李俊娥，張金宏，吳正，樊明濤，魏新元

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊陵712100）

滅活酵母對干紅葡萄酒酚類物質(zhì)及其抗氧化活性的影響

李俊娥，張金宏，吳正，樊明濤，魏新元*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊陵712100）

以河北省昌黎縣華夏長城葡萄園的赤霞珠葡萄所釀干紅葡萄酒為研究對象，設(shè)計4種不同的試驗處理，測定葡萄酒中酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性，研究滅活酵母對葡萄酒中酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性的影響。試驗結(jié)果顯示，第5天添加滅活酵母3 g/L（處理1）的葡萄酒中總酚、總花色苷和總單寧的含量最高；單體酚含量測定時，第25天添加滅活酵母3g/L（處理3）的葡萄酒中咖啡酸、綠原酸、蘆丁、（+）-兒茶素、鞣花酸和沒食子酸含量最高；不同處理下樣品的總還原能力、DPPH·清除率和ABTS+·清除率都有不同程度的提高。因此，滅活酵母能提高赤霞珠干紅葡萄酒中酚類物質(zhì)的含量，增強(qiáng)其抗氧化活性。

滅活酵母；葡萄酒；酚類物質(zhì)；抗氧化活性

酚類化合物是指苯環(huán)上的氫原子被羥基取代生成的化合物，根據(jù)所含羥基數(shù)目的不同，酚類化合物分為一元酚和多元酚。酚類化合物中的羥基能和生物體內(nèi)物質(zhì)的氧自由基發(fā)生反應(yīng)，從而保護(hù)生物細(xì)胞免受氧化作用，具有提高機(jī)體免疫力和抗衰老等功能，也具有降低多種慢性病和冠心病發(fā)病率的作用[1-2]。酚類化合物呈弱酸性，具有特殊的芳香氣味。自然界中存在的酚類化合物大都是植物生命活動的產(chǎn)物。葡萄中含有的大量酚類物質(zhì)是葡萄酒的重要成分之一，它能影響葡萄酒的品質(zhì)和口感，是評價葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。有研究證實，葡萄酒中的酚類物質(zhì)與其抗氧化活性呈正相關(guān)[3-5]。影響葡萄酒中酚類物質(zhì)含量的因素有很多，如葡萄的品種與產(chǎn)地、氣候和土壤因素、葡萄的成熟度以及發(fā)酵過程中的添加物等，其中品種是影響葡萄酒酚類物質(zhì)含量的決定性因素[6-10]。現(xiàn)如今有多種品質(zhì)優(yōu)良的釀酒葡萄用于葡萄酒生產(chǎn)，且工藝技術(shù)非常成熟，如何在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升葡萄酒的生產(chǎn)工藝，改善葡萄酒品質(zhì)是當(dāng)前的研究熱點。

葡萄酒釀制過程中，酵母菌株的選擇非常重要，它一方面決定了自身的酒精發(fā)酵能力，另一方面影響葡萄酒的其他品質(zhì)，如香氣和口感等。酵母細(xì)胞中干物質(zhì)約占25%，其中酵母多糖約占干重的40%[6，11]。酵母多糖主要由葡聚糖、甘露聚糖和少量的幾丁質(zhì)組成，具有良好的生物活性，會對葡萄酒的香氣產(chǎn)生有益的影響。有研究顯示，酵母多糖能增加葡萄酒的香氣成分，能降低其酸澀度，提升圓潤度，增加飽滿性[11-13]。有關(guān)酵母多糖對葡萄酒中酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性影響的研究較少，且酵母多糖不易提取并提純，商業(yè)化的酵母多糖產(chǎn)品很少。因此，本研究擬直接將釀酒酵母滅活后應(yīng)用于赤霞珠干紅葡萄酒釀制，研究其對酒中酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力的影響，探索提高葡萄酒品質(zhì)的新途徑。

1材料與方法

1.1材料

葡萄：赤霞珠葡萄，產(chǎn)自河北省昌黎縣華夏長城葡萄園（2015年）。

菌株：釀酒酵母菌株F-15，乳酸菌XJ-25，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物發(fā)酵實驗室保藏。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑

標(biāo)準(zhǔn)品（阿魏酸、槲皮素、咖啡酸、綠原酸、蘆丁、（+）-兒茶素、鞣花酸、沒食子酸）：購于美國o2si；單寧酸：天津天力化學(xué)試劑有限公司；DPPH：購于日本東京化成工業(yè)株式會社（TCI）；福林酚、ABTS（現(xiàn)配現(xiàn)用）、蝸牛酶（破壁率達(dá)90%以上）：購于北京索萊寶科技有限公司；色譜級乙腈、色譜級甲醇、色譜級乙酸：購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2儀器

UV-1240紫外分光光度計：日本島津公司；SHBIII循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3試驗方法

1.3.1滅活酵母的制備

活化酵母菌株F-15后將其接種于YPD培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至穩(wěn)定初期，80℃下加熱20min，洗滌并離心收集細(xì)胞沉積物，將沉淀物進(jìn)行真空干燥，然后于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

滅活酵母用前制備：將酵母干粉溶于pH 6.5的Tris-HCl緩沖液中，加入1.5%蝸牛酶，37℃酶解2 h后于80℃加熱15min，冷卻至室溫備用。

1.3.2葡萄酒釀制與滅活酵母的添加

挑選完整飽滿、色澤良好的赤霞珠葡萄，除梗、破碎后按發(fā)酵罐體積的80%裝入1 L發(fā)酵罐，接入2%體積的釀酒酵母F-15進(jìn)行常溫浸漬發(fā)酵20 d。酒精發(fā)酵結(jié)束后接入2%體積的乳酸菌XJ-25進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，葡萄酒陳釀31 d后測定各項指標(biāo)。本試驗設(shè)計了4種不同處理方法，分別為：釀制第5天添加滅活酵母3 g/L（處理1），第15天添加滅活酵母3 g/L（處理2），第25天添加滅活酵母3 g/L（處理3）[11，14-15]，以同等條件下不添加滅活酵母制得的葡萄酒作為對照。試驗設(shè)置2個生物重復(fù)，各指標(biāo)平行測定3次，結(jié)果以平均值表示。

1.3.3酚類物質(zhì)的測定

1.3.3.1總酚物質(zhì)含量測定

總酚含量測定采用福林-肖卡比色法[16]，以每升葡萄酒中的沒食子酸含量表示。

總單寧含量測定采用福林-丹尼斯試劑法[17-19]，以每升葡萄酒中的單寧酸含量表示。

總花色苷含量測定采用pH值示差法[20]，以每升葡萄酒中的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量表示。

1.3.3.2單體酚種類和含量測定

取100mL葡萄酒用80mL乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，合并有機(jī)相并在33℃下避光蒸干，殘留物用色譜級甲醇定容至5mL。測定前樣品需用0.22μm微孔濾膜過濾[21]。

選用WondaSil反相C18（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱[22]。采用二元梯度洗脫：流動相A為水∶乙酸（98∶2，體積比），流動相B為乙腈。洗脫程序：0～20min，20% B；20 min～25 min，50%B；25 min～30 min，70%B；30 min～35min，80%B；35min～40min，20%B。流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃，采用Diode Array Detector（DAD）檢測器采集280 nm特征波長下的信號。

1.3.4葡萄酒抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考Li等[23]的方法，葡萄酒樣品稀釋3倍后測定其DPPH自由基清除率，結(jié)果以自由基清除率（%）表示；ABTS+·自由基清除能力的測定參考Xu等[24]的方法，樣品稀釋8倍后測定ABTS清除率，結(jié)果以自由基清除率（%）表示；總還原能力的測定參考Tagliazucchia等[25]的方法，樣品稀釋3倍后測定其吸光值，結(jié)果以樣品的吸光值表示，吸光值越低其總還原能力越強(qiáng)。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

采用Data Processing System（DPS）v 6.55 Tukey法進(jìn)行顯著性差異分析。

2結(jié)果與分析

2.1滅活酵母對葡萄酒酚類物質(zhì)含量的影響

分別測定不同處理條件下葡萄酒中的總酚、總花色苷和總單寧物質(zhì)的含量，結(jié)果見表1。

表1 葡萄酒中酚類物質(zhì)的含量Table1 The contentofphenolic substances in wineunder different treatmentsa

由表1可知，與對照相比，用不同方法處理的赤霞珠干紅葡萄酒中酚類物質(zhì)含量有不同程度的提高，其中處理1葡萄酒中總酚含量、總花色苷和總單寧含量最高，分別為：1.076 1 g/L、0.131 7 g/L和1.516 8 g/L。處理2葡萄酒中的總酚和總單寧含量高于處理3，而在處理3葡萄酒中總花色苷的含量高于處理2。試驗結(jié)果顯示，葡萄酒中總酚和總單寧含量從大到小依次為：處理1＞處理2＞處理3＞對照；總花色苷含量從大到小依次為：處理1＞處理3＞對照＞處理2。綜上所述，處理1（第5天添加滅活酵母3 g/L）能增加赤霞珠干紅葡萄酒中酚類物質(zhì)的含量。

為了探究葡萄酒中單體酚物質(zhì)的種類和含量，利用HPLC從葡萄酒中鑒定出8種單體酚物質(zhì)如圖1B所示，根據(jù)8種單體酚標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的圖譜（圖1A）作出各單體酚的線性方程，如表2所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）和對照葡萄酒（B）隨時間變化色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram ofm ixed standard solution（A）and HPLC chromatogram of controlw ine（B）

表2 8種單體酚的線性回歸方程Table2 The liner regression equation for eightkindsof freephenols

根據(jù)表2線性回歸方程計算得不同處理葡萄酒中8種單體酚含量如表3所示。

表3 不同處理葡萄酒中8種單體酚含量Table3 The contentofeightkindsof free phenolsunder several treatmentsin wine mg/L

由表3可知，不同處理方法對干紅葡萄酒中8種單體酚含量影響效果不一。滅活酵母的添加使得各單體酚物質(zhì)的含量從大到小呈現(xiàn)以下現(xiàn)象：阿魏酸，對照＞處理3＞處理2＞處理1；槲皮素，處理1＞對照＞處理3＞處理2；咖啡酸、蘆丁和沒食子酸，處理3＞對照＞處理2＞處理1；綠原酸和（+）-兒茶素，處理3＞處理2＞對照＞處理1；鞣花酸，處理1＞處理3＞處理2＞對照；8種單體酚總含量，處理3＞對照＞處理2＞處理1。葡萄酒中（+）-兒茶素的含量較高，尤其處理3葡萄酒（+）-兒茶素的含量最高為10.246 8 mg/L，占單體酚總量的40.81%；葡萄酒中槲皮素的含量很低，處理2葡萄酒中槲皮素含量最低為0.221 6mg/L，占單體酚總量的1.10%；葡萄酒中單體酚含量次高的為沒食子酸，處理3葡萄酒中沒食子酸含量為4.326 8mg/L，比對照高0.488 2mg/L，但處理1和處理2中沒食子酸含量有所下降。和對照葡萄酒相比，槲皮素和鞣花酸在處理1葡萄酒中含量最高，處理2葡萄酒中綠原酸、（+）-兒茶素和鞣花酸的含量有不同程度增加，但另外5種單體酚的含量有所降低，處理3酒中除槲皮素和阿魏酸外的單體酚物質(zhì)含量增加。

葡萄酒中單體酚物質(zhì)含量變化復(fù)雜，這可能由滅活酵母與各單體酚物質(zhì)的相互作用不同造成的，也可能是不同處理方法使單體酚發(fā)生了不同程度的變化。

綜上所述，滅活酵母的添加對酒中單體酚物質(zhì)的含量產(chǎn)生了影響，第25天添加滅活酵母3 g/L（處理3）能提高赤霞珠干紅葡萄酒中單體酚物質(zhì)的含量。

2.3葡萄酒抗氧化活性的比較

生物體中存在復(fù)雜的自由基和抗氧化劑，因此評定生物體抗氧化性能的工作強(qiáng)度很大，現(xiàn)階段的相關(guān)研究通常是將兩種或兩種以上的抗氧化測試方法結(jié)合起來，以提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性[26]。本試驗中將總還原能力、DPPH和ABTS三種方法結(jié)合起來研究滅活酵母添加對赤霞珠干紅葡酒抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖2。

圖2 不同處理葡萄酒的總還原能力（A）、DPPH·清除率（B）和ABTS+·清除率（C）Fig.2 The total reducing capacity（A），DPPH·clearance（B）and ABTS+·clearance（C）ofw inewith different treatments

圖2A顯示，不同處理下干紅葡萄酒的總還原能力無顯著性差異，但處理1、處理2和處理3樣品的吸光值小于對照，表明添加滅活酵母能提高葡萄酒的還原能力，但效果不明顯。圖2（B）和圖2（C）顯示，不同處理葡萄酒的DPPH·和ABTS+·清除率有顯著性差異，樣品的自由基清除率由大到小依次為：處理1＞處理3＞處理2＞對照。

酒樣稀釋3倍后測得的DPPH·清除率最高為81.20%，和對照相比提高了6.70%；處理2和處理3葡萄酒的DPPH·清除率分別為76.02%和78.53%，各提高了1.52%和4.03%。用ABTS法測定樣品的自由基清除率發(fā)現(xiàn)，處理1樣品的清除率最高為85.50%，處理2和處理3樣品的清除率分別提高到81.36%和81.87%。因此，滅活酵母添加對葡萄酒的DPPH和ABTS+·清除率產(chǎn)生了積極的影響。

3種測定葡萄酒抗氧化活性的方法具有較好的相互支撐作用。試驗結(jié)果表明，3種處理方法均能提高赤霞珠干紅葡萄酒的抗氧化活性。處理1葡萄酒的抗氧化活性最好，即第5天添加滅活酵母3 g/L，葡萄酒的抗氧化活性最強(qiáng)。

3結(jié)論

1）第5天添加滅活酵母3 g/L的葡萄酒中總酚、總花色苷和總單寧含量最高，滅活酵母能顯著提高赤霞珠干紅葡萄酒的抗氧化活性，葡萄酒的酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性得到最佳改善。

2）咖啡酸、綠原酸、蘆丁、（+）-兒茶素、鞣花酸、沒食子酸在第25天添加滅活酵母3 g/L的葡萄酒中含量最高，這與1）中結(jié)果不一致，可能與葡萄酒中其它未檢測的單體酚物質(zhì)含量有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3）滅活酵母能改善赤霞珠干紅葡萄酒品質(zhì)，可作為添加劑用于葡萄酒的釀制。

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Influence of Inactivated Yeast on Phenolic Com pounds and Antioxidation of Red W ine

LIJun-e，ZHANG Jin-hong，WU Zheng，F(xiàn)ANMing-tao，WEIXin-yuan*
（Collegeof Food Scienceand Engineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，Shaanxi，China）

The study used Cabernet Sauvignon produced in Changlicounty of Hebeiprovince asmaterial.And the changes of content of phenolic compounds and antioxidant activity were researched through four different treatments inwine.The results indicated that the highestcontentof total phenol，totalanthocyanin and total tannin ofwine affected by processing 1（3 g/L of inactivated yeast at 5 th day）and the contentof caffeic acid，chlorogenic acid，rutin，（+）-catechin，ellagic acid and gallic acid in processing 3（3 g/L of inactivated yeastat 25 th day）behaved maximum.Among the antioxidation activity assay，the reducing power，DPPH·and ABTS+·clearance rate had raised varying degrees.Thus，the inactivated yeast can increasing the content of phenolsubstances in CabernetSauvignonwine and improving itsantioxidantactivity.

inactived yeast；wine；phenolics；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.030

2016-06-14

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)業(yè)體系-葡萄產(chǎn)業(yè)體系（CARS-30gj-3）

李俊娥（1991—），女（漢），碩士研究生，主要從事食品高新技術(shù)研究。

*通信作者：魏新元（1971—），男（漢），副教授，主要從事食品安全及食品高新技術(shù)研究。