劉國(guó)生，李金鑫，劉 磊，谷艷昌，許 航

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.資源微生物與功能分子河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河南 新鄉(xiāng) 453007； 3.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000)

N離子束注入與DES復(fù)合誘變選育腺苷高產(chǎn)菌株

劉國(guó)生1,2，李金鑫1，劉 磊1，谷艷昌3，許 航1

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.資源微生物與功能分子河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河南 新鄉(xiāng) 453007； 3.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000)

為了獲得腺苷高產(chǎn)菌株，以肌苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HSD1206(Ade-、Thi-、SGr)為出發(fā)菌株，通過(guò)硫酸二乙酯(DES)處理、N離子束注入進(jìn)行單因子和復(fù)合誘變。參照菌種致死率曲線，確定N離子束注入250 s與DES處理10 min為最佳誘變時(shí)間。經(jīng)過(guò)多輪誘變和篩選，獲得了黃嘌呤、硫胺素、組氨酸三重缺陷型，腺嘌呤脫氨酶活性缺失及磺胺胍抗性菌株DI4-24和DI4-182，其遺傳標(biāo)記為Xan-、Thi-、His-、Deam-、SGr，連續(xù)傳代后性狀穩(wěn)定，在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵后腺苷產(chǎn)量可分別達(dá)到18.56 g/L和17.13 g/L。由此證明，通過(guò)物理、化學(xué)復(fù)合誘變，阻斷枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株產(chǎn)肌苷途徑，打通合成腺苷途徑的誘變思路在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下是可行的。

腺苷； 枯草芽孢桿菌； 離子束注入； 硫酸二乙酯； 復(fù)合誘變； 黃嘌呤缺陷型

腺苷(adenosine)即腺嘌呤核苷，化學(xué)名為9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，在臨床醫(yī)學(xué)上常被用作血管擴(kuò)張劑，誘導(dǎo)冠脈血管達(dá)到最大舒張狀態(tài)，同時(shí)它是合成多種核苷類藥物如阿糖腺苷、8-氮腺苷、腺苷酸等的醫(yī)藥中間體[1-2]。目前，工業(yè)上采用代謝控制發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷，生產(chǎn)菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株，該菌經(jīng)過(guò)誘變可生產(chǎn)肌苷、鳥苷或腺苷[3]。產(chǎn)腺苷菌株的誘變通常采用單一物理或化學(xué)方法，由于突變譜窄或菌種死亡率高，很難獲得目標(biāo)菌株[4]。N離子束注入誘變育種具有損傷輕、突變率高、突變譜寬、易于獲得理想變異菌株等特點(diǎn)[5-9]，與化學(xué)誘變劑相結(jié)合進(jìn)行復(fù)合誘變處理，能有效地提高正變頻率，更有效地篩選出目的菌株[10-11]。為此，利用產(chǎn)肌苷菌株作為出發(fā)菌株，通過(guò)多重復(fù)合誘變和多輪篩選，選育出具有產(chǎn)腺苷能力且遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，為將來(lái)實(shí)驗(yàn)室育種或工業(yè)化生產(chǎn)提供設(shè)計(jì)思路。

1 材料和方法

1.1 儀器

Titan80離子注入機(jī)由俄羅斯科學(xué)院西伯利亞分院強(qiáng)電研究所生產(chǎn)，1200型高效液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。

1.2 菌株

B.subtilisHSD1206為資源微生物與功能分子河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地選育的肌苷產(chǎn)生菌，其遺傳標(biāo)記為腺嘌呤缺陷型(Ade-)、硫胺素缺陷型(Thi-)、磺胺胍抗性(SGr)，以此為出發(fā)菌株，通過(guò)誘變選育腺苷產(chǎn)生菌；B.subtilisAS106來(lái)自中國(guó)科學(xué)院北京微生物研究所，為野生型菌株，作為對(duì)照菌株，沒有核苷代謝產(chǎn)物。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基及測(cè)量腺苷產(chǎn)量用的發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配制方法參照文獻(xiàn)[12]；完全培養(yǎng)基為加入瓊脂20 g/L的種子培養(yǎng)基；補(bǔ)充培養(yǎng)基為加入相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基本培養(yǎng)基。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液的制備 取在斜面培養(yǎng)基上活化的B.subtilisHSD1206菌種接種于種子培養(yǎng)液，于34 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌液在4 ℃、5 000 r/min條件下離心收集菌細(xì)胞，然后用生理鹽水洗滌細(xì)胞2次并制成菌懸液，菌體濃度調(diào)整到106或108cfu/mL。

1.4.2 N離子束注入誘變處理 取106cfu/mL菌懸液，均勻涂布在光潔培養(yǎng)皿底部，每皿菌懸液用量300 μL，無(wú)菌風(fēng)干；將涂菌平皿置于離子注入機(jī)靶室內(nèi)進(jìn)行誘變處理，處理?xiàng)l件為反射電流30 μA、能量35 keV、真空壓力3×10-3Pa。處理時(shí)間設(shè)為0、40、80、250、583、832 s。不同照射時(shí)間與照射劑量關(guān)系如表1所示。

表1 N離子束照射時(shí)間與照射劑量對(duì)照情況

1.4.3 硫酸二乙酯(DES)誘變處理 取108cfu/mL菌懸液10 mL于250 mL三角瓶中，加入DES溶液使其終質(zhì)量濃度為1 mg/L，在搖床上分別振蕩2、4、6、8、10、12、14、16 min，處理結(jié)束后立即加入250 g/L的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。

1.4.4 復(fù)合誘變 將涂菌平皿進(jìn)行不同時(shí)間離子束照射后，用3 mL生理鹽水洗下平板上的菌細(xì)胞，加入30 μL DES，振蕩溫育不同時(shí)間，處理結(jié)束后立即加入250 g/L的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，稀釋后涂布完全培養(yǎng)基平板篩選突變株。

1.4.5 搖瓶發(fā)酵 將菌種接種于完全培養(yǎng)基試管斜面上，34 ℃培養(yǎng)12 h后，用無(wú)菌接種環(huán)將整個(gè)斜面上長(zhǎng)滿的菌落接種于裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，34 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。

1.4.6 分析方法 腺嘌呤脫氨酶(Deam)和琥珀酰腺苷酸合成酶(SAMP)活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[13-14]；發(fā)酵液中肌苷、腺苷的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變處理時(shí)間的選擇

將B.subtilisHSD1206的涂菌平皿置于離子注入機(jī)靶室內(nèi)，分別進(jìn)行0、40、80、250、583、832 s照射處理，平板菌落法測(cè)定各處理樣品活菌總數(shù)，計(jì)算致死率(圖1)。由圖1可見，隨照射時(shí)間延長(zhǎng)，致死率快速增加，在250 s時(shí)致死率達(dá)到97.8%，照射時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)到583 s、832 s時(shí)致死率不再有明顯增加。

圖1 N離子束注入處理B.subtilisHSD1206的時(shí)間與致死率關(guān)系

將B.subtilisHSD1206菌細(xì)胞用終質(zhì)量濃度為1 mg/L的DES分別處理2、4、6、8、10、12、14、16 min，終止反應(yīng)后測(cè)定各處理樣品活菌總數(shù)，計(jì)算致死率(圖2)。由圖2可見，處理10 min時(shí)致死率達(dá)到92.5%。根據(jù)以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在后續(xù)的誘變處理中，分別采用表2條件進(jìn)行單因子和復(fù)合誘變處理。

圖2 DES處理B.subtilis HSD1206的時(shí)間與致死率關(guān)系

表2 單因子及復(fù)合誘變處理?xiàng)l件

2.2 誘變處理后突變株的篩選

2.2.1 Deam活性缺失突變株的篩選 將誘變處理的菌懸液涂布在完全培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～36 h待其長(zhǎng)出單菌落，用無(wú)菌牙簽依次挑單菌落接種于添加有150 μg/L 8-氮雜鳥嘌呤(8-AG)的完全培養(yǎng)基上，挑選在8-AG平板上不能生長(zhǎng)的菌落。將挑出的菌落依次接種于基本培養(yǎng)基、補(bǔ)充培養(yǎng)基(50 mg/L腺嘌呤、10 mg/L硫胺素)以及含200 μg/L磺胺胍(SG)的完全培養(yǎng)基上，挑選在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)、在補(bǔ)充培養(yǎng)基和SG培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落。將篩選出的菌落培養(yǎng)后，收集細(xì)胞測(cè)定其Deam活性，從中篩選Deam活性很低或無(wú)的菌株。將篩選的菌株連續(xù)5次傳代后，測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性和Deam活性，有3株(D1-3、D1-21、DI1-72)比較符合選種的要求，其酶活性測(cè)定以及發(fā)酵結(jié)果如表3所示。

表3 突變菌株的Deam活性及發(fā)酵產(chǎn)苷情況

注：Deam活性用次黃嘌呤生成量表示。

其中，DI1-72菌株無(wú)Deam活性，進(jìn)入下一輪誘變育種，其遺傳標(biāo)記為Ade-、Thi-、Deam-、SGr。

2.2.2 SAMP活性恢復(fù)突變株的篩選 對(duì)DI1-72菌株進(jìn)行誘變處理后，將細(xì)胞涂布在完全培養(yǎng)基上待菌落長(zhǎng)出，挑單菌落依次接種于基本培養(yǎng)基(含10 mg/L硫胺素)、補(bǔ)充培養(yǎng)基(在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)加50 mg/L腺嘌呤)上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后挑選在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)、在補(bǔ)充培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落。將挑選出的腺嘌呤原養(yǎng)型菌落劃線接種于SG平板和8-AG平板上，根據(jù)生長(zhǎng)情況，淘汰抗性降低或消失的菌落，將篩選得到的菌落純化后測(cè)定其SAMP活性，并連續(xù)傳代5次考察其遺傳穩(wěn)定性及搖瓶發(fā)酵產(chǎn)苷能力。經(jīng)過(guò)篩選得到3株符合要求的突變株(D2-91、I2-121、DI2-527)如表4所示，其遺傳標(biāo)記為Ade+、Thi-、Deam-、SGr，這些菌株幾乎不再產(chǎn)肌苷。其中的D2-91菌株產(chǎn)肌苷途徑被切斷、SAMP活性較高，符合要求，因此進(jìn)入下一輪誘變育種。

表4 SAMP活性恢復(fù)菌株篩選結(jié)果

注：SAMP活性以次黃嘌呤核苷酸(IMP)減少量表示。

2.2.3 黃嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 將D2-91菌細(xì)胞進(jìn)行誘變處理后涂布在完全培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)長(zhǎng)出單菌落后，挑單菌落接種于基本培養(yǎng)基、補(bǔ)充培養(yǎng)基(含50 mg/L黃嘌呤)上，培養(yǎng)后挑選在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)、在補(bǔ)充培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，即為黃嘌呤缺陷型，再通過(guò)檢測(cè)其SG和8-AG抗性、Deam和SAMP活性進(jìn)行復(fù)篩，選出5株符合要求的突變株(D3-52、DI3-243、DI3-499、DI3-652、I3-10)，其遺傳標(biāo)記為Xan-、Thi-、Deam-、SGr。經(jīng)5次連續(xù)傳代后菌株遺傳性狀較穩(wěn)定，對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，經(jīng)高效液相色譜分析表明其產(chǎn)物為腺苷。其中，DI3-243的產(chǎn)腺苷量最高(9.52 g/L)，嘌呤副產(chǎn)物含量低(0.031 g/L)(表5)。

表5 黃嘌呤缺陷型菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果

2.2.4 組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 將DI3-243菌細(xì)胞進(jìn)行誘變處理后涂布在完全培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)長(zhǎng)出單菌落后，挑單菌落接種于基本培養(yǎng)基、補(bǔ)充培養(yǎng)基(含30 mg/L組氨酸)上，從補(bǔ)充培養(yǎng)基平板挑選單菌落，進(jìn)一步測(cè)定其抗性和酶活性，淘汰不符合要求的菌株，最后得到遺傳標(biāo)記為His-、Xan-、Thi-、Deam-、SGr的菌株，搖瓶發(fā)酵測(cè)定其腺苷產(chǎn)量，其中腺苷產(chǎn)量較高的5株菌(D4-3、DI4-24、DI4-91、DI4-182、I4-107)發(fā)酵結(jié)果如表6所示。菌株DI4-24和DI4-182產(chǎn)苷性能比較突出，通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，其產(chǎn)苷能力可進(jìn)一步提高到18.56 g/L和17.13 g/L。

表6 組氨酸缺陷型菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)證明，以產(chǎn)肌苷菌株為出發(fā)菌株，根據(jù)代謝控制理論，通過(guò)多次誘變有步驟地選育高產(chǎn)腺苷菌株的方案是可行的。在試驗(yàn)中獲得了5株黃嘌呤缺陷型菌株，平均產(chǎn)腺苷7.33 g/L，考慮到5-磷酸核糖-1-焦磷酸是合成腺苷的重要中間體，它有一個(gè)代謝旁支合成組氨酸，將此路徑切斷會(huì)顯著提高腺苷產(chǎn)量，因此，又誘變選育出5株黃嘌呤和組氨酸雙重缺陷型菌株，其平均產(chǎn)腺苷量達(dá)14.94 g/L，此與以往的設(shè)計(jì)思路[13]不同。

在誘變處理方法上，通過(guò)復(fù)合誘變處理獲得不同突變株較單因子誘變處理更為有效，例如，采用N離子束注入處理80 s與DES處理10 min的復(fù)合誘變比較有利于突變株的獲得，這在His-和Xan-突變型菌株選育過(guò)程中表現(xiàn)更為突出。此外，通過(guò)復(fù)合誘變獲得的突變株其穩(wěn)定性更好，在傳代過(guò)程中遺傳標(biāo)記不易丟失。一些通過(guò)單因子誘變獲得的突變體存在遺傳性狀不穩(wěn)定現(xiàn)象，例如I4-107的His-遺傳型在傳代過(guò)程中比較容易發(fā)生回復(fù)突變，表現(xiàn)為在黃嘌呤培養(yǎng)基上菌落呈紅色，故隨著傳代次數(shù)增多，其產(chǎn)苷能力急劇下降，這種突變株不穩(wěn)定的現(xiàn)象在其他的研究工作中也有報(bào)道[17-18]。

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Breeding of High-yield Adenosine Strains Using N Ion Beam Injection and DES Compound Mutagenesis

LIU Guosheng1,2，LI Jinxin1，LIU Lei1，GU Yanchang3，XU Hang1

(1.College of Life Sciences,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China; 2.Key Laboratory for Microorganisms and Functional Molecules,University of Henan Province,Xinxiang 453007,China;3.Xinxiang Tuoxin Biochemical and Technology & Science Co.,Ltd.,Xinxiang 453000,China)

The inosine producing bacteriumBacillussubtilisHSD1206(Ade-Thi-SGr) was selected as parent strain and treated with diethyl sulfate (DES) and N ion beam injection for single factor or compound mutagenesis to select adenosine producing strain after several rounds of mutation and breeding.Results showed that the best mutagenesis time was 250 s by N ion beam injection or 10 min by DES treatment according to the strain lethality curve.The strains which showed xanthine,thiamine,histidine triple defect type,lacked adenine deaminase activity and resisted sulfaguanidine were named DI4-24 and DI4-182,and the genetic markers were Xan-Thi-His-Deam-and SGr.They could steadily accumulated adenosine in the optimization fermentation medium to 18.56 g/L and 17.13 g/L respectively after consecutive culture.In conclusion,the thought of blocking the way to product inosine and inducing the way to synthesize adenosine ofBacillussubtilisauxotroph strain by physical and chemical mutagenesis is feasible in the laboratory environment.

adenosine；Bacillussubtilis； ion beam injection； diethyl sulfate； compound mutation； xanthine deficient type

2016-12-26

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(13IRTSTHN009)；河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011B180032)

劉國(guó)生(1964-)，男，河南舞陽(yáng)人，教授，博士，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。E-mail:hnliugs@163.com

TQ920.1

A

1004-3268(2017)04-0143-04