安夢楠 吳元華

（沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866）

BYL無細胞系統(tǒng)對植物RNA病毒翻譯復制機制的研究進展

安夢楠 吳元華

（沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866）

無細胞翻譯系統(tǒng)是高效表達重組蛋白質的體外分子研究系統(tǒng)，BYL是一種通過密度梯度離心法脫去液泡的煙草BY-2裂解液無細胞系統(tǒng)。BYL系統(tǒng)可支持外源mRNA以及多種植物RNA病毒的蛋白質表達，由于BYL系統(tǒng)中保留植物RNA病毒復制所需的胞內膜結構，所以該系統(tǒng)可支持RNA病毒核酸負義鏈、正義鏈和亞基因RNA的合成。綜述了BYL系統(tǒng)應用于植物RNA病毒翻譯和復制等機理以及RNA干擾機制方面的研究進展，并對其研究前景進行展望，旨在便于更多的研究者系統(tǒng)了解BYL無細胞系統(tǒng)，將其更廣泛地應用于其他RNA病毒的翻譯復制機制研究中。

無細胞體系；BYL；蛋白質表達；植物RNA病毒

無細胞蛋白質合成系統(tǒng)（Cell-free protein synthesis，CFPS）是在細胞抽提物中補充底物和能源物質，通過加入外源mRNA或DNA為模板來人工合成蛋白質的體外研究系統(tǒng)［1］。與體內（in vivo）蛋白質表達體系相比，無細胞系統(tǒng)突破了細胞的限制，具有反應時間短、蛋白質表達迅速、不易于被蛋白酶降解、可表達對細胞有毒性的蛋白質等諸多優(yōu)點［2］。無細胞系統(tǒng)中的粗裂解液中包括核糖體、翻譯起始因子等翻譯所需的基礎因子，通過外源加入蛋白酶抑制劑、氨基酸、能量再生物質及底物等可實現(xiàn)短時間內表達目標蛋白質［3］。無細胞系統(tǒng)的開發(fā)和研究進展為蛋白組學的研究及高通量藥物篩選提供了便捷的手段［1-3］。

目前，已被開發(fā)和利用的無細胞系統(tǒng)有原核和真核系統(tǒng)兩種類型，以大腸桿菌為代表的原核無細胞系統(tǒng)被廣泛應用多年，其優(yōu)點在于成本相對低廉且蛋白質產(chǎn)量較高［4］。20世紀中期，人類首次采用細胞裂解液或抽提物介導蛋白質的體外合成，隨后，無細胞系統(tǒng)在破解遺傳密碼子的研究中發(fā)揮重要作用［5］。近年來，真核生物無細胞系統(tǒng)發(fā)展迅速，具有代表性的有麥胚芽抽提物（Wheat germ extract，WGE）系統(tǒng)、兔網(wǎng)織紅細胞裂解液（Rabbit reticulocyte lysate，RLL）以及昆蟲細胞抽提物（Insect cell extract，ICE）［6］，其中 WGE 系統(tǒng)和 RLL 系統(tǒng)已經(jīng)商品化并廣泛應用在科學研究中［7］。由于WGE系統(tǒng)和RLL系統(tǒng)中不含胞內膜結構以及缺乏病毒復制過程所需的寄主蛋白質，所以植物病毒無法完成復制［8］，故上述商品化的無細胞系統(tǒng)無法用來詳細研究病毒復制的分子機理。因此，急需開發(fā)出新的同時支持植物RNA病毒翻譯和復制的體外植物病毒研究系統(tǒng)。

BY-2 Lysate（BYL）系統(tǒng)是很好的研究植物病毒翻譯復制的無細胞體外系統(tǒng)［8］。本文首先介紹了BYL系統(tǒng)的開發(fā)和制備過程，并對該系統(tǒng)與其他幾種無細胞研究體系特點進行了比較；其次，探討了BYL系統(tǒng)在植物RNA病毒翻譯和復制機理的研究以及在植物RNA干擾機理方面的研究進展；最后，對BYL系統(tǒng)在植物病毒學及分子生物學方面的應用前景進行展望，旨在希望更多的研究者系統(tǒng)的了解BYL無細胞系統(tǒng)。

1 BYL無細胞系統(tǒng)的開發(fā)

植物RNA病毒的細胞內復制過程包括：通過微傷口進入細胞內后脫去外殼，釋放核酸RNA并劫持寄主翻譯系統(tǒng)來進行復制蛋白質的表達。接下來，病毒核酸RNA被招募至對應的細胞內膜結構進行復制復合體的裝配，并進行負義鏈RNA和正義鏈RNA的合成［9］。在體內研究體系中，侵入細胞的病毒核酸經(jīng)過翻譯，負義鏈合成以及正義鏈合成的數(shù)次反復循環(huán)后才能檢測到病毒的累積。在上述蛋白質翻譯和核酸復制的循環(huán)中的任何過程出現(xiàn)問題，最終結果均導致無法檢測到病毒的積累。早期對煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）研究中，構建的TMV5' UTR堿基缺失突變體RNA無法在原生質體中進行自我復制，其結果說明5' UTR的序列對于TMV的復制重要，但無法明確該序列對于負義鏈合成或正義鏈合成中的哪一環(huán)節(jié)起關鍵作用［10］。相比體內的研究體系，無細胞體外系統(tǒng)在RNA病毒的蛋白質表達和核酸復制機理的研究方面具有明顯的優(yōu)勢，通過向體外系統(tǒng)中加入一種或多種外源RNA（mRNA、病毒RNA及人工RNA等），短時間內可迅速表達對應蛋白質，非常適合于核酸以及蛋白質的互作的相關研究。因此，無細胞體外系統(tǒng)可以將病毒的蛋白質表達、負義鏈RNA合成，以及正義鏈RNA合成的過程的機制進行獨立研究，可很好的解決上述問題。

無細胞系統(tǒng)最早應用在動物病毒方面，通過海拉（HeLa）細胞抽提物的研究表明：脊髓灰質炎病毒（poliovirus）不僅可以在HeLa細胞抽提物中進行蛋白質表達，甚至可以進行復制及形成病毒粒子［11-12］。通過HeLa細胞抽提物體外系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，促使核糖體脫離翻譯抑制劑嘌呤霉素（Puromycin）促進了poliovirus的負義鏈合成，抑制核糖體的移動的翻譯抑制劑cycloheximide則極大的抑制了poliovirus的負義鏈合成卻不對正義鏈合成產(chǎn)生影響，該研究通過體外系統(tǒng)首次揭示了poliovirus蛋白質翻譯和核酸復制之間的轉換關系［13］。與動物細胞相比，植物細胞中存在占據(jù)很大體積的液泡結構，其內部為酸性并存在大量的RNA酶和蛋白酶。所以，在留有液泡植物細胞抽提物中，植物病毒會受到RNA酶和蛋白酶的攻擊無法完成翻譯和復制［8］。綜上，用于制備植物病毒體外裂解液的植物細胞需要具備以下特點：（1）從植物細胞容易獲得原生質體、不易破碎；（2）可通過密度梯度離心法除去液泡；（3）植物細胞處于分裂期，翻譯活性較高且支持較多種類病毒的增殖。

煙草BY-2（Bright yellow-2）細胞是分裂速度最快的植物懸浮細胞之一，其細胞數(shù)量在一周時間可繁殖到初始的60-80倍［14］。BY-2懸浮細胞通過恒溫恒定轉速下通過MS培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。由于其不受溫室、土壤和光照等條件限制，具有操作簡便，可重復性高等特點，除對植物病毒的研究外，還被廣泛應用在植物生理、藥劑篩選及重組蛋白質表等研究中［14，15］。BY-2細胞經(jīng)過果膠酶（Pectinase）和離析酶（Macerozyme）處理后得到BY-2原生質體，根據(jù)液泡和細胞質密度的差別，采用細胞分離液Percoll通過密度梯度離心法［16］將BY-2原生質體液泡部分分離出去得到微小原生質體（Mini protoplasts）。接下來，通過勻漿器將微小原生質體進行裂解，最終得到的裂解液稱為（Evacuolated tobacco BY-2 protoplast lysate，BYL）［8］。 向 BYL 中 添 加 能 量 基 質、 氨基酸以及核酸蛋白酶抑制劑后，RNA病毒可在該系統(tǒng)中進行蛋白質翻譯及核酸復制，以BYL系統(tǒng)中加入的病毒核酸RNA為模板，無需經(jīng)過數(shù)次病毒復制循環(huán)，便可在短時間內進行蛋白質翻譯（1-2 h）和核酸負義鏈的合成（3-4 h）［8，17-18］。因此，將人工構建的病毒突變體RNA接種BYL系統(tǒng)，通過檢測病毒蛋白質和RNA的積累量可明確在病毒蛋白質翻譯以及復制過程中起作用的關鍵因子。

2 BYL無細胞系統(tǒng)在植物病毒研究中的應用

目前，采用BYL系統(tǒng)對番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）和紅三葉草壞死花葉病毒（Red clover necrotic mosaic virus，RCNMV）的蛋白質翻譯和核酸復制機理方面進行了較為深入的研究。BYL系統(tǒng)在開發(fā)出以后，首先應用在ToMV的翻譯和復制機制的研究中［8］，結果表明ToMV可以在BYL系統(tǒng)中表達130 kD和180 kD的復制蛋白質（p130和p180），ToMV可以通過系統(tǒng)中瞬時表達出的復制蛋白質進行負義鏈RNA和正義鏈RNA的合成［8］。為了明確BYL系統(tǒng)中的膜結構在ToMV復制過程中的作用，通過高速離心除去BYL系統(tǒng)中的膜結構得到mdBYL（membrane-depleted BYL）［19］，在 mdBYL 中ToMV的核酸RNA可以高效率的進行蛋白質表達，但無法進行核酸復制［19］。接下來，通過puromycin中止翻譯并加入膜組分（P30 BYL）后，可以顯著的促進ToMV核酸的復制［19］，該結果揭示了BYL系統(tǒng)中的膜結構對于ToMV的復制起到不可或缺的作用。上述實驗的重要意義在于，在BYL體外系統(tǒng)中對膜的操作可將病毒翻譯和復制兩個過程巧妙的拆分開來進行獨立研究。植物RNA病毒需形成復制復合體（Replication complex）來進行RNA的復制［20］，但是ToMV復制復合體的形成機制在此前尚不清楚。研究表明，在mdBYL中ToMV的復制蛋白質p130在翻譯未終止時可順勢結合到核酸RNA的5’端序列，形成的復合體命名為PMTC（Pre-membrane-targeting complex），在BYL系統(tǒng)中通過外源RNA反式表達的p130不能與ToMV核酸RNA相結合，上述研究揭示了PMTC極有可能與細胞內的膜結構相結合并促進復制復合體的形成［19］。此外，BYL系統(tǒng)還被應用在ToMV抗病基因的研究中，研究表明番茄抗ToMV基因Tm-1中編碼80 kD的蛋白質p80GCR237可直接與野生型ToMV的p130相互作，同時突破Tm-1抗性的ToMV變異體LT1的p130不能與p80GCR237發(fā)生互作［21］。研究揭示野生型p130與p80GCR237發(fā)生互作后會抑制復制復合體的形成［21］。

RCNMV是雙分節(jié)基因組的RNA病毒，基因組RNA1和RNA2分別采用順勢（in cis）和反式（in trans）招募復制蛋白質p27后進行核酸復制［22］。與三分節(jié)RNA病毒的雀麥花葉病毒（Brome mosaic virus，BMV）不同的是，RCNMV的RNA1和RNA2的非翻譯區(qū)域（UTR）序列相似度低，其RNA二級結構區(qū)別很大。通過BYL系統(tǒng)的研究明確了在RCNMV RNA1的3' UTR的TE-DR1莖環(huán)結構對于p27的翻譯十分重要［23］，而3'末端的SLDE和SLF兩個莖環(huán)結構對于RNA1的負義鏈合成起關鍵作用［17］，上述研究明確了在RNA1的3' UTR所形成的多個RNA二級結構在病毒增殖過程中起到關鍵且不同的作用，對于其他RNA病毒的復制機制研究有很好的指導意義。RCNMV的RNA2編碼運輸?shù)鞍踪|MP，通過BYL系統(tǒng)的研究表明，RNA2的3' UTR區(qū)域存在的Y字形RNA結構對于RNA2的負義鏈合成起到了重要作用［18］。鏈霉素標簽（Strepto-tag）法是研究RNA與蛋白質互作的重要方法［24］，通過Strepto-tag的研究發(fā)現(xiàn)RCNMV RNA2的Y字形RNA結構對可以和復制蛋白質p27直接互作［24］，上述研究通過BYL系統(tǒng)很好闡明了RCNMV的RNA2通過反式結合p27將其招募至3'末端進行負義鏈RNA的合成［18，24］。除核酸復制以外，BYL系統(tǒng)也適合用于與病毒互作的寄主蛋白質的鑒定及功能方面的研究：通過Strepto-tag法的研究發(fā)現(xiàn)eIF4E和PABP與RCNMV RNA的互作對于RCNMV的翻譯起到重要作用［25］；RCNMV在BYL系統(tǒng)中表達復制蛋白質后可以與寄主蛋白質形成480kDa的復制蛋白復合體［26］，研究還發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70（HSP70）、熱休克蛋白90（HSP90）及泛素（Ubiquitin）等多種重要的寄主蛋白質與RCNMV p27的相互作用對于復制蛋白復合體的形成起到重要作用［26］。綜上所述，采用BYL系統(tǒng)的研究初步明確了參與RCNMV的蛋白質表達及核酸復制的重要RNA二級結構的功能，以及與病毒核酸和蛋白質相互作的重要寄主蛋白質的功能。

除ToMV和RCNMV之外，BYL系統(tǒng)已被確認可支持TMV，BMV，蕪菁皺縮病毒（Turnip crinkle virus，TCV），番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）等RNA病毒的體外翻譯和核酸的復制［8，17，19，27-28］。對于其他的 RNA 病毒的研究也具有良好的應用前景。

3 其他植物病毒無細胞研究系統(tǒng)的對比

麥胚芽抽提物（WGE）系統(tǒng)開發(fā)始早于BYL系統(tǒng)，始于20世紀70年代［29］，WGE系統(tǒng)廣泛支持真核生物和原核生物mRNA的無細胞蛋白質翻譯，其中含有蛋白質合成所必需的細胞組分（tRNA，核糖體，起始、延伸和終止因子）等，除去了大部分麥胚細胞內源RNA以降低背景的干擾［30］。由于不含有胞內膜結構，植物RNA病毒在WGE系統(tǒng)中不能進行自我復制，但可以良好的進行蛋白質表達。研究人員通過WGE系統(tǒng)對大麥黃矮病毒（BYDV）不依賴帽（Cap independent）的翻譯機理進行了深入研究。本文挑選列舉以下研究結果：采用WGE系統(tǒng)的研究明確了BYDV的5' UTR和3' UTR的長距離互作對于病毒翻譯起道重要作用［31］；揭示了BYDV亞基因RNA2的核酸序列具有負調控病毒復制蛋白表達的作用［33］；明確了BYDV核酸RNA與真核生物翻譯起始因子eIF4F相互作用［33］。除BYDV外，WGE系統(tǒng)在其他RNA病毒的研究中也有應用，如對馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）研究發(fā)現(xiàn)PLRV sgRNA1翻譯調控因子存在于CP開放閱讀框（ORF）中以及通讀蛋白區(qū)域［34］等。WGE系統(tǒng)應用在植物病毒研究方面的優(yōu)勢在于：WGE已經(jīng)商品化可保證翻譯活性，無需親自制備。相對不足在于：WGE系統(tǒng)中不含有內質網(wǎng)等病毒復制所需要的細胞結構，無法用于病毒的復制機理的研究。

酵母無細胞抽提物（Cell-free extract，CFE）是將酵母菌株BY4741通過破碎后獲得的體外病毒翻譯復制系統(tǒng)［35］，主要應用于TBSV的核酸復制以及重組相關機制的研究中。例如：基于酵母CFE系統(tǒng)的研究表明TBSV復制蛋白質的裝配需要寄主HSP70（酵母蛋白質Ssa1/2p），新裝配的復制蛋白復合體支持TBSV完整的核酸負義鏈和正義鏈的合成［36］。除TBSV以外，酵母CFE可支持同為番茄從矮病毒屬的Carnation Italian ring spot tombusvirus（CIRV）的復制，并揭示CIRV的復制場所為線粒體膜結構［37］。酵母CFE用于研究植物病毒復制的優(yōu)勢在于：酵母全基因組測序已經(jīng)完成，且可通過載體質粒外源表達目的蛋白質或敲出目的基因后的酵母制備無細胞體系，方便用于特定的病毒或寄主蛋白質的研究。相對不足之處：酵母并非植物病毒的天然寄主，在基因及蛋白質方面與寄主植物存在一定差異，需在相應的寄主植物中進行功能驗證。

4 總結與展望

植物病毒學的研究技術在20世紀末開始發(fā)展迅速，得益于研究體系的快速發(fā)展。病毒屬于活體專性寄生物，無法進行體外培養(yǎng)。長久以來對于植物病毒的翻譯和復制機理的研究比較滯后。隨著動物病毒研究技術的發(fā)展，近年來植物病毒的研究系統(tǒng)和技術也有了快速的進步。

除植物病毒方面的研究外，BYL系統(tǒng)還被應用在植物RNA干擾方面的研究中。由于缺乏合適的體外研究體系，人們對植物中的RNA誘導基因沉默復合體（RISC）的裝配機制理解較少。近期的研究表明，在BYL系統(tǒng)中加入外源RNA表達擬南芥AGO1蛋白質后加入體外純化的小干擾RNA（siRNA）或micro-RNA（miRNA），新形成的RISC可在BYL系統(tǒng)中特異性的切斷目標核酸RNA［38］。此外，通過BYL系統(tǒng)證明了寄主HSP90在RISC的形成過程中起到重要作用［38］。研究表明BYL系統(tǒng)中通過外源RNA表達擬南芥AGO1后形成的AtAGO1-RISC可結合在目標RNA的ORF進而抑制了翻譯的延伸（Translation elongation）的過程，闡明了植物siRNA（或miRNA）同動物小RNA一樣具有抑制目標RNA蛋白質表達的作用［39］。

隨著精確基因編輯技術CRISPR/Cas9的發(fā)展及其在BY-2懸浮細胞中成功應用［40］，通過敲除特定基因后BY-2細胞制備BYL系統(tǒng)成為了可能，經(jīng)過基因修飾后的BYL在寄主蛋白參與植物病毒翻譯/復制以及RNA干擾的機制研究方面會有良好的應用前景。同時，BYL系統(tǒng)可以作為高效率篩選抗病毒制劑的研究體系，為高特異性的病毒抑制劑的研制奠定重要的理論基礎。

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Research Progress on BYL Cell-free Systems in Plant RNA Virus Translation and Replication Mechanisms

AN Meng-nan WU Yuan-hua
（College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866）

Cell-free translation system is an in vitro molecular study system for efficient expression of recombinant proteins. The BYL is tobacco BY-2 lysate cell-free system from which vacuoles are removed by density gradient centrifugation. The BYL system supports recombinant protein expression and many plant viral protein expressions. Because the intracellular membrane fraction required for viral RNA replication is retained，the BYL system also supports negative-strand，positive-strand and subgenomic RNA synthesis of plant positive-strand RNA viruses.This paper reviewed the applications of BYL system in the molecular insight of translation and replication mechanism of plant RNA viruses as well as RNA interference mechanism，and prospected their future research trend. This review systematically illustrated the BYL system，which is expected to be applied in the study of of other plant RNA viruses and provides intriguing insights.

cell-free system；BYL；protein expression；plant RNA virus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0514

2017-06-21

國家自然科學基金項目（31401710），高等學校博士學科點專項科研基金項目（20132103120014）

安夢楠，男，博士，講師，研究方向：植物病毒學；E-mail：anmengnan1984@163.com

吳元華，男，博士，博士生導師，研究方向：植物病毒學；E-mail：wuyh7799@163.com

（責任編輯 朱琳峰）