姚 楠，孫景秋，張 瓊

肝細(xì)胞癌中Dkk-3與Cyclin D1的表達(dá)及臨床意義

姚 楠1，孫景秋2，張 瓊1

目的 探討Dkk-3與Cyclin D1蛋白在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和癌旁組織中的表達(dá)，及兩者表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。方法 采用免疫組化法檢測80例HCC及癌旁組織中Dkk-3和Cyclin D1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 Dkk-3蛋白在HCC組織中的相對表達(dá)值低于癌旁組織(P<0.05)；Cyclin D1蛋白在HCC組織中的相對表達(dá)值高于癌旁組織(P<0.005)；Dkk-3和Cyclin D1蛋白相對表達(dá)值均與組織分化程度有關(guān)(P均<0.05)；HCC組織中Dkk-3與Cyclin D1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.044，rs=-0.226)。結(jié)論 Dkk-3蛋白可能通過影響Cyclin D1蛋白的表達(dá)影響HCC的發(fā)生、發(fā)展；聯(lián)合檢測Dkk-3和Cyclin D1蛋白表達(dá)可能對HCC的診斷及預(yù)后判斷有一定參考價值。

肝腫瘤；Dkk-3；Cyclin D1；免疫組織化學(xué)

我國肝癌病死率位居癌癥的第3位，僅次于肺癌和胃癌。因此研究其發(fā)病機(jī)制，對于判斷其預(yù)后并指導(dǎo)治療有重要意義。Dkk(Dickkopf)家族通過結(jié)合Wnt受體復(fù)合體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(low density lipid receptor related protein 5/6, LRP5 /LRP6)來抑制Wnt信號通路[1]。其中Dkk-3位于人類染色體11p15.1的位點，相對分子質(zhì)量為3.8×104，除了家族共有的結(jié)構(gòu)外還包括一個擴(kuò)充的N連接區(qū)域和C連接區(qū)域[2]。研究發(fā)現(xiàn)Dkk-3于成年嚙齒類動物腦和成纖維細(xì)胞以及人腎上腺皮質(zhì)中顯著表達(dá)[3]，同時在人類多種腫瘤組織和細(xì)胞株中表達(dá)均減弱和消失，包括前列腺癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6]、肺癌[7]、腎細(xì)胞癌[8]等。細(xì)胞周期蛋白D1是細(xì)胞周期素家族(Cyclin Ds)中與腫瘤關(guān)系最為密切的成員，其過度表達(dá)能引起細(xì)胞過度生長、轉(zhuǎn)化及癌變。作為一種公認(rèn)的癌基因，Cyclin D1已被證實在多種腫瘤細(xì)胞中呈過表達(dá)[9]。目前，關(guān)于肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中Cyclin D1和Dkk-3蛋白表達(dá)之間關(guān)系的研究，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道較少，本實驗通過檢測80例HCC標(biāo)本中Cyclin D1和Dkk-3蛋白表達(dá)，分析兩者之間的關(guān)系，并探討兩者與HCC發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2010年1月～2012年12月存檔的HCC組織80例，其中男性60例，女性20例；年齡26～79歲，平均53歲。高分化18例，中分化36例，低分化26例；大肝癌63例，小肝癌17例。所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實為HCC，且術(shù)前均未行放、化療。另收集癌旁組織40例，均為距腫瘤組織2 cm以上的正常肝組織。HCC組織及癌旁肝組織均取自手術(shù)標(biāo)本。收集臨床相關(guān)資料。

1.2 免疫組化 一抗多克隆兔抗人Dkk-3抗體購自上海聯(lián)碩寶為生物公司，EliVision試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。PAS染色液為蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科配制。組織采用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化、3%H2O210 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，高溫高壓修復(fù)10 min，按1 ∶100稀釋度滴加Dkk-3抗體后，按試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色操作。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。采用已知陽性片作為對照組，以PBS代替一抗作為空白對照組。

1.3 結(jié)果判定 Cyclin D1和Dkk-3蛋白均定位于細(xì)胞核，以染色呈棕黃色為陽性。采取二次計分法：每例標(biāo)本隨機(jī)選取10個高倍視野(×400)，計數(shù)每個高倍視野中陽性細(xì)胞所占百分比計分。(1)按染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細(xì)胞百分比計分：陰性為0分，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：≤1分為陰性，>1分為陽性。免疫組化標(biāo)記結(jié)果由兩位病理醫(yī)師采用獨立雙盲法判定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，不同組間比較采用χ2檢驗及Spearman等級相關(guān)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dkk-3蛋白在HCC及癌旁組織中的表達(dá) Dkk-3在HCC組織中的陽性率為26.3%(21/80)(圖1、2)，而在癌旁組織中的陽性率為57.5%(23/40)，Dkk-3在HCC組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05，表1)。

2.2 Cyclin D1在HCC及癌旁組織中的表達(dá) Cyclin D1在HCC組織中的陽性率為47.5%(38/80)(圖3)，而癌旁組織中的陽性率較低，僅為22.5%(9/40)，組間相比差異有顯著性(P<0.05，表1)。

圖1 Dkk?3在高分化HCC中的表達(dá)，EliVison法圖2 Dkk?3在低分化HCC中的表達(dá)，EliVison法圖3 CyclinD1在HCC中的表達(dá)，EliVison法

表1 Dkk-3和Cyclin D1在HCC及癌旁組織中的表達(dá)

2.3 HCC中Dkk-3、Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性 Dkk-3和Cyclin D1蛋白表達(dá)均與組織分化程度有關(guān)(P均<0.05)；與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)(表2)。對兩者陽性表達(dá)強(qiáng)度之間的相關(guān)性比較得出，Dkk-3和Cyclin D1蛋白在HCC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.044，rs=-0.226，表3)。

表2 Dkk-3和Cyclin D1表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

表3 HCC中Dkk-3、Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

HCC是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多基因突變的過程。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路的異常持續(xù)激活被認(rèn)為與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其中包括HCC[10]。

有研究者認(rèn)為，Dkk-3蛋白作為一個抑癌基因，可能通過下調(diào)β-catenin實現(xiàn)對Wnt通路的抑制作用[11]，從而起到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。Dkk-3表達(dá)下調(diào)可能與啟動子的甲基化有關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞株中Dkk-3表達(dá)均明顯降低，實驗證實，經(jīng)腺病毒載體轉(zhuǎn)染Dkk-3基因使其在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]。但其與肝癌的關(guān)系并未深入研究，國內(nèi)僅見個別報道，且在蛋白表達(dá)水平上存在差異?；诖?，本組實驗通過免疫組化對比HCC及正常肝組織中Dkk-3蛋白表達(dá)差異及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，了解其與HCC發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)報道與本組實驗結(jié)果，不難推測，Dkk-3與原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)系。同時作者推測，通過促進(jìn)癌細(xì)胞Dkk-3的表達(dá)，抑制Wnt通路的異?；罨型蔀橹委熌[瘤的一條新途徑。

Cyclin D1蛋白是Wnt通路上重要的調(diào)節(jié)蛋白，可以在G1期激活周期素依懶性激酶CDK4的活性，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。因此，其過表達(dá)可以使細(xì)胞縮短由G1期進(jìn)入S期的時間，使細(xì)胞快速增殖從而形成腫瘤，被認(rèn)為是與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)的癌基因[13]。本組實驗中Cyclin D1蛋白表達(dá)在HCC組織中明顯升高，在HCC和癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明Cyclin D1蛋白表達(dá)上調(diào)與HCC的發(fā)生密切相關(guān)。Cyclin D1蛋白表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期無關(guān)。Cyclin D1是Wnt通路中的核心環(huán)節(jié)[14]。本實驗在對Dkk-3蛋白和Cyclin D1在HCC組織中表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果進(jìn)行的相關(guān)性分析中，發(fā)現(xiàn)兩者蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即隨著Cyclin D1蛋白表達(dá)的升高，HCC組織中的Dkk-3蛋白表達(dá)持續(xù)降低。

綜上所述，作者認(rèn)為在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中，Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白共同作用在Wnt通路上，Dkk-3通過抑制Dsh蛋白的活化對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起抑制作用[15]，而β-catenin與Cyclin D1促進(jìn)子序列結(jié)合，可增加Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄。作者推測Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白在Wnt通路中為上下游關(guān)系，且兩者可能起到拮抗作用。因此，聯(lián)合檢測HCC中Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白表達(dá)，將有助于評估HCC的惡性程度及患者預(yù)后。

[1] Hoang B, Moos M Jr, Vukicevic S,etal. Prmiary structure and tissue distribution of FRZB, a novel protein related to Drosophila frizzled, suggest a role in skeletal morphogenesis[J]. J Biol Chem, 1996,271(48):26131-26137.

[2] Lee A Y, He B, You L,etal. Dickkopf-1 antagonizes Wnt signaling independent of beta-catenin in human mesothelioma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,323(4):1246-1250.

[3] Semenov M, Tamai K, Brott B K,etal. Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6[J]. Curr Biol, 2001,11(12):951-961.

[4] Lodygin D, Epanchintsev A, Menssen A,etal. Functional epigenomics identifies genes frequently silenced in prostate cancer[J]. Cancer Res, 2005,65(10):4218-4227.

[5] Sato H, Suzuki H, Toyota M,etal. Frequent epigenetic inactivation of DICKKOPF family genes in human gastrointestinal tumors[J]. Carcinogenesis, 2007,28(12):2459-2466.

[6] Hsieh S Y, Hsieh P S, Chiu C T,etal. Dickkopf-3 /REIC functions as a suppressor gene of tumor growth[J]. Oncogene, 2004,23(57):9183-9189.

[7] Nozaki I, Tsuji T, Iijmia O,etal. Reduced expression of REIC/Dkk-3 gene in non-small cell lung cancer[J]. Int J Oncol, 2001,19(1):117-121.

[8] Kurose K, Sakaguchi M, Nasu Y,etal. Decreased expression of REIC/Dkk-3 in human renal clear cell carcinoma[J]. J Urol, 2004,171(3):1314-1318.

[9] Lau W Y, Lai E C. Hepatocellular carcinoma: current management and recent advances[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2008,7(3):237-257.

[10] 張 影, 張?？? 王寶恩. 經(jīng)典Wnt信號通路與肝臟關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2008,16(9):975.

[11] Lee E J, Jo M, Rho S B,etal. Dkk-3, downregulated in cervical cancer, functions as a negative regulator of β-catenin[J]. Int J Cancer, 2009,124(2):287-297.

[12] 胡峻琿, 葉章群. 腎臟腫瘤的實驗研究現(xiàn)狀和進(jìn)展[J]. 中華實驗外科雜志, 2013,30(6):1107-1109.

[13] Jung K H, Kim J K, Noh J H,etal. Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression of cyclin D1 and CDK2 in human hepatocellular carcinoma[J]. J Cell Biochem, 2010,110(3):687-696.

[14] Kawasaki K, Watanabe M, Sakaguchi M,etal. REIC /Dkk-3 overexpression downregulates P-glycoprotein in multidrug-resistant MCF7/ADR cells and induces apoptosis in breast cancer[J]. Cancer Gene Ther, 2009,16(1):65-72.

[15] Nakamura R E, Hackam A S. Analysis of Dickkopf3 interactions with Wnt signaling receptors[J]. Growth Factors, 2010,28(4):232-242.

Expression of Dkk-3 and Cyclin D1 protein in hepatocellular carcinoma and their clinical significance

YAO Nan1, SUN Jing-qiu2, ZHANG Qiong1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofNuclearMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233003,China)

Purpose To investigate the expression of Dkk-3 and Cyclin D1 protein in human hepatocellular carcinoma(HCC) and clinical significance. Methods Immunohistochemistry was used to detect Dkk-3 and Cyclin D1 protein expression level in 80 cases of hepatocellular carcinoma and corresponding para-cancer tissue. Results The expression of Dkk-3 in hepatocellular carcinoma was significantly lower than those in corresponding para-cancer tissue (P<0.05) and the expression of Cyclin D1 in hepatocellular carcinoma was significantly higher than those in corresponding para-cancer tissue (P<0.05). The up-regulation of Cyclin D1 and the down-regulation of Dkk-3 proteins were correlated with pathologic differentiation degree (P<0.05). There was a significant inverse correlation between Dkk-3 and Cyclin D1 expression (P=0.044,rs=-0.226). Conclusion The abnormal expression of Dkk-3 and Cyclin D1 gene in human hepatocellular carcinoma suggest that Dkk-3 and Cyclin D1 gene may play an important role in the development and progression of the cancer. The combination detection of the two biomarkers may provide valuable data for diagnosis and prognosis estimation of HCC.

hepatocellular neoplasms; Dkk-3; Cyclin D1; immunohistochemistry

時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.020.html

蚌埠醫(yī)學(xué)院校級課題基金(Byky1316)

安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1病理科、2核醫(yī)學(xué)科， 蚌埠 233003

姚 楠，女，講師。E-mail: yaonan1979@126.com

R 735.7

A

1001-7399(2017)02-0158-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.009

接受日期：2016-11-22