劉 濤, 趙 群, 楊 丹， 鄭秋艷, 張 倩， 鄧燕君

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106; 2.成都大學(xué) 張瀾學(xué)院， 四川 成都 610106)

一測多評法測定丹參酚酸類提取物中4個成分含量

劉 濤1, 趙 群1, 楊 丹1， 鄭秋艷2, 張 倩1， 鄧燕君1

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106; 2.成都大學(xué) 張瀾學(xué)院， 四川 成都 610106)

建立同時測定丹參總酚酸提取物中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的一測多評法，并進行方法學(xué)考察.以丹酚酸B為內(nèi)參物，建立丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸相對于丹酚酸B的相對校正因子.通過相對校正因子計算其他3個成分的含量，并將計算結(jié)果與外標(biāo)法實測結(jié)果用相對偏差進行比較.結(jié)果表明，各相對校正因子重現(xiàn)性良好，一測多評法的計算值與外標(biāo)法實測值無顯著差異.方法具有簡便準(zhǔn)確等優(yōu)點，可用于控制丹參總酚酸提取物的內(nèi)在質(zhì)量.

丹參總酚酸提取物；一測多評；相對校正因子；外標(biāo)法

0 引 言

丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，是臨床常用中藥，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩等功效.藥理研究表明，丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B等丹參酚酸類成分具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、抗氧化等作用，是丹參活血化瘀的主要成分.在2015年版的《中國藥典》丹參總酚酸提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅以迷迭香酸和丹酚酸B為檢測指標(biāo)，而按照傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的“整體觀”，采用現(xiàn)行的利用1～2種化學(xué)成分評價中藥質(zhì)量的模式，不能表征中藥化學(xué)成分的整體性和復(fù)雜性，因此，多成分同步質(zhì)量控制模式應(yīng)運而生.目前，采用常規(guī)方法以多個成分含量測定來評價丹參水溶性提取物的研究已有報道，但這些方法存在著對照品消耗大，而且操作復(fù)雜、檢測成本昂貴等缺陷.對此，一些學(xué)者提出了一測多評法，即只采用1個對照品來實現(xiàn)對多個成分的同步測定[2-5]，此法已被2015年版《中國藥典》一部收載，并在丹參、人參、黃連等藥材中得到驗證.在此基礎(chǔ)上，本研究采用一測多評法，建立了以丹酚酸B為對照，同步測定丹參總酚酸提取物中酚酸類成分的分析方法，并驗證了此方法的適用性和可行性，擬實現(xiàn)丹參酚酸類成分多指標(biāo)質(zhì)量評價.

1 試藥與儀器

1.1 試 藥

實驗所用試藥包括：丹參素鈉對照品(批號，141018)購于四川省維克奇生物科技有限公司，供含量測定用，純度大于98%；原兒茶醛對照品(批號，150319)、迷迭香酸對照品(批號，140311)、丹酚酸B對照品(批號，151118)均購于成都植標(biāo)化生物技術(shù)有限公司，供含量測定用，純度均大于98%；丹參總酚酸提取物由實驗室自制；甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：依利特P230Ⅱ型高效液相色譜系統(tǒng)(P230Ⅱ高壓恒流泵、UV230Ⅱ紫外—可見檢測器、AS1201自動進樣器)、依利特Ichrom高效液相色譜系統(tǒng)(大連依利特公司)，F(xiàn)A2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，KQ-100E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件.

實驗的色譜條件為：Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1 %磷酸水溶液(B)，梯度洗脫0～15 min,10%～15% A；15～25 min,15%～25% A；25～35 min,25%～30% A；35～40 min,30%～90% A；40～50 min,90% A；流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長282 nm，進樣量10 μL.在該色譜條件下，各待測成分分離度良好，其色譜圖如見圖1所示.

1.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.迷迭香酸；4.丹酚酸B

2.1.2 混合對照品溶液的制備.

取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為0.3196 mg/mL、0.0344 mg/mL、0.0632 mg/mL及0.6872 mg/mL的混合對照品溶液0#，備用.分別精密吸取上述混合對照品溶液0.5、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL置5 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液1#～6#.

2.1.3 供試品溶液的制備.

取丹參總酚酸提取物1.0 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，精密吸取1 mL上述稀釋液置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

2.1.4 線性關(guān)系考察.

分別精密吸取“2.1.2”項下6個濃度的混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀.以測得的峰面積和進樣量進行線性回歸，得到各成分的回歸方程以及線性范圍(見表1).結(jié)果表明，丹參酚酸混合對照品溶液在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.1.5 精密度.

精密吸取2#混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄丹參素鈉、 原兒茶醛、 迷迭香酸、 丹酚酸B4種酚酸類成分的峰面積，計算RSD.結(jié)果顯示，各成分峰面積的RSD分別為1.04%、0.92%、1.26%、1.24%，表明儀器的精密度良好.

表1 丹參酚酸的線性范圍(n=2)

2.1.6 穩(wěn)定性.

取同一批丹參總酚酸提取物供試品溶液，分別于樣品制備后的第0、2、4、6、8、12 h，精密吸取10 μL進樣，測定峰面積，計算RSD.結(jié)果顯示，丹參總酚酸提取物中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 4種酚酸類成分峰面積的RSD分別為1.74%、0.96%、2.67%、1.51%，表明在12 h內(nèi)，供試品溶液的穩(wěn)定性良好.

2.1.7 重復(fù)性.

取同一批丹參總酚酸提取物1.0 g，精密稱定，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取10 μL進樣，測定峰面積，計算提取物含量及RSD.結(jié)果顯示，丹參總酚酸提取物中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 4種酚酸類成分的含量分別為2.563%、0.501%、0.820%、11.708%，RSD分別為2.59%、2.68%、2.92%、3.10%，表明本方法的重復(fù)性良好.

2.1.8 加樣回收.

取同一批已知含量的丹參總酚酸提取物0.5 g，精密稱定，平行6份，分別按提取物含量—對照品(1∶1)的比例加入一定量的對照品溶液，按供試品溶液制備方法，測定并計算各成分的加樣回收率以及RSD(見表2).結(jié)果顯示，丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 4種酚酸類成分的加樣回收率分別為99.1%、101.1%、99.0%、98.7%，RSD分別為3.02%、1.98%、2.80%、2.39%，表明本方法的準(zhǔn)確度良好.

2.2 相對校正因子的確定

以丹酚酸B為內(nèi)參物，根據(jù)相對校正因子計算公式，分別計算丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸與內(nèi)參物丹酚酸B的相對校正因子，結(jié)果見表3.

2.3 一測多評法的耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評價

為使所建立的各待測成分的相對校正因子能用于常規(guī)檢驗，針對可能影響相對校正因子重現(xiàn)性的因素，本研究設(shè)計了一系列實驗，并考察了不同實驗條件對相對校正因子重現(xiàn)性的影響，同時對相對校正因子值影響大的因素進行具體分析后加以限定，以保證本方法有效.

表2 加樣回收試驗結(jié)果

表3 丹參酚酸的相對校正因子(n=2)

2.3.1 不同儀器對相對校正因子的影響.

實驗在不同實驗室進行，采用依利特Hypersil C18色譜柱，分別考察了依利特P230Ⅱ和依利特Ichrom 2種不同的高效液相色譜系統(tǒng)對丹酚酸相對校正因子的影響(見表4).結(jié)果顯示，各成分相對校正因子重復(fù)性良好(RSD<5 %).

表4 不同儀器對相對校正因子的影響(n=2)

2.3.2 不同色譜柱對相對校正因子的影響.

實驗在同一實驗室進行，采用依利特P230Ⅱ和依利特Ichrom 2種不同的高效液相色譜系統(tǒng)，分別考察了Hypersil C18色譜柱2種不同批號的色譜柱對丹參酚酸相對校正因子的影響(見表5、表6).結(jié)果顯示，各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5 %).

表5 不同色譜柱對相對校正因子的影響——依利特P230Ⅱ(n=2)

表6 不同色譜柱對相對校正因子的影響——依利特Ichrom(n=2)

2.3.3 不同柱溫對相對校正因子的影響.

實驗在同一實驗室進行，采用依利特P230Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng)和Hypersil C18色譜柱分別考察了不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)對丹參酚酸相對校正因子的影響(見表7).結(jié)果顯示，各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%).

表7 不同柱溫對相對校正因子的影響(n=2)

2.3.4 不同流速對相對校正因子的影響.

實驗在同一實驗室進行，采用依利特P230Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng)和色譜柱Hypersil，分別考察了不同流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)對丹參酚酸相對校正因子的影響(見表8).結(jié)果顯示，各成分相對校正因子重復(fù)性良好(RSD<5%).

表8 不同流速對相對校正因子的影響(n=2)

2.4 一測多評法待測色譜峰的定位

分別考察了相對保留值和保留時間差在不同儀器和不同批號色譜柱中的重現(xiàn)性.通過比較發(fā)現(xiàn)，保留時間差的波動相對較小(RSD<3 %),因此采用保留時間差進行丹參總酚酸提取物中酚酸類成分色譜峰的定位較為可行，可準(zhǔn)確判斷出目標(biāo)峰的位置.實驗結(jié)果見表9、10.

表9 QAMS法待測成分色譜峰的定位——相對保留值

表10 QAMS法待測成分色譜峰的定位——保留時間差

2.5 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

精密吸取供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀測定：采用外標(biāo)法對丹參總酚酸提取物中4種酚酸類成分進行多成分同步測定，利用所建立的一測多評法對其含量進行計算，并將兩種方法計算的結(jié)果進行比較，以驗證此法用于酚酸類多指標(biāo)成分質(zhì)量評價的可行性和準(zhǔn)確性，實驗結(jié)果見表11.結(jié)果顯示，外標(biāo)法實測值與一測多評計算的含量值沒有顯著差異，相對偏差<5 %.結(jié)果表明，本研究建立的方法可用于丹參酚酸多成分的質(zhì)量評價研究.

3 討 論

本研究采用HPLC在波長282 nm檢測時，色譜峰分離度良好，達到基線分離，各待測成分色譜峰純度符合要求，表明各色譜峰內(nèi)無雜質(zhì)干擾，因此確定282 nm作為檢測波長.對于目標(biāo)色譜峰的定位，本研究分別采用保留時間差(待測成分與內(nèi)參物間保留時間的比值)和相對保留值(待測成分與內(nèi)標(biāo)物間保留時間的比值)作為定位標(biāo)準(zhǔn)，以丹酚酸B為內(nèi)參物，并在2種不同高效液相色譜系統(tǒng)和2種不同色譜柱下對這2個參數(shù)進行考察.結(jié)果顯示，采用各待測成分間的保留時間差更能夠準(zhǔn)確定位上述目標(biāo)色譜峰.

丹參作為臨床常用中藥，一直是行業(yè)研究的重點，關(guān)于丹參藥材的一測多評法已被2015年版《中國藥典》所收載.目前，對于丹參水溶性提取物的一測多評法也已有報道，例如，王小平等[6]以丹參素鈉為內(nèi)參物，建立了丹參水溶性提取物中紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B相對于丹參素鈉的相對校正因子，從而實現(xiàn)一測多評.本研究主要以丹酚酸B為內(nèi)參物，建立丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸相對與丹酚酸B的相對校正因子，采用HPLC外標(biāo)法測定了丹參總酚酸提取物中丹酚酸B，用相對校正因子計算得到丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸的含量，通過對10批丹參總酚酸提取物的含量測定發(fā)現(xiàn)，利用一測多評法計算的含量與外標(biāo)法實測值所得含量沒有明顯差異.經(jīng)方法學(xué)考察表明，本方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及準(zhǔn)確度均良好.同時，對所建立的相對校正因子進行系統(tǒng)適應(yīng)性考察，驗證了本方法的準(zhǔn)確性和適應(yīng)性.因此，一測多評法可用于丹參總酚酸提取物中酚酸類成分的質(zhì)量評價.

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:384-385.

[2]王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術(shù)指南[J].中國中藥雜志，2011，36(6)：657-658.

[3]王智民，高惠敏，付雪濤，等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價模式方法學(xué)研究[J].中國中藥雜志，2006，31(23)：1925-1928.

[4]楊菲，王智民，張啟偉，等.“一測多評”法測定丹參酚酸類成分的含量[J].中國中藥雜志，2011，36(17)：2372-2379.

[5]朱晶晶，王智民，匡艷輝，等.一測多評法同步測定人參和三七藥材中多種人參皂苷的含量[J].藥學(xué)學(xué)報，2008，43(12)：1211.

[6]王小平，龍凱花，李丹，等.一測多評HPLC法測定丹參水溶性提取物中4個水溶性成分含量[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2014，34(1)：84-86.

[7]李倩，劉偉，羅祖良，等.一測多評法測定丹參中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮的含量[J].中國中藥雜志，2012，37(6)：824-828.

[8]藍天鳳，王曉，王岱杰，等.一測多評法測定丹參中4種丹參酮類成分[J].中草藥，2012，43(12)：2420-2423.

Determination of 4 Components' Content in Salvianolic Acid Extracts by QAMS

LIUTao1,ZHAOQun1,YANGDan1,ZHENGQiuyan2，ZHANGQian1,DengYanjun1

(1.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China; 2.School of Zhanglan, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The paper is going to establish a quantitative analysis of multi-components by single-marker(QAMS) for the determination of salvianolic acid extract of salvianic acid sodium,protocatechualdehyde,rosmarinic acid,and salvianolic acid B of total salvianolic acid extract at the same time.Besides that,the methodology is studied.The salvianolic acid B is used as the internal reference,and the relative correction factor of salvianic acid sodium,protocatechualdehyde,rosmarinic acid relative to salvianolic acid B is established.According to the relative correction factor,the content of other 3 components is calculated,and the calculation results are compared with the measured results by external standard method based on relative deviation.The results show that the relative correction factor is of good reproducibility,and the calculation value of QAMS method is similar to the measured value of external standard method.The conclusion indicates that the QAMS method is simple and accurate,and therefore can be used for quality control of total salvianolic acid extract.

total phenolic extract of Salvia miltiorrhiza;quantitative analysis of multi-components by single-marker(QAMS);relative correction factor;external standard method

1004-5422(2017)01-0007-05

2017-02-19.

四川省千人計劃(2013332)資助項目.

劉 濤(1976 — )， 男， 博士， 高級工程師， 從事中成藥新藥開發(fā)與中藥質(zhì)量再評價研究.

R284.2

A