楊 然 陳天兵 黃 俊 石文俊 區(qū)淑青 伊珍珍

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室, 廣州 510631)

尖毛蟲屬Actin Ⅰ、α-TBP和DNA pol α亂序基因的模式研究

楊 然 陳天兵 黃 俊 石文俊 區(qū)淑青 伊珍珍

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室, 廣州 510631)

研究旨在對尖毛蟲屬內(nèi)現(xiàn)有物種的3種亂序小核基因結(jié)構(gòu)進行比較, 探討其亂序模式。于湛江湖光紅樹林水域中采集到一個尖毛蟲屬物種Oxytricha sp. (ZJ), 成功擴增了其肌動蛋白Ⅰ(ActinⅠ)、端粒結(jié)合蛋白(α-TBP)、DNA聚合酶α (DNA pol α)3個亂序基因的完整大核基因序列和完整/部分小核基因序列, 并結(jié)合已有資料對比研究了尖毛蟲屬這3個亂序基因的進化。結(jié)果表明: (1) Oxytricha sp. (ZJ)與O. nova的小核Actin Ⅰ基因具有相同的亂序模式, 區(qū)別于其余的尖毛蟲屬物種; 在增加尖毛蟲屬物種的基礎(chǔ)上, 對前人推測提出了質(zhì)疑,我們認為MDS-IES接合處移動現(xiàn)象在亂序MDSs之間并非比非亂序MDSs之間更保守。(2) Oxytricha sp. (ZJ)與O. nova的小核α-TBP基因具有相同亂序模式和相似長度的IESs。(3) Oxytricha sp. (ZJ)的小核DNA pol α基因亂序模式, 區(qū)別于任一已報道物種, 與屬內(nèi)O. trifallax最為相近?；谛蛄蟹治? 在DNA pol α基因中發(fā)現(xiàn)了一例IES轉(zhuǎn)換為MDS的痕跡, 以及由此導(dǎo)致原先MDS的丟失。研究發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)內(nèi)IES向MDS的轉(zhuǎn)變, 使得本應(yīng)刪除的序列成為基因組永久保留的一部分。

尖毛蟲; 亂序基因; 大核命運序列; 內(nèi)部刪除序列; 肌動蛋白Ⅰ型; 端粒結(jié)合蛋白; DNA聚合酶α

纖毛蟲原生動物具有二型核, 小核基因通常被內(nèi)部刪除序列(Internal eliminated sequences, IESs)分隔成多個大核命運序列(Macronucleus destined sequences, MDSs)片段。在接合生殖過程中, 通過小核IESs的刪除和MDSs的重組連接、端粒序列的生成和基因的高度擴增等過程形成具功能的大核基因[1—5]。染色體重排廣泛存在于3種纖毛蟲類群中: Armophorea、旋唇綱Spirotrichea、層咽綱Phyllopharyngea[6], 許多小核基因MDSs的排列順序會發(fā)生變化, 形成亂序基因。其中在旋唇綱腹毛類纖毛蟲中該現(xiàn)象尤為明顯, 例如尖毛蟲(Oxytricha)和棘尾蟲(Stylonychia)中分別有96%和98%的小核基因組序列在小核發(fā)育成大核的過程中被刪除[7]。

在腹毛類纖毛蟲中, 有3種亂序基因為人們熟知, 分別為肌動蛋白Ⅰ型(Actin Ⅰ)[1]、端粒結(jié)合蛋白(α-TBP)[8]及DNA聚合酶α (DNA polymerase α)[9]。目前已報道10個物種12個種群的小核Actin Ⅰ基因序列[4,1,10—14]、6個物種的小核α-TBP基因[8,15,16]、7個物種的小核DNA pol α基因[9,17—20]。Hogan等[12]推測了腹毛類纖毛蟲小核Actin Ⅰ基因的進化路線,從共同的原始祖先到3個MDSs的Urostyla grandis,進化為擁有4個MDSs的Engelmanniella mobilis, MDS2發(fā)生倒置, 再進化為擁有8個MDSs的Stylonychia lemnae, 然后分化為兩個分支, 一支為3個尖毛蟲類群, 一支為S. pustulata和Oxytricha sp. (Misty)。之后, Chen等[21]在成功擴增2種尾柱目纖毛蟲大小核Actin Ⅰ基因的基礎(chǔ)上, 將腹毛類小核Actin Ⅰ進化路線進一步修正, 提出腹毛類不同目之間可能存在不同的進化路線。Wong等[16]推測了α-TBP基因可能的進化路線, 認為祖先類群為非亂序物種(Holosticha sp.), 歷經(jīng)亂序排列的Uroleptus sp.、Paraurostyla weissei, 進化為中間MDS發(fā)生易位的O. trifallax, 再經(jīng)歷兩個MDSs發(fā)生融合(如O. nova/S. mytilus)。DNA pol α的進化路線尚未有人給出。綜上,已報道的腹毛類3種亂序基因進化路線僅為較為粗略的大致框架, 細節(jié)部分依然亟待修訂和補充。

本研究在湛江湖光紅樹林水域中采集得到一個腹毛類尖毛蟲物種Oxytricha sp. (ZJ)。通過測定O. sp. (ZJ)大、小核的Actin Ⅰ、α-TBP和DNA pol α基因序列, 并對尖毛蟲屬內(nèi)現(xiàn)有物種3個亂序的小核基因結(jié)構(gòu)進行比較, 探討尖毛蟲屬基因亂序模式,增加人們對相關(guān)基因進化的認識。

1 材料與方法

1.1 樣品與DNA提取

Oxytricha sp. (ZJ)于2010年11月采自湛江湖光紅樹林水域(東經(jīng)109°40′—110°35′, 北緯20°14′—21°35′), 鏡檢后分離[22]。于5‰人工海水中投入米粒滋生細菌, 進行單克隆培養(yǎng)。至大量繁殖階段,篩絹過濾除去大的雜質(zhì)后, 5000 r/min, 3min離心富集蟲體。DNA提取按照伊珍珍等[23]改良的Qiagen Dneasy Blood & Tissue Kit試劑盒使用方法操作。電泳檢測完整性, 微量核酸測量儀檢測其濃度。

1.2 PCR擴增與測定

大核Actin Ⅰ基因序列的獲得利用引物Actin800F和Actin800R1[18](表 1)獲得約800 bp的大核Actin Ⅰ基因片段。PCR反應(yīng)總體系為50 μL, 包括去離子水36 μL, 10×Ex buffer 5 μL, dNTP mix (2.5 mmol/L) 5 μL, 模板2 μL, 正向反向引物(25 mmol/L)各0.8 μL, Ex Taq (5 U/μL) 0.4 μL。PCR擴增程序如下: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s, 52℃退火30s, 72℃延伸1min, 擴增35個循環(huán); 72℃終延伸10min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 切膠, 用Universal DNA Purification Kit試劑盒回收純化, 購自天根生化科技(北京)有限公司, 連接至pMD18-T載體(TaKaRa,日本), 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞, 挑選5個陽性克隆后, 送美吉公司雙向測序, 測序引物為M13F-47與M13R-48。

表 1 大、小核Actin Ⅰ 基因所用引物名稱及序列Tab. 1 The name and sequence of primers for macro- and micronuclear Actin Ⅰ gene

基于上述獲得的序列設(shè)計引物J-F (1203)、JM3F1、J-M3F2 (表 1)。利用Chang等[19]建立的端粒抑制PCR (TSP-PCR)擴增。分別以AP12 (表 1)/ Actin800R1、Actin800F/AP12、J-M3F1/AP12為上下游引物進行第一輪PCR, 擴增條件為: 94℃ 2min, 72℃ 4min, 重復(fù)7個循環(huán), 再94℃ 2min, 67℃ 4min,重復(fù)32個循環(huán), 然后67℃ 4min。再分別以AP1 (表1)/Actin800R1、Actin800F/AP1、J-M3F1/AP1為上下游引物做第二輪巢式P C R, A P 2 (表1)/Actin800R1、J-F (1203)/AP2、J-M3F2/AP2為上下游引物做第三輪巢式PCR。擴增條件為: 94℃25s, 72℃ 4min, 重復(fù)5個循環(huán), 再94℃ 25s, 67℃4min, 重復(fù)20個循環(huán), 然后67℃ 4min。連續(xù)3輪PCR, 獲得基因左端序列片段AP2/Actin800R1和右端序列J-F (1203)/AP2以及J-M3F2/AP2。擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、轉(zhuǎn)化、克隆測序, 拼接得到大核基因序列全長, 并提交至G e n B a n k, 登錄號為KX602204。

小核Actin Ⅰ基因序列的獲得根據(jù)已報道Oxytricha屬的小核Actin Ⅰ基因亂序結(jié)構(gòu), 在推測出的亂序區(qū)MDS3/4和MDS1上分別設(shè)計上、下游引物, J-F (673)(表 2)和J-(133RC)(表 2), 使用巢式PCR和降落PCR擴增(95℃預(yù)變性5min, 95℃變性30s, 67℃退火30s, 之后退火溫度依次降低1℃, 72℃延伸2min, 擴增15個循環(huán); 95℃變性30s, 52℃30s, 72℃延伸2min, 擴增30個循環(huán); 72℃終延伸10min)。得到目的條帶。切膠回收、轉(zhuǎn)化、克隆測序, 獲得小核部分基因片段。

在已獲得的小核基因序列的基礎(chǔ)上設(shè)計多條引物J-M9F、J-F (42)、J-M8R、J-I1F、J-I2F、J-R (1550)(表 1)。再分別以J-M9F/J-M8R、J-M3F1/J-(133RC)、J-I1F/J-M8R為上下游引物進行首輪PCR, J-F (42)/J-M8R、J-M3F2/J-R (1550)、J-I2F/JM8R進行巢式PCR, 擴增得到片段J-F (42)/J-M8R、J-M3F2/J-R (1550)、J-I2F/J-M8R。覆蓋小核基因全長。拼接獲得小核基因序列全長(圖 1), 并提交至GenBank, 登錄號為KX602205。

表 2 大、小核α-TBP基因所用引物名稱及序列Tab. 2 The name and sequence of primers for macro- and micronuclear α-TBP gene

大、小核α-TBP基因序列的獲得根據(jù)上文描述的方法測定Oxytricha sp. (ZJ)的α-TBP基因的完整大核序列。大核擴增所用引物為αTBP-F、αTBP-R、J-R2、J-R1、J-M5F1、J-M5F2 (表 2)。小核所用引物為J-M2R、J-M1F1、J-M1F2、J-I4R、JM9F、J-M8F1、J-M8F2、J-M11F、J-M10R、J-I9F、J-R (2133)、J-I13R2 (表 2、圖 2), 并提交至Gen-Bank, 大核基因登錄號為KX602208, 小核基因為KX602209。

大、小核DNA pol α基因序列的獲得基于上文描述的方式獲得Oxytricha sp. (ZJ)的DNA pol α基因完整的大核序列。引物為Pol α-F、Pol α-R、 J-R2 (DPα)、J-R1 (DPα)、J-F3 (DPα)、J-F4 (DPα) (表 3), 得到DNA pol α基因完整的大核序列。

因在DNA pol α基因小核序列擴增時, 擴增結(jié)果均為大、小核基因序列的嵌合體, 故只獲得部分序列。所用引物為J-M32F、J-M1R1、J-M1R2。JL1F、J-R5R、J-R6R、J-R9R、J-5000R、J-5100R (表 3、圖 3), 并提交至GenBank, 大核基因登錄號為KX602206, 小核基因為KX602207。

大核Actin Ⅰ基因系統(tǒng)樹的構(gòu)建因為已完成大核α-TBP基因和DNA pol α基因測序的尖毛蟲物種數(shù)目太少(僅3種), 故而只依據(jù)Actin Ⅰ基因序列構(gòu)建系統(tǒng)樹。除本工作測得序列(序列號為: KX-602204)外, 另外7條序列源于Genbank數(shù)據(jù)庫(序列號為: U63567、AF508049、AF508050、AY044839、U18940、U63566、M22480)。使用Bioedit7.1.9.0[24]內(nèi)置Clustal進行多序列比對, 序列末端截平, 并手動調(diào)整刪除空格或比對模糊序列。本工作使用Mr-Modeltest 2[25]進行核酸模型篩選GTR+G+I, 使用MrBayes3.1.2[26]構(gòu)建了貝葉斯樹(Bayesian inference, BI)。用馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法(MCMC)設(shè)置為4條鏈, 運行1000000代, 每100代進行抽樣,以后驗概率來表示各分支的可信性。TreeView v5.1.2[27]、MEGA7[28]等軟件用于樹形圖的美化。

2 結(jié)果

2.1 Oxytricha sp. (ZJ)的大、小核Actin Ⅰ基因結(jié)構(gòu)特征

Oxytricha sp. (ZJ)的大核Actin Ⅰ基因全長為1546 bp (含端粒序列)。含有編碼375個氨基酸的開放閱讀框(ORF), 其AT含量為53.81%。5′和3′非編碼區(qū)的序列長度分別為198 bp (含20 bp端粒序列)和226 bp (含20 bp端粒序列), AT含量分別為73.71%和62.87%。5個陽性菌斑測序累計檢測到59個堿基變異位點, 其中ORF含有38個堿基變異位點, 涉及12個氨基酸的差異, 未引起移碼突變或無義突變。剩余的堿基變異位點, 有5個位于5′非編碼區(qū), 16個位于3′非編碼區(qū)。推測多克隆間序列差異是由于基因重復(fù)現(xiàn)象引起[29]。

圖 1 Oxytricha sp. (ZJ)大、小核Actin Ⅰ基因結(jié)構(gòu)、引物位置及獲得的PCR產(chǎn)物示意圖Fig. 1 Schematic illustration of macro- and micronuclear structures, PCR primer locations and products obtained in Oxytricha sp. (ZJ) Actin Ⅰ gene灰色方塊代表MDSs, 黑色方塊代表IESs; 其中MDS2倒置; 白色方塊代表未得到的基因區(qū)域, 下同MDSs are represented in grey, IESs are represented in black; MDS2 is inverted; white box represents unavailable gene regim; the same applies below

表 3 大、小核DNA pol α基因所用引物名稱及序列Tab. 3 The name and sequence of primers for macro- and micronuclear DNA pol α gene

Oxytricha sp. (ZJ)的小核Actin Ⅰ基因序列長度為1775 bp。通過與大核序列比對確定該小核基因由8個IESs和9個MDSs組成。IESs序列長度為11—79 bp, MDSs序列長度為19—583 bp。MDS/IES交接處有5—13 bp的指針重復(fù)序列。8個IESs均為富含AT的序列(68.00%—100.00%)(表 4)。MDSs按照3-4-6-5-7-9-2-1-8的順序排列, 其中MDS2為倒置排列(圖 1)。

基于尖毛蟲屬內(nèi)8個物種的大核Actin Ⅰ基因序列建的貝葉斯樹(圖 4a)中, Oxytricha trifallax、O. fallax與O. granulifera以最高置信值聚為一支,其余5個物種O. longa、O. sp. (Misty)、O. nova、O. sp. (Aspen)、O. sp. (ZJ)聚為一支。

2.2 Oxytricha sp. (ZJ)的大、小核α-TBP基因結(jié)構(gòu)特征

Oxytricha sp. (ZJ)的大核α-TBP基因全長為2140 bp。含有編碼495個氨基酸的ORF, 其AT含量為53.56%。5′和3′非編碼區(qū)的序列長度分別為170 bp (含20 bp端粒序列)和438 bp (含20 bp端粒序列), AT含量分別為74.83%和66.50%。通過與前人數(shù)據(jù)[22]比較, 找到一個長度為53 bp、富含AT (77.36%)的內(nèi)含子序列。5個陽性克隆測序累計檢測到107個堿基變異位點, 其中ORF含有49個堿基變異位點,涉及19個氨基酸的差異, 未引起移碼突變或無義突變。剩余的堿基變異位點, 有2個位于5′非編碼區(qū), 53個位于3′非編碼區(qū), 3個位于內(nèi)含子。

圖 2 Oxytricha sp. (ZJ)大、小核α-TBP基因結(jié)構(gòu)、引物位置及獲得的PCR產(chǎn)物示意圖Fig. 2 Schematic illustration of macro- and micronuclear structures, PCR primer locations and products obtained in Oxytricha sp. (ZJ) α-TBP gene

圖 3 Oxytricha sp. (ZJ)大、小核DNA pol α基因結(jié)構(gòu)、引物位置及獲得的PCR產(chǎn)物示意圖Fig. 3 Schematic illustration of macro- and micronuclear structures, PCR primer locations and products obtained in Oxytricha sp. (ZJ) DNA pol α gene

表 4 Oxytricha sp. (ZJ)小核Actin Ⅰ基因的MDSs、IESs及指針序列Tab. 4 Characteristics of MDSs, IESs, and pointer sequences in Oxytricha sp. (ZJ) Actin Ⅰ gene

圖 4 基于Actin Ⅰ基因序列構(gòu)建的貝葉斯樹(a)與Actin Ⅰ基因結(jié)構(gòu)進化路線圖(b)Fig. 4 Baysian trees based on the sequences of Actin Ⅰ gene (a), and evolutionary route map of Actin Ⅰ gene structure (b)

Oxytricha sp. (ZJ)小核α-TBP基因序列長度為2562 bp。通過與大核序列比對確定該小核基因由13個IESs和14個MDSs組成。IESs序列長度為16—71 bp, MDSs序列長度為13—731 bp。在MDS/IES交接處有5—11 bp的指針重復(fù)序列。13個IESs中,除MDS1/MDS3間的AT含量較低外(52.38%), 其他12個IESs均為富含AT序列(62.50%—87.32%)(表5)。MDSs按照1-3-5-7-9-11-2-4-6-8-10-12-13-14的順序排列, 標號為奇數(shù)的MDSs與標號為偶數(shù)的MDSs各自簇集在一起(圖 2)。

2.3 Oxytricha sp. (ZJ)的大、小核DNA pol α基因結(jié)構(gòu)特征

Oxytricha sp. (ZJ)大核DNA pol α基因全長為5118 bp。含有編碼1534個氨基酸的ORF, 其AT含量約為62.15%。含兩個長度分別為96 bp (intron-1)和49 bp (intron-2)的內(nèi)含子, AT含量分別為71.88%和69.39%。5′和3′非編碼區(qū)的序列長度分別為158 bp (含20 bp端粒序列)和216 bp (含20 bp端粒序列), AT含量分別為71.85%和74.09%。5個陽性克隆測序累計檢測到205個堿基變異位點, 其中ORF含有184個堿基變異位點, 涉及39個氨基酸的差異, 未引起移碼突變或無義突變。剩余的堿基變異位點, 有5個位于5′非編碼區(qū), 5個位于3′非編碼區(qū), 8個位于intron-1, 3個位于intron-2。

已獲得Oxytricha sp. (ZJ)的小核DNA pol α基因片段長度為2068 bp。包括15個富含AT序列(62.50%—90.91%)的IESs, 14個包含兩端指針序列的完整MDSs (5-7-9-11-13-15-17-19-21-23-25-27-29-30)(表 6), 以及2個MDSs (2和32)的部分區(qū)域。并由此確定了另13個MDSs (1-6-8-10-12-14-16-18-20-22-24-26-28)的位置(不包含指針序列), 指針序列只能在相連的3個MDSs (29-30-31)間被確定出來(圖 3)。

3 討論

3.1 尖毛蟲屬小核Actin Ⅰ基因的亂序模式

Actin Ⅰ基因是腹毛類纖毛蟲中最早發(fā)現(xiàn)的亂序基因[4]。目前尖毛蟲屬已知小核Actin Ⅰ基因結(jié)構(gòu)的物種共包括5個: Oxytricha trifallax、O. nova、O. fallax、O. sp. (Aspen)、O. sp. (Misty)。根據(jù)Hogan等[12]推測的腹毛類小核Actin Ⅰ基因結(jié)構(gòu)進化路線, 尖毛蟲屬內(nèi)小核Actin Ⅰ基因亂序模式分為兩種情況: O. sp. (Misty)與Stylonychia pustu-lata擁有較為相似的模式(模式1); O. trifallax、O. nova、O. sp. (Aspen)模式(模式2)相近。而之后報道的O. fallax與我們新測序的O. sp. (ZJ)模式可歸入模式2。

表 5 Oxytricha sp. (ZJ)小核α-TBP基因的MDSsIESs及指針序列Tab. 5 Characteristics of MDSs, IESs, and pointer sequences in Oxytricha sp. (ZJ) α-TBP gene

表 6 Oxytricha sp. (ZJ)小核DNA pol α 基因片段MDSs, IESs及指針序列Tab. 6 Characteristics of MDSs, IESs, and pointer sequences in Oxytricha sp. (ZJ) DNA pol α gene segment

尖毛蟲屬內(nèi)小核Actin Ⅰ基因亂序模式2所涉及的5個物種可以分為2種情況: (1) Oxytricha fallax與O. trifallax兩個種群Actin Ⅰ的小核基因亂序模式均為3-4-6-5-7-9-10-2-1-8 (模式2.1)。DuBois和Prescott等[12]將三者視為O. trifallax-O. fallax群組,代表了一個單一種。(2) O. sp. (ZJ)小核Actin Ⅰ基因由8個IESs和9個MDSs組成, 同屬內(nèi)的O. nova在組成數(shù)目上完全相同, 且2個物種的MDSs排列順序均為3-4-6-5-7-9-2-1-8 (模式2.2)[1], 比模式2.1少了長的IES6與非常短的MDS10。O. sp. (Aspen)[11]僅有部分小核Actin Ⅰ基因完成測序, Hogan等[12]推測其亂序模式與O. nova (模式2.2)相似, 鑒于數(shù)據(jù)的不完整性, 在此我們不做詳細討論。

對比基于大核Actin Ⅰ基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(圖 4a)與小核Actin Ⅰ基因結(jié)構(gòu)進化路線(圖 4b)可以看出, 二者存在一定的相似之處, 但卻不完全相同。在圖 4a中作為姐妹枝出現(xiàn)的Oxytricha fallax與O. trifallax的小核Actin Ⅰ亂序模式均為2.1, 擁有10個MDSs (圖 4b)。但是, 在大核Actin Ⅰ基因系統(tǒng)樹中(圖 4a), 同屬于小核Actin Ⅰ亂序模式2.2 (圖 4b)的3個物種O. nova、O. sp. (Aspen)、O. sp. (ZJ)并未聚在一起。這表明, 大小核Actin Ⅰ基因進化路線并不完全一致。

模式2.1、2.2之間, 在IESs的長度方面均具有較大差異。在模式2.1中, Oxytricha trifallax的IESs長度為19—276 bp[10]; 而在模式2.2中, O. sp. (ZJ)和O. nova的IESs長度分別是11—79 bp (本研究)、11—109 bp[4]。這符合前人的推測: 由于IESs的快速進化與易變性, 在進化過程中其長度也發(fā)生了改變, 而小核Actin Ⅰ基因進化過程中, IESs的長度比其序列更為保守[15]。憑IESs的序列很難推斷進化的圖式。

在模式2.1中, Oxytricha trifallax的指針序列長度為2—14 bp[11]; 而在模式2.2中, O. nova和O. sp. (ZJ)的指針序列長度范圍較為接近, 分別為5—13 bp[4]和4—13 bp (表 4)。但相同亂序模式的物種指針序列并未發(fā)現(xiàn)具有更多序列相似性。

MDSs在進化的過程中存在MIJ (MDS-IES junctions)移動現(xiàn)象[10,15,16,20], 這種移動通常在有限范圍之內(nèi)。DuBois等[10]提出, 亂序MDSs之間的MIJ移動比非亂序MDSs之間的更保守, 移動距離更短。在本研究中(圖 5), 我們得出不同結(jié)論。對比模式2.2 O. sp. (ZJ)與O. nova發(fā)生的MIJ移動, 亂序MDSs之間移動最大達79 bp (MDS7-MDS9), 唯一的非亂序MDSs (MDS3-MDS4)之間為161 bp, 符合前人推測, 亂序MDSs之間的MIJ移動更為保守。而對比模式2.1的O. trifallax與模式2.2的O. sp. (ZJ), 亂序MDSs之間MIJ的移動范圍為12—66 bp, 非亂序MDS3/4的對應(yīng)邊緣卻相對保守, 僅相差23 bp, 由此可見MIJ移動距離與MDSs是否亂序并無直接關(guān)系,預(yù)示著DuBois等[10]的觀點并不具有通用性。有意思的是, 非亂序MDS3/MDS4之間的MIJ移動距離,同為模式2.2的O. sp. (ZJ)與O. nova之間移動距離為161 bp, 不同模式的O. trifallax與O. nova之間移動距離為138 bp[15], 而不同模式的O. trifallax與O. sp. (ZJ)之間移動距離為23 bp。我們推測祖先種的小核Actin Ⅰ基因在MDS3-4對應(yīng)區(qū)域具有兩個IESs和3個MDSs, 在O. nova (模式2.2)進化過程中丟失了前一個IES, 在O. trifallax (模式2.1)和O. sp. (ZJ)(模式2.2)分別的進化過程中丟失了后一個IES, 最終3個物種均在該區(qū)域保留了2個MDSs和1個IES, 造成了上述MIJ移動距離的差距。因此, 我們贊成DuBois等[10]的觀點, 認為MDS3/4之間MIJ移動可能是由于IES的插入/缺失造成的。由于MIJ移動距離較大, 我們不贊成是指針序列的突變[15,16]造成此MIJ移動。同時我們注意到屬于同一亂序模式2.2的兩個物種[O. nova和O. sp. (ZJ)]并未按照同樣模式保留或缺失IESs, 該現(xiàn)象有待我們進一步研究。

3.2 尖毛蟲屬小核α-TBP基因的亂序模式

目前尖毛蟲屬已知小核α-TBP基因結(jié)構(gòu)的物種共包括2個: Oxytricha trifallax、O. nova。我們的研究表明, O. sp. (ZJ)小核α-TBP基因由13個IESs和14個MDSs組成, 與同屬的O. nova一致[8], 說明在這兩個種分化過程中該小核基因沒有發(fā)生新的MDS片段的重組或易位。與之相對比, O. trifallax多了位于非亂序區(qū)的3個MDSs和3個IESs[15](圖 2)。猜測這兩種不同的模式是由于IES的插入/丟失造成。O. sp. (ZJ)與O. nova的MDSs排列模式為1-3-5-7-9-11-2-4-6-8-10-12-13-14[8]; 而O. trifallax排列模式為1-3-5-7-10-12-2-4-6-8-9-11-13-14-15-16-17[15]。O. sp. (ZJ)、O. nova中的MDS8、MDS13-14分別與O. trifallax中的MDS8-9、MDS14-17同源(圖 6)。

Oxytricha sp. (ZJ)、O. nova的IESs數(shù)目均為13個, 二者的長度差別不大, 分別為16—71 bp、11—55 bp; 而O. trifallax的IESs數(shù)目為16個, 長度為5—108 bp[15]。O. sp. (ZJ)和O. nova中的IESs10, 11, 12與O. trifallax中的IESs11, 12, 13相對應(yīng)。與小核Actin Ⅰ的結(jié)果相似, O. sp. (ZJ)與O. nova具有同樣α-TBP基因亂序模式, 且IESs的長度較為一致, O. sp. (ZJ)、O. nova、O. trifallax的IES平均長度分別為33、26和35 bp。O. sp. (ZJ)(16 bp)和O. nova (8 bp)最短的IES是IES5, 而O. trifallax最短的為IES9 (5 bp)[8,15]。由此可見, IESs的長度、數(shù)目具有物種特異性。

模式2.1的Oxytricha trifallax指針序列長度為7—17 bp[15], 模式2.2的O. nova和O. sp. (ZJ)的指針序列長度分別為為3—19 bp[8]、5—11 bp (表 5), 長度范圍差異大。相同亂序模式的物種指針序列并未發(fā)現(xiàn)具有更多序列相似性。

圖 5 Oxytricha sp. (ZJ)、O. nova和O. trifallax大、小核Actin Ⅰ基因結(jié)構(gòu)模式圖(參照DuBois 等, 1995[10])Fig. 5 Schematic illustration of macro- and micronuclear Actin Ⅰ gene structures of Oxytricha sp. (ZJ), O. nova and O. trifallax (reference DuBois, et al., 1995[10])梯形代表端粒, 黑色圓點代表起始密碼子與終止密碼子Ladder represent telomeres, black dots mark the pointer of start and stop codons

圖 6 Oxytricha sp. (ZJ)、O. nova和O. trifallax大、小核α-TBP基因結(jié)構(gòu)模式圖(參照Prescott 等, 1998[15])Fig. 6 Schematic illustration of macro- and micronuclear α-TBP gene structures of Oxytricha sp. (ZJ), O. nova and O. trifallax (reference Prescott, et al., 1998[15])

3.3 尖毛蟲屬小核DNA pol α基因的亂序模式

與小核Actin Ⅰ和α-TBP基因相比, DNA pol α基因亂序程度更為復(fù)雜, 基因序列更長, 亂序模式為非隨機排列[9]。目前, 尖毛蟲屬已知小核DNA pol α基因結(jié)構(gòu)的物種共包括2個: Oxytricha trifallax、O. nova。我們的研究未能獲取O. sp. (ZJ)的小核DNA pol α基因全長。根據(jù)擴增出的O. sp. (ZJ)小核DNA pol α基因部分序列, 我們確定出14個完整MDSs (排列模式為5-7-9-11-13-15-17-19-21-23-25-27-29-30), 并推測出未擴增成功的16個MDSs (MDSs1-2、偶數(shù)MDSs6-28、MDSs31-32)的位置,同時推測MDS3與MDS4可能丟失。O. trifallax包含至少51個MDSs和50個IESs[17], O. nova包含至少45個MDSs和44個IESs[9]。通過比對分析(圖 7),我們發(fā)現(xiàn)O. sp. (ZJ)含有3個非亂序排列的MDSs,分別是MDS29、MDS30、MDS31, 而在O. trifallax和O. nova中分別是9個和7個非亂序排列的MDSs[17]。

模式2.1的Oxytricha trifallax指針序列長度為2—15 bp[17], 模式2.2的O. nova指針序列長度為2—16 bp[9]。本研究中未獲得O. sp. (ZJ)的DNA pol α基因序列全長, 很多指針序列無法推測(表 6), 故而本研究未對該基因不同物種間指針序列進行對比。

我們確定出的Oxytricha sp. (ZJ)小核DNA pol α基因的14個完整MDSs位于倒置區(qū)域。O. sp. (ZJ)的MDS7對應(yīng)O. nova的MDS6, 與O. trifallax的MDS7-8-9同源, 并且MDS8在O. trifallax的小核基因主體部分中是缺失的[17]。據(jù)此合理推斷是: (1)此區(qū)域由3個MDSs組成, 且中間MDS的缺失代表了祖先種的基因結(jié)構(gòu)特征。O. trifallax從祖先種分離時保留了該結(jié)構(gòu)特征。而在O. sp. (ZJ)和O. nova分化前的進化過程中將3個MDSs融合成了一個MDS。(2)為第一種可能的反向進程, 即祖先種在此區(qū)域為一個MDS結(jié)構(gòu), 而在O. trifallax從祖先種分化時, 獨立的發(fā)生了一次重組將中間的部分轉(zhuǎn)離了小核基因的主體部分, 類似移位現(xiàn)象, 使得一個MDS變成了3個MDSs。之前Wong等[16]的研究表明, 在種系分離自共同祖先后, 獨立發(fā)生編碼區(qū)域的重新劃分和融合。

因Oxytricha sp. (ZJ)的MDS7與O. trifallax的MDS7-8-9同源, 且O. trifallax在此處的IES與O. sp. (ZJ)的MDS7對應(yīng)區(qū)域的序列完全一致(圖 8), 表明在O. sp. (ZJ)的進化過程中可能將該IES同化成了MDS的一部分, 即發(fā)生IES向MDS的轉(zhuǎn)換, 伴隨此種轉(zhuǎn)換, 使得原先3個MDSs融合成了一個MDS, 而原先位于中間的MDS被丟棄。這個轉(zhuǎn)換過程呈現(xiàn)出腹毛類纖毛蟲小核基因在進化過程中方式的多樣性。這支持了上述第一種解釋, 即在O. sp. (ZJ)和O. nova分化前的進化過程中將3個MDSs融合成了一個MDS。Duharcourt等[30]在Paramecium中與Chalker與Yao[31]在Tetrahymena中都發(fā)現(xiàn)了舊大核的IESs在新大核中的保留現(xiàn)象。而Mollenbeck等[19]通過比較Stylonychia lemnae兩種群的小核Actin Ⅰ基因發(fā)現(xiàn), 發(fā)現(xiàn)IES向MDS轉(zhuǎn)變的跡象, 但這種轉(zhuǎn)變發(fā)生在非編碼區(qū), 未對基因的開放閱讀框造成影響。本實驗則發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)內(nèi)IES向MDS的轉(zhuǎn)變, 使得本應(yīng)刪除的序列成為基因組永久保留的一部分。

圖 7 Oxytricha sp. (ZJ)、O. nova和O. trifallax大、小核DNA pol α基因片段結(jié)構(gòu)示意圖(參照Hoffman 等, 1997[17])Fig. 7 Schematic illustration of macro- and micronuclear DNA pol α gene structures of Oxytricha sp. (ZJ), O. nova and O. trifallax (reference Hoffman, et al., 1997[17])

圖 8 Oxytricha sp. (ZJ)進化過程中IES向MDS的轉(zhuǎn)變Fig. 8 IES to MDS transformation during Oxytricha sp. (ZJ) evolution

[1]Prescott D M, Greslin A F. Scrambled Actin Ⅰ gene in the micronucleus of Oxytricha nova [J]. Developmental Genetics, 1992, 13(1): 66—74

[2]Curtis E A, Landweber L F. Evolution of gene scrambling in ciliate micronuclear genes [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1999, 870: 349—350

[3]Nowacki M, Landweber L F. Epigenetic inheritance in ciliates [J]. Current Opinion in Microbiology, 2009, 12(6): 638—643

[4]Greslin A F, Prescott D M, Oka Y, et al. Reordering of nine exons is necessary to form a functional actin gene in Oxytricha nova [J]. Genetics, 1989, 86(16): 6264—6268

[5]Prescott D M. Genome gymnastics: unique modes of DNA evolution and processing in ciliates [J]. Nature Reviews Genetics, 2000, 1(3): 191—198

[6]Katz L A, KovnerA M. Alternative processing of scrambled genes generates protein diversity in the ciliate Chilodonella uncinata [J]. Journal of Experimental Zoology Part B Molecular and Developmental Evolution, 2010, 314(6): 480—488

[7]Lauth M R, Spear B B, Heumann J, et al. DNA of ciliated protozoa: DNA sequence diminution during macronuclear development of Oxytricha [J]. Cell, 1976, 7(1): 67—74

[8]Mitcham J L, Lynn A J, Prescott D M. Analysis of a scrambled gene: the gene encoding α-telomere-binding protein in Oxytricha nova [J]. Genes & Development, 1992, 6(5): 788—800

[9]Hoffman D C, Prescott D M. The germline gene encoding DNA polymerase α in the hypotrichous ciliate Oxytricha nova is extremely scrambled [J]. Nucleic Acids Research, 1996, 24(17): 3337—3340

[10]DuBois M L, Prescott D M. Scrambling of the Actin Ⅰgene in two Oxytricha species [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1995, 92(9): 3888—3892

[11]DuBois M L, Prescott D M. Volatility of internal eliminated segments in germ line genes of hypotrichous ciliates [J]. Molecular and Cellular Biology, 1997, 17(1): 326—337

[12]Hogan D J, Hewitt E A, Orr K E, et al. Evolution of IESs and scrambling in the Actin Ⅰ gene in hypotrichous ciliates [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(26): 15101—15106

[13]Dalby A B, Prescott D M. The scrambled Actin Ⅰ gene in Uroleptus pisces [J]. Chromosoma, 2004, 112(5): 247—254

[14]M?llenbeck M, Cavalcanti A R, J?nsson F, et al. Interconversion of germline-limited and somatic DNA in a scrambled gene [J]. Journal of Molecular Evolution, 2006, 63(1): 69—73

[15]Prescott J D, DuBois M L, Prescott D M. Evolution of the scrambled germline gene encoding a-telomere binding protein in three hypotrichous ciliates [J]. Chromosoma, 1998, 107(5): 293—303

[16]Wong L C, Landweber L F. Evolution of programmed DNA rearrangements in a scrambled gene [J]. Molecular Biology and Evolution, 2006, 23(4):756—763

[17]Hoffman D C, Prescott D M. Evolution of internal eliminated segments and scrambling in the micronuclear gene encoding DNA polymerase alpha in two Oxytricha species [J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(10): 1883—1889

[18]Landweber L F, Kuo T C, Curtis E A. Evolution and assembly of an extremely scrambled gene [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(7): 3298—3303

[19]Chang W J, Stover N A, Addis V M, et al. A micronuclear locus containing three protein-coding genes remains linked during macronuclear development in the spirotrichous ciliate Holosticha [J]. Protist, 2004, 155(2): 245—255

[20]Chang W J, Bryson P D, Liang H, et al. The evolutionary origin of a complex scrambled gene [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(42): 15149—15154

[21]Chen T B, Yi Z Z, Huang J, et al. Evolution of the germline Actin gene in hypotrichous ciliates: multiple nonscrambled IESs at extremely conserved locations in two Urostylids [J]. Journal of Eukaryotic Microbiology, 2014, 62(2): 188—195

[22]Swart E C, Bracht J R, Magrini V, et al. The Oxytricha trifallax macronuclear genome: a complex eukaryotic genome with 16,000 tiny chromosomes [J]. PLoS Biology, 2013, 11(1): e1001473

[23]Prescott D M. The evolutionary scrambling and developmental unscrambling of germline genes in hypotrichous ciliates [J]. Nucleic Acids Research, 1999, 27(5): 1243—1250

[24]Hall T A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/ NT [J]. Nucleic Acids Symposium Series, 1999, 41: 95—98

[25]Nylander J A. MrModel test v2. Uppsala University. 2004

[26]Ronquist F, Huelsenbeck J P. MrBayes3: Bayesian phylo-genetie inferenee under mixed models [J]. Bioinformatics, 2003, 19(12): 1572—1574

[27]Page R M. TreeView: An application to view phylogenetic trees on personal computers [J]. Computer Applications in the Biosciences, 1996, 12(4): 357—358

[28]Tamura B K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8): 1596—1599

[29]Yi Z Z, Huang L J, Yang R, et al. Actin evolution in ciliates (Protist, Alveolata) is characterized by high diversity and three duplication events [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2016, 96: 45—54

[30]Duharcourt S, Lepère G, Meyer E. Developmental genome rearrangements in ciliates: a natural genomic subtraction mediated by non-coding transcripts [J]. Trends in Genetics, 2009, 25(8): 344—350

[31]Chalker D L, Yao M C. DNA elimination in ciliates: transposon domestication and genome surveillance [J]. Annual Review of Genetics, 2011, 45: 227—246

EVOLUTION OF THE SCRAMBLED PATTERN OF THE ACTIN Ⅰ, A-TBP AND DNA POL A GENE WITHIN THE GENUS OXYTRICHA (PROTOZOA, CILIATES)

YANG Ran, CHEN Tian-Bing, HUANG Jun, SHI Wen-Jun, OU Shu-Qing and YI Zhen-Zhen
(Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring, School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Genes in the germline (micronuclear) genome of protozoan ciliates are interrupted by multiple, non-coding sequences called internal eliminated segments (IESs) and macronuclear destined segments (MDSs). In the micronucleus, the MDSs are not arranged sequentially but scrambled for some genes. Studying scrambled gene structures will provide a better understanding of the molecular mechanisms of its evolution. In this study, we compared the complete macronuclear gene sequences and complete/incomplete micronuclear gene sequences of Actin I, α-telomere-binding protein (α-TBP), and DNA polymerase α (DNA pol α) of Oxytricha species (Oxytricha sp. (ZJ)) collected from water samples of Huguang mangrove in Zhanjiang with those of other Oxytricha species, and had 3 major findings. The scrambled patterns of the micronuclear Actin I gene in O. sp. (ZJ) were similar with those of O. nova, but shown significant differences with other species in genus Oxytricha. We revealed that the shifts of MDS-IES junctions between scrambled MDSs are not more conservative than those between non-scrambled MDSs, which is inconsistent with a previous study. The scrambled pattern of micronuclear α-TBP gene in O. sp. (ZJ) is same with that of O. nova, and the lengths of their IESs of these two species are also similar. The scrambled pattern of micronuclear DNA pol α gene in O. sp. (ZJ) is different from any of the previously reported species, and it is only somewhat similar to O. trifallax. Moreover, an IES transited to MDS was observed in DNA pol α gene, which caused the missing of its original MDS.

Oxytricha; Scramble gene; Macronuclear destined sequences (MDSs); Internal eliminated sequences (IESs); ActinⅠ; α-telomere-binding protein (α-TBP); DNA polymerase α (DNA pol α)

Q344+.1

A

1000-3207(2017)02-0285-11

10.7541/2017.35

2016-04-18;

2016-07-20

國家自然科學(xué)基金面上項目(31471973); 廣東省特支計劃百千萬工程青年拔尖人才項目; 2015年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃華南師范大學(xué)校級項目資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31471973); Special Support Program of Guangdong Province; 2015 SCNU Undergraduate Training Program for Innovation and Entrepreneurship]

楊然(1991—), 女, 山東濟南人; 碩士研究生; 主要從事水生生物分子系統(tǒng)與進化研究。E-mail: yyangran@163.com

伊珍珍(1981—), 女, 山東淄博人; 副研究員, 碩導(dǎo); 主要研究方向為纖毛蟲原生動物分子系統(tǒng)與進化。E-mail: zyi@scnu.edu.cn