時間測定含不同濃度硼的培養(yǎng)基菌液OD600 nm吸光度值。

1.3.2 熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運(yùn)移和定殖的測定 接種后每隔15 d取樣，每處理每重復(fù)內(nèi)隨機(jī)選取幼苗，分為上部莖、上部葉、下部莖、下部葉和根；分別稱取1 g置于50 mL無菌三角瓶內(nèi)，碘伏浸泡3 min，無菌水沖洗4次，每次1 min。各組織消毒后，將最后一次消毒的植物組織各面在固體培養(yǎng)基平板上放置30 min后取出，將平板28 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，未長出菌落，表明已徹底消毒[20]。將完全消毒后的組織分別置于無菌研缽中加入2 mL無菌水研磨(重量低于0.5 g則加入1 mL無菌水)(根部研磨液依次稀釋為10、102、103倍，其他組織不稀釋)，離心(4000 r/min，3 min)后依次吸取0.2 mL均勻涂布于TY固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，計(jì)數(shù)每皿內(nèi)菌落數(shù)量。黑暗條件下用手提紫外燈觀察每皿內(nèi)發(fā)光的熒光標(biāo)記根瘤菌菌落個數(shù)后換算出每克樣品(鮮重)內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量[22]。

1.3.3 單株結(jié)瘤數(shù)和單株根瘤重的測定 幼苗生長60 d后每處理隨機(jī)取5株測定單株結(jié)瘤數(shù)和單株根瘤重。

1.3.4 形態(tài)指標(biāo)的測定 幼苗生長60 d后每處理每重復(fù)隨機(jī)選取5株計(jì)算單株復(fù)葉數(shù)、刻度尺測量株高及根長。同時每處理隨機(jī)選取10株，稱取地上和根部鮮重(濾紙吸干表面水分)和干重(烘箱中105 ℃殺青20 min，爾后80 ℃烘干至恒重)[38]。

1.3.5 葉綠素含量的測定 幼苗生長60 d后每處理隨機(jī)選取葉片，用脫脂棉擦拭干凈，去除主脈和兩頭部分，剪碎，混勻，稱0.2 g左右，用99%丙酮和95%乙醇1∶1混合液定容50 mL，重復(fù)3次。將定容好的容量瓶置于黑暗處，每天搖動1次，直至葉片完全變白，記錄吸光度值(OD645 nm、OD663 nm)[39]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007整理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS(SPSS V16.0，SPSS Inc.， Chicago， IL，USA)軟件進(jìn)行處理和方差分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行各個處理的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 硼對熒光標(biāo)記根瘤菌生長的影響

適宜硼濃度對兩種熒光標(biāo)記根瘤菌的生長具有促進(jìn)作用(圖1)。1至5 d時，硼對12531f的生長無明顯促進(jìn)作用；7 d時，當(dāng)硼濃度低于1 mg/L時其生長速度高于未添加硼處理，且添加1 mg/L硼時其生長速度最高，顯著高于未添加硼處理(P<0.05)，硼濃度高于1 mg/L后，生長速度降低，與對照差異不顯著(P>0.05)(圖1A)。

1 d時，隨著硼濃度的增加，gn5f的生長速度逐漸增大，當(dāng)濃度達(dá)100 mg/L時，gn5f生長速度最快，顯著高于其他處理(P<0.05)；3 d時，硼濃度低于1 mg/L時，gn5f生長速度顯著低于對照(P<0.05)，其余處理與對照差異不顯著(P>0.05)；5和7 d時，除添加0.01 mg/L硼處理生長速度低于未添加硼處理外，其余各處理同樣與對照差異不顯著(P>0.05)(圖1B)。

表明硼對兩種不同來源的熒光標(biāo)記根瘤菌生長促進(jìn)作用不同，其中1 mg/L硼對12531f生長稍有促進(jìn)作用，而100 mg/L硼對gn5f生長初期效果較好，隨著時間的延長則無明顯作用。

圖1 硼對12531和gn5f生長的影響變化Fig.1 Effect of boron on the growth of 12531f and gn5f A：硼對12531f 的影響Effect of boron on the growth of 12531f；B：硼對gn5f的影響Effect of boron on the growth of gn5f.不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。 The different small letters mean the significant differences at P<0.05, the same below.

2.2 硼對熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿根內(nèi)定殖的影響

如表2所示，添加1、10和100 mg/L硼接種12531f后，根部可檢測到熒光標(biāo)記根瘤菌。添加100 mg/L硼15 d時根部12531f數(shù)量最多，達(dá)2185.00 cfu/g，但與1 mg/L硼接種45 d處理無顯著差異(P>0.05)；30 d時數(shù)量減少，45 d后數(shù)量又逐漸升高。1 mg/L硼處理菌落數(shù)量顯著高于同時期其他處理(P<0.05)，菌落數(shù)量在1494.27～2001.40 cfu/g范圍內(nèi)波動。未添加硼處理和對照均未檢測出12531f。

不同硼濃度對gn5f在苜蓿根部運(yùn)移及定殖影響不同，15 d時，添加0.01、0.5和1 mg/L硼后根內(nèi)可檢測出gn5f，但三者之間差異不顯著(P>0.05)；30 d時其在根內(nèi)定殖數(shù)量減少，45 d后開始升高，60 d時根內(nèi)定殖數(shù)量最高；添加0.5 mg/L硼后根內(nèi)gn5f數(shù)量最高，達(dá)58307.11 cfu/g，但與1 mg/L硼處理差異不顯著(P>0.05)。未添加硼處理和對照均未檢出gn5f。

由此表明，兩種熒光標(biāo)記根瘤菌均可以長時間在根部定殖，但硼對二者定殖的影響不同。100 mg/L硼利于12531f定殖于根部，0.5 mg/L硼利于gn5f定殖于根部。

2.3 硼對熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿地上各組織內(nèi)運(yùn)移和定殖的影響

如表3所示，添加硼后促進(jìn)了12531f向下部葉和下部莖內(nèi)運(yùn)移并定殖，添加1 mg/L硼顯著提高了12531f在下部葉內(nèi)的定殖數(shù)量，接種15 d時數(shù)量最高，達(dá)23.38 cfu/g，顯著高于其他處理(P<0.05)；45 d時同樣發(fā)現(xiàn)1 mg/L硼促進(jìn)了12531f在下部葉內(nèi)的定殖，數(shù)量達(dá)11.04 cfu/g。下部莖較利于12531f定殖， 45 d時添加1 mg/L硼數(shù)量高達(dá)62.74 cfu/g，與單獨(dú)接菌處理差異顯著(P<0.05)。上部莖內(nèi)，單獨(dú)接種15 d時可檢測到12531f，數(shù)量為17.81 cfu/g，其余處理未檢測到。上部葉內(nèi)未檢測到12531f。60 d后檢測不到12531f。對照未檢測出12531f。

硼較適宜gn5f定殖于下部莖，接種15和30 d時，100 mg/L硼顯著提高了gn5f的定殖數(shù)量，數(shù)量分別高達(dá)57.55和51.49 cfu/g，顯著高于其他處理(P<0.05)，45 d后數(shù)量逐漸減少，60 d后檢測不到gn5f。硼對gn5f在苜蓿下部葉和上部莖葉內(nèi)的運(yùn)移和定殖影響較小，只有在添加0.5 mg/L硼處理15 d時下部葉內(nèi)檢測到少量gn5f，數(shù)量僅為2.65 cfu/g，其余處理未檢測到。未添加硼處理的單獨(dú)接菌處理和對照未檢測到gn5f。

12531f在下部莖內(nèi)定殖45 d時數(shù)量最高，而gn5f在15 d時定殖數(shù)量達(dá)最高，以后數(shù)量逐漸降低，由此表明兩種熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿地上表現(xiàn)出不同的運(yùn)移及定殖規(guī)律，受菌種來源及遺傳特性決定。

表2 硼對12531f和gn5f在苜蓿根內(nèi)運(yùn)移與定殖的影響Table 2 Effect of boron on the migration and colonization of 12531f and gn5f in alfalfa roots cfu/g

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Values (mean±SE) represent the results of Duncan’s multiple range test, the different letters in the same column indicate significant differences (P<0.05), the same below.

2.4 硼和熒光標(biāo)記根瘤菌接種對甘農(nóng)5號紫花苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)及根瘤重的影響

適宜濃度的硼和兩種熒光標(biāo)記根瘤菌接種苜蓿幼苗有增加單株結(jié)瘤數(shù)和單株根瘤重的趨勢，但作用不明顯(表4)。1 mg/L硼和12531f接種后苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)分別高出對照和單獨(dú)接菌處理21.32%和30.95%，但差異不顯著(P>0.05)；單株根瘤重分別高出對照和單獨(dú)接菌處理34.67%和176.71%，但差異不顯著(P>0.05)。其余硼濃度與12531f混合接種后對單株結(jié)瘤數(shù)和單株根瘤重?zé)o明顯促進(jìn)作用。

低濃度硼與gn5f混合接種后未提高單株結(jié)瘤數(shù)，硼濃度低于1 mg/L時，單株結(jié)瘤數(shù)低于對照和單獨(dú)接菌處理，添加10和100 mg/L硼后單株結(jié)瘤數(shù)增加，100 mg/L硼處理下數(shù)量最高，分別高出對照和單獨(dú)接菌處理23.53%和15.07%，但差異不顯著(P>0.05)。單株根瘤重僅在添加100 mg/L硼時高于對照，分別高出對照和單獨(dú)接菌處理21.67%和117.26%，同樣與對照差異不顯著(P>0.05)。

表明只有在適宜硼添加濃度下接種才可促進(jìn)苜蓿根瘤的形成，且不同來源的根瘤菌要選擇不同的硼濃度。

2.5 硼和熒光標(biāo)記根瘤菌接種對甘農(nóng)5號紫花苜蓿幼苗生長的影響

兩種熒光標(biāo)記根瘤菌接種后苜蓿幼苗單株葉片數(shù)、株高和根長均增加，添加硼后三者均高于未添加硼的單獨(dú)接菌處理和對照(表5)。硼與12531f混合接種后，隨硼濃度的增加，三者均逐漸增大，添加1 mg/L硼后達(dá)最高，單株葉片數(shù)分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理89.70%和84.12%(P<0.05)；株高分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理133.93%和117.13%(P<0.05)；根長分別高出對照和單獨(dú)接菌處理175.00%和63.64%，但與單獨(dú)接菌處理無顯著差異(P>0.05)；爾后隨硼濃度的增加，單株葉片數(shù)、株高和根長逐漸減小。硼與gn5f混合接種后單株葉片數(shù)、株高和根長逐漸增加，添加100 mg/L后各指標(biāo)均達(dá)到最大，其中單株葉片數(shù)分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理45.45%和37.93%(P<0.05)；株高分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理69.64%和37.68%(P<0.05)；根長分別高出對照和單獨(dú)接菌處理95.83%和17.50%，但與單獨(dú)接菌處理無顯著差異(P>0.05)。

表3 硼對12531f和gn5f在苜蓿地上各組織內(nèi)運(yùn)移和定殖的影響Table 3 Effect of boron on the migration and colonization of 12531f and gn5f in alfalfa aerial tissues cfu/g

表4 硼和12531f、gn5f混合接種后甘農(nóng)5號紫花苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)及根瘤重Table 4 Effect of boron and 12531f, gn5f co-inoculation on the Gannong No.5 alfalfa nodule number and nodule weight

兩種熒光標(biāo)記根瘤菌接種后均可增加苜蓿幼苗生物量，添加適宜濃度硼后生物量均高于對照和單獨(dú)接菌處理(表6)。硼與12531f接種后，隨著濃度的升高，生物量逐漸增加，到1 mg/L硼后地上鮮干重和根鮮干重均達(dá)最高，其中，地上鮮重分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理129.73%和80.70%(P<0.05)；地上干重分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理172.14%和164.02%(P<0.05)；根鮮重分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理645.05%和395.19%(P<0.05)；根干重分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理909.28%和810.70%(P<0.05)；爾后生物量逐漸降低，但均高于對照。與gn5f接種后，隨著硼濃度的升高，苜蓿生物量逐漸增加，至濃度達(dá)100 mg/L后，地上鮮干重和根鮮干重均達(dá)最高，其中，地上鮮重分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理64.38%和36.91%(P<0.05)；地上干重分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理148.86%和144.25%(P<0.05)；根鮮重分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理757.57%和587.20%(P<0.05)；根干重分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理1424.24%和1268.98%(P<0.05)。

表5 硼和12531f、gn5f接種后甘農(nóng)5號紫花苜蓿單株葉片數(shù)、株高和根長Table 5 Effect of boron and 12531f, gn5f co-inoculation on the Gannong No.5 alfalfa seedlings leaf number, plant height and root length

表6 硼和12531f、gn5f接種對甘農(nóng)5號紫花苜蓿生物量的影響Table 6 Effect of boron and 12531f, gn5f co-inoculation on the Gannong No.5 alfalfa seedlings biomass

2.6 硼和熒光標(biāo)記根瘤菌接種對甘農(nóng)5號紫花苜蓿葉綠素含量的影響

不同濃度硼與兩種熒光標(biāo)記根瘤菌混合接種對苜蓿葉片葉綠素含量影響不同(圖2)。單獨(dú)接種12531f時葉片葉綠素(a+b)含量低于對照，只有添加1 mg/L硼后其含量顯著高出對照，此濃度下含量分別顯著高出對照和單獨(dú)接菌處理18.31%和36.86%(P<0.05)，隨后含量又降低(圖2A)。而單獨(dú)接種gn5f時葉綠素含量顯著高出對照10.17%(P<0.05)，添加低濃度硼不利于葉綠素的合成，隨著硼添加濃度的增加，其含量逐漸增大，當(dāng)添加100 mg/L硼后達(dá)最高，顯著高出對照和單獨(dú)接種處理24.41%和12.92%(P<0.05)(圖2B)。

圖2 硼和熒光標(biāo)記根瘤菌混合接種后甘農(nóng)5號紫花苜蓿葉片葉綠素含量的變化Fig.2 Variation of Gannong No.5 alfalfa leaf chlorophyll content after boron and fluorescent tagged rhizobia co-inoculation A：硼和12531f 接種Boron and 12531f co-inoculation；B：硼和gn5f接種Boron and gn5f co-inoculation.

3 討論

3.1 硼對兩種熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿幼苗體內(nèi)運(yùn)移和定殖的影響

硼是植物生長發(fā)育和穩(wěn)定根瘤細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)所必需的微量元素[40-41]。根瘤菌與植物間相互作用[42]、侵染[43]、共生體的形成[44-45]、根瘤的形成[46]都會因硼的缺乏而受到極大影響。硼對根瘤菌表面多糖的形成、共生關(guān)系的建立、高效固氮作用的發(fā)揮具有重要意義。缺硼會減弱根瘤菌的定殖能力、減少根瘤的數(shù)量并削弱固氮能力[42, 47]，同時也會降低根瘤菌表面多糖的形成和其功能的發(fā)揮[48]。

硼參與根瘤菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的形成，而EPS和LPS對根瘤菌侵染植物時所遇到的防御反應(yīng)具有減弱作用。EPS可分泌到細(xì)胞表面，并抵御外來侵害[49-50]，是參與共生固氮的重要物質(zhì)。當(dāng)根瘤菌侵染宿主時會使宿主產(chǎn)生防御反應(yīng)，而EPS可通過表面包被減少菌體與宿主細(xì)胞的直接接觸，以規(guī)避或減弱宿主植物的防御性反應(yīng)，促成根瘤菌的侵入和根瘤的形成；或在侵染過程中誘導(dǎo)菌體和宿主合成水解酶，引起宿主胞壁的結(jié)構(gòu)變化[51]。LPS在細(xì)胞壁外壁，可維持細(xì)胞膜穩(wěn)定、抵御植物抗菌素對細(xì)胞的傷害[52]， LPS對根毛的吸附、侵染結(jié)構(gòu)及根瘤的形成，對細(xì)胞抵御植物防御反應(yīng)以及根瘤菌的宿主專一性等方面都起到重要的作用。硼同樣可促進(jìn)IAA的合成，宋柏權(quán)等[30]發(fā)現(xiàn)當(dāng)硼濃度逐漸增到2 mg/L時，甜菜葉片內(nèi)IAA含量達(dá)最高，隨著硼濃度增加，其含量逐漸降低，硼素缺乏和毒害脅迫處理均會導(dǎo)致IAA含量的降低，因此需選擇適宜的硼濃度，而IAA能使入侵微生物易定殖于植物組織[32, 53]，增加根瘤菌的侵染位置。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硼對兩種不同來源的熒光標(biāo)記根瘤菌生長影響不同，其中1 mg/L硼對12531f生長稍有促進(jìn)作用，而100 mg/L硼對gn5f生長初期效果較好，隨著時間的延長則無明顯作用，表明菌株不同，對硼的敏感性也不同。但100 mg/L硼較利于12531f在根部定殖，而0.5 mg/L硼較利于gn5f在根部定殖，且接種60 d時根內(nèi)仍可以檢測大量熒光標(biāo)記根瘤菌；而在苜蓿幼苗地上各組織內(nèi)，1 mg/L硼可促進(jìn)大量12531f運(yùn)移并定殖于下部莖和下部葉內(nèi)，60 d時下部莖內(nèi)12531f定殖數(shù)量最多，100 mg/L硼則利用gn5f大量運(yùn)移并定殖于下部莖內(nèi)，45 d以后數(shù)量逐漸降低，60 d則未檢測到。該結(jié)果可能由于添加適宜的硼后促進(jìn)了根瘤菌EPS及LPS的形成，減弱了宿主苜蓿對兩種熒光標(biāo)記根瘤菌所產(chǎn)生的防御反應(yīng)，或因?yàn)镋PS及LPS對不同菌種活力及持久力的影響不同。

在苜蓿幼苗根系內(nèi)，內(nèi)源熒光標(biāo)記根瘤菌gn5f的定殖數(shù)量高于外源熒光標(biāo)記根瘤菌12531f，地上各部位，外源熒光標(biāo)記根瘤菌12531f在1 mg/L硼作用下就可以大量定殖于下部莖和下部葉內(nèi)，而內(nèi)源熒光標(biāo)記根瘤菌gn5f需在100 mg/L硼作用下才能達(dá)到較好效果。產(chǎn)生的原因一方面是與所選菌種類型有關(guān)，12531f的原始菌株12531為慢生型根瘤菌，代謝速率慢，而gn5f的原始菌株gn5為快生型根瘤菌，代謝速率快，二者遺傳性狀差異較大，因此生長過程中適宜的硼濃度不同(標(biāo)記菌株與原始菌株特性未發(fā)生改變[34])。除與菌株本身遺傳特性有關(guān)外，還可能因?yàn)檫m宜濃度的硼與12531f混合接種后競爭了宿主防御系統(tǒng)的應(yīng)激位點(diǎn)或活性中心，使寄主防御性反應(yīng)減弱，從而使得運(yùn)移并定殖于植物體的外源熒光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量增加。

3.2 硼和熒光標(biāo)記根瘤菌接種對苜蓿幼苗的影響

苜蓿種子內(nèi)含根瘤菌[54]，陳丹明等[25]也發(fā)現(xiàn)未接種根瘤菌的4種苜蓿均出現(xiàn)結(jié)瘤現(xiàn)象，因此本試驗(yàn)中對照出現(xiàn)結(jié)瘤現(xiàn)象，但數(shù)量少于接種兩種熒光標(biāo)記根瘤菌的處理，說明種子內(nèi)的根瘤菌競爭結(jié)瘤能力遠(yuǎn)不如所接種的根瘤菌[55]。硼在根瘤菌固氮、提高固氮酶活性方面有重要作用。硼通過影響根對根瘤菌的碳水化合物供應(yīng)，而影響豆科植物根瘤的形成[56]。添加硼后可增加結(jié)瘤個數(shù)和根瘤重，王克武等[26]也發(fā)現(xiàn)平谷種植苜蓿配施硼后其單株結(jié)瘤數(shù)比對照提高14.56%，本試驗(yàn)中以12531f+1 mg/L硼和gn5f+100 mg/L硼處理結(jié)瘤效果較好。根瘤數(shù)量多，增加了根瘤干重和固氮能力。固氮能力的提高，進(jìn)而可促進(jìn)植株的生長。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌并添加硼對苜蓿生物量、葉片數(shù)、株高和根長均有顯著的促進(jìn)作用。其中，1 mg/L硼和12531f接種后顯著提高了苜蓿幼苗生物量、葉片數(shù)、株高、根長和生物量；100 mg/L和gn5f接種后顯著提高了苜蓿幼苗生物量、葉片數(shù)、株高、根長和生物量。這是因?yàn)榕鹂筛纳聘垦鯕夂?，促進(jìn)根系生長[57]，利于糖分的積累，促進(jìn)果實(shí)生長[58]，從而為形成較高的生物量奠定基礎(chǔ)。何水華等[59]也發(fā)現(xiàn)葉面噴施速樂硼最佳濃度為0.08%，既能促進(jìn)作物生殖生長，又可以明顯改善其營養(yǎng)生長性狀，有利于構(gòu)建豐產(chǎn)的植株形態(tài)，提高產(chǎn)量。

紫花苜蓿葉片光合特性、生理代謝和光合產(chǎn)物代謝的變化可共同影響植株生長發(fā)育[60-61]。葉片數(shù)量的增加可以提高葉綠素含量及含氮量，利于植株進(jìn)行光合作用[62]。硼利于葉綠體基質(zhì)發(fā)育保護(hù)葉綠體被膜結(jié)構(gòu)化，缺硼時植株葉片葉綠體基質(zhì)發(fā)育退化，基粒數(shù)量減少從而影響植株光合速率[63]；楊建民等[64]在研究蘋果樹品種時發(fā)現(xiàn)葉含量與光合速率有正相關(guān)關(guān)系。本研究同樣發(fā)現(xiàn)1 mg/L硼與12531f混合接種、100 mg/L硼與gn5f混合接種葉綠素含量分別顯著高于對照和其他接種處理。說明接種根瘤菌同時添加硼可以促進(jìn)紫花苜蓿葉片葉綠素的合成，其含量的增加可促進(jìn)光合作用的進(jìn)行，進(jìn)而提高產(chǎn)量。

可見，適宜濃度的硼對根瘤菌的生長、在植物體內(nèi)運(yùn)移和定殖、結(jié)瘤和生長均有一定的促進(jìn)作用，但須正確選取菌株的種類、考慮根瘤菌競爭結(jié)瘤能力、共生固氮有效性。本研究初步探索了硼對兩種根瘤菌生長的影響，且只探索了硼對根瘤菌在苜蓿幼苗各組織內(nèi)的運(yùn)移和定殖，因此，后續(xù)研究會繼續(xù)探索硼對根瘤菌在田間營養(yǎng)和生殖生長階段苜蓿體內(nèi)的運(yùn)移和定殖。此外，還會繼續(xù)尋找利于根瘤菌生長的其他外源物質(zhì)和大量選取目標(biāo)根瘤菌，為促進(jìn)根瘤菌的運(yùn)移和定殖效果并實(shí)現(xiàn)目的根瘤菌導(dǎo)入良種苜蓿種子提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

1)1 mg/L硼與12531f混合接種，100 mg/L硼與gn5f混合接種利于二者在苜蓿幼苗體內(nèi)運(yùn)移并定殖。

2)上述兩種菌株與相應(yīng)濃度硼混合接種苜蓿幼苗，對單株結(jié)瘤數(shù)、單株根瘤重、單株葉片數(shù)、株高、根長、地上鮮重、地上干重、根鮮重、根干重和葉綠素含量均有顯著促進(jìn)作用。

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Effect of boron on migration and colonization by rhizobia and seedling growth inMedicagosativa

MIAO Yang-Yang, ZHOU Tong, SHI Shang-Li*, KANG Wen-Juan, ZHANG Yun-Ting

CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryforGrasslandEcosystemofMinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CentersforGrazingLandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

The effect of boron on the migration and colonization of rhizobia in Gannong No.5 alfalfa (MedicagosativaGannong No.5) tissues and subsequently seedling growth were investigated by root drenching using two cyan fluorescent protein (CFP) tagged rhizobia;Ensifermeliloti12531f (12531f) andEnsifermelilotiGN5f (gn5f) containing different boron concentrations. The results showed that the best supplementation levels were less than 1 and 100 mg/L boron for 12531f and gn5f respectively. The optimum boron level enhanced the colonization of both rhizobia in alfalfa roots; colonization densities of 2184.99 and 58307.11 cfu/g were achieved by using 100 mg/L boron co-inoculated 12531f and 0.5 mg/L boron co-inoculated gn5f, respectively. Rhizobia were able to migrate to the aerial tissues and colonize lower stems and leaves through application of 1 mg/L boron co-inoculated 12531f and 100 mg/L boron co-inoculated gn5f, respectively. No fluorescent tagged rhizobia were detected in the control treatment. Individual plant root nodule number, nodule weight, leaf number, plant height, root length, aerial fresh weight, aerial dry weight, root fresh weight and root dry weight were increased by 21.31%-909.28% for the 1 mg/L boron co-inoculated 12531f treatment compared with control and zero boron innoculation. These traits were increased by 15.07%-1424.24% for the 100 mg/L boron co-inoculated gn5f treatment compared with control and zero boron inoculation treatments. Leaf chlorophyll content was reduced by 12531f without boron whereas 1 mg/L boron co-inoculated 12531f significantly increased the leaf chlorophyll content by 18.31% and 36.86% compared with the control and zero boron inoculation, respectively (P<0.05). Boron supplemented gn5f enhanced the leaf chlorophyll content; 100 mg/L boron co-inoculated gn5f increased leaf chlorophyll content by 24.41% and 12.92% compared with control and zero born inoculation, respectively (P<0.05). The results suggest that 1 mg/L boron co-inoculation with 12531f, 100 mg/L boron co-inoculation with gn5f promoted the migration and colonization of rhizobia in alfalfa seedlings, enhancing growth, indicating possible benefits for alfalfa cultivation.

fluorescent tagged rhizobia; boron;Medicagosativa; migration and colonization; growth promoting

10.11686/cyxb2016340

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-09-06；改回日期：2016-11-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560666)資助。

苗陽陽(1989-)，女，滿族，遼寧本溪人，在讀博士。E-mail:yangyangmiao.com@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail:shishl@gsau.edu.cn

苗陽陽, 周彤, 師尚禮, 康文娟, 張運(yùn)婷. 硼對根瘤菌在紫花苜蓿體內(nèi)運(yùn)移和定殖及對幼苗生長的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(4): 120-133.

MIAO Yang-Yang, ZHOU Tong, SHI Shang-Li, KANG Wen-Juan, ZHANG Yun-Ting. Effect of boron on migration and colonization by rhizobia and seedling growth inMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(4): 120-133.