郭建軍，周藝，孫海燕，王婉瑩，許利嘉

（1.安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順561000；2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550000；3.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳518055；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京100193）

響應(yīng)面法優(yōu)化朵貝茶抗氧化活性的沖泡工藝

郭建軍1，周藝2，孫海燕3，王婉瑩4，許利嘉4

（1.安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順561000；2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550000；3.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳518055；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京100193）

以安順朵貝茶為原料，采用DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)沖泡溫度、沖泡次數(shù)、沖泡時(shí)間、料液比、水質(zhì)和沖泡方法進(jìn)行研究，采用響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化朵貝茶的沖泡工藝。結(jié)果表明，朵貝茶的料液比為1∶48（g/mL），單次沖泡時(shí)間為3.8min，沖泡溫度為80℃時(shí)，茶湯的DPPH自由基清除活性最高。

朵貝茶；抗氧化；沖泡工藝；響應(yīng)面

自1956年自由基衰老學(xué)說(shuō)創(chuàng)立以來(lái)[1]，針對(duì)自由基的生命科學(xué)研究日益深入，許多疾病如神經(jīng)疾病、癌癥、免疫紊亂、心血管疾病及內(nèi)臟器官的損傷或老化，都與自由基導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有關(guān)[2]。因此，抗氧化劑的開(kāi)發(fā)已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

茶葉是山茶科植物，具有良好的抗氧化活性。化學(xué)研究表明茶葉中富含茶多酚、茶多糖、茶氨酸等活性成分，藥理研究顯示茶葉具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、改善心血管疾病和抗衰老等多種功效[3-4]。茶多酚作為茶葉中的主要活性物質(zhì)，可減輕機(jī)體氧化水平，增加抗氧化物酶的活力，其抗氧化活性遠(yuǎn)優(yōu)于VC[5-7]。此外，茶葉中的茶多糖、微量元素和維生素類也可增加茶葉的抗氧化活性[8-9]。

朵貝茶（DuobeiTea）是貴州的歷史名茶，產(chǎn)于安順市普定縣化處鎮(zhèn)境內(nèi)1300米的高山上，自明初洪武年間便作為貢品供奉皇室[10]。貴州省茶葉科學(xué)研究所研究結(jié)果表明，朵貝茶富含茶多酚、黃酮、氨基酸等多種化學(xué)物質(zhì)。但朵貝茶的抗氧化活性和沖泡工藝研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以朵貝茶為原料，通過(guò)單因素和響應(yīng)面法研究其最佳沖泡條件，采用DPPH法評(píng)價(jià)茶葉的抗氧化活性，為科學(xué)指導(dǎo)朵貝茶的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

朵貝茶：一芽一葉，2015年3月產(chǎn)，貴州普定；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；XPE-205型電子分析天平：美國(guó)METTLER TOLEDO；MQX200R2全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio Tek。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1清除DPPH自由基能力的測(cè)定

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）分子結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)大π鍵以及多個(gè)-NO2吸電子基團(tuán)，使夾在中間的氮自由基能穩(wěn)定存在，這種穩(wěn)定的DPPH自由基被清除的能力，為評(píng)價(jià)抗氧化活性提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、可靠的方法。目前在評(píng)價(jià)生物樣品、食品以及植物提取物等的體外抗氧化活性方面得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)MiliauskasG[11]等的DPPH分析法，本文對(duì)DPPH自由基清除試驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)。取朵貝茶茶湯和DPPH無(wú)水乙醇溶液（2×10-4mol/L）各2mL混合，進(jìn)行30min暗室反應(yīng)。在517 nm最大波長(zhǎng)處，用無(wú)水乙醇調(diào)零，測(cè)吸光度A0；DPPH醇溶液混合液和無(wú)水乙醇各2mL，測(cè)吸光度A2；無(wú)水乙醇混合液和樣液各2mL，測(cè)吸光度A1。

計(jì)算公式為：DPPH清除率/%=[1－（A0－A1）/A2]×100

樣品DPPH自由基清除率為重復(fù)3次測(cè)定后的均值。在一定范圍內(nèi)可以用清除率的大小來(lái)表示樣品液抗氧化活性的能力[12]。

1.2.2單因素試驗(yàn)

以朵貝茶為樣品，以日常沖泡條件為基礎(chǔ)，設(shè)置不同的沖泡溫度、料液比、沖泡時(shí)間、沖泡次數(shù)、沖泡水質(zhì)、沖泡器皿等試驗(yàn)條件，采用DPPH自由基法考察不同試驗(yàn)因素對(duì)朵貝茶茶湯抗氧化活性的影響。

1.2.2.1沖泡溫度

稱取1.0g的朵貝茶，加入50mL純凈水，按沖泡次數(shù)為1次，沖泡時(shí)間為4min，考察不同沖泡時(shí)間對(duì)朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡溫度為60、70、80、90、100℃，采用DPPH自由基清除率檢測(cè)朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.2料液比

稱取1.0g的朵貝茶，加入純凈水，按沖泡次數(shù)為1次，沖泡時(shí)間為4min，沖泡溫度為80℃，考察不同料液比對(duì)朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡料液比為1∶40、1∶50、1∶60、1∶80、1∶100（g/mL），采用DPPH自由基清除率檢測(cè)朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.3沖泡時(shí)間

稱取1.0 g的朵貝茶，加入50mL的純凈水，按沖泡次數(shù)為1次，沖泡溫度為80℃，考察不同沖泡時(shí)間對(duì)朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡時(shí)間為2、4、6、8、10min，采用DPPH自由基清除率檢測(cè)朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.4沖泡次數(shù)

稱取1.0 g的朵貝茶，加入50mL的純凈水，按沖泡時(shí)間為4min，沖泡溫度為80℃，考察不同沖泡次數(shù)對(duì)朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡次數(shù)為1、2、3、4、5、6次，采用DPPH清除率檢測(cè)朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.5水質(zhì)

稱取1.0 g的朵貝茶，加入50mL的水，按沖泡次數(shù)為1次，沖泡溫度為80℃，沖泡時(shí)間為4min，考察不同沖泡水質(zhì)對(duì)朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡水為自來(lái)水、娃哈哈礦泉水、純凈水和超純水，采用DPPH自由基清除率檢測(cè)朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.6其它沖泡因素

稱取1.0 g的朵貝特級(jí)茶，下投法放入玻璃杯中，加入50mL、80℃的純凈水沖泡1次，沖泡時(shí)間為4min，考察不同沖泡方法對(duì)朵貝茶抗氧化活性的影響。分別設(shè)置沖泡方法為蓋瓷杯、上投法及朵貝普通級(jí)茶，采用DPPH自由基清除率檢測(cè)朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.3響應(yīng)面分析試驗(yàn)

采用Design Expert8.0，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，基于單因素不變的條件下，選取朵貝茶的A沖泡時(shí)間（min）、B沖泡溫度（℃）和C料液比（g/mL）為自變量，響應(yīng)值為朵貝茶茶湯的DPPH自由基清除率（%）。應(yīng)用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化朵貝茶抗氧化活性的沖泡工藝，響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab le1 Factorsand levelsof responsesurfaceexperim ents

2結(jié)果與分析

2.1朵貝茶抗氧化活性單因素試驗(yàn)

2.1.1沖泡溫度

溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effectof temperatureon theDPPH inhibition

如圖1，朵貝茶茶湯DPPH自由基清除率隨溫度的升高而先增加后減少，80℃時(shí)達(dá)到最高值。分析原因可能是當(dāng)沖泡溫度為60℃時(shí)，較低的沖泡溫度影響了朵貝茶中有效成分的溶解，導(dǎo)致清除率較低；過(guò)高的沖泡溫度，使朵貝茶的熟化速度加快，窒塞了有效成分的溶解，導(dǎo)致茶湯清除率受影響；當(dāng)水溫達(dá)到100℃時(shí)，可能是加快了朵貝茶中有效成分的溶解，導(dǎo)致茶湯自由基清除率增大。而沖泡溫度過(guò)高，易導(dǎo)致有效成分發(fā)生變化。因此，選擇沖泡溫度70、80、90℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2料液比

料液比對(duì)DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effectof solid-liquid ratio on the DPPH inhibition

如圖2，朵貝茶茶湯DPPH自由基清除率隨料液比的升高而先增加后減少，料液比1∶50（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，可能因溶劑量過(guò)少，抗氧化有效成分溶出量較少。而料液比超過(guò)1∶50（g/mL）后，溶劑量增加，茶湯中有效成分濃度降低，導(dǎo)致DPPH自由基清除率降低。因此，選擇沖泡溫度1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3沖泡時(shí)間

沖泡時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖3。

如圖3，朵貝茶中有效成分的DPPH自由基清除率總體先增大后減小，在4min時(shí)為最大值。在0至4min時(shí)，隨著沖泡時(shí)間增加，朵貝茶茶湯中的有效成分逐漸增多。4min以后，部分有效物質(zhì)被氧化，導(dǎo)致朵貝茶茶湯DPPH自由基清除率降低。8min時(shí)DPPH自由基清除率稍有上升可能是因?yàn)橛衅渌镔|(zhì)溶出。因此，選擇沖泡時(shí)間6、4、2min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 沖泡時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effectof tim eon the DPPH inhibition

2.1.4沖泡次數(shù)

沖泡次數(shù)對(duì)DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖4。

如圖4，隨著沖泡次數(shù)的增加，朵貝茶茶湯DPPH自由基清除率隨之降低，前2次沖泡的茶湯DPPH自由基清除率明顯高于后幾次。表明第1次沖泡后茶葉中還有較多的抗氧化活性成分未浸出，沖泡第2次時(shí)抗氧化活性成分溶出雖有降低但仍在大量浸出，而沖泡至3次～6次時(shí)抗氧化活性成分溶出明顯減少，尤其是沖泡次數(shù)超過(guò)4次，茶湯口感明顯變差[13]。考慮茶質(zhì)和湯色，沖泡次數(shù)選擇1次～3次較好。

2.1.5水質(zhì)

水質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 水質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effectofwater on theDPPH inhibition

如圖5，超純水和純凈水沖泡的抗氧化活性大于自來(lái)水和礦泉水。分析原因可能是自來(lái)水含無(wú)機(jī)鹽和多種微量元素與茶湯中的有效成分結(jié)合，導(dǎo)致DPPH自由基清除率減小。考慮到日常生活的應(yīng)用性，因此，選擇純凈水為沖泡水質(zhì)。

2.1.6其它沖泡因素

其他因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 其他因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effectof other factorson theDPPH inhibition

如圖6，選用蓋瓷杯沖泡的茶湯抗氧化活性高于玻璃杯沖泡，朵貝特級(jí)茶沖泡的茶湯抗氧化活性高于朵貝普通級(jí)茶。另外，茶葉采用下投法的茶湯抗氧化活性高于上投法。故在日常生活中，沖泡器皿建議選擇蓋瓷杯及采用下投法沖泡優(yōu)質(zhì)朵貝茶。

2.2響應(yīng)面分析及驗(yàn)證

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，選擇朵貝茶的A沖泡時(shí)間（min）、B沖泡溫度（℃）和C料液比（g/mL）為自變量，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，響應(yīng)值為朵貝茶的DPPH自由基清除率（%），結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Resultsof response surfaceexperiments

表3 響應(yīng)面方程的方差分析Table3 Analysis resultsof regression and variance

續(xù)表3響應(yīng)面方程的方差分析Continue table3 Analysis resultsof regression and variance

通過(guò)響應(yīng)面軟件，得到回歸方程為：朵貝茶DPPH自由基清除率/%=+72.6-0.94×C+0.53×A×B+ 1.80×A×C-0.65×B×C-1.83×A2-2.14×B2-3.01×C2。

2.2.2響應(yīng)曲面優(yōu)化和驗(yàn)證

根據(jù)回歸方程得出各因素（A、B、C）所構(gòu)成三維空間的響應(yīng)曲面分析圖。由圖7～圖9結(jié)果可知，料液比對(duì)DPPH自由基清除率的線性效應(yīng)極顯著，比較各因子間交互作用，沖泡時(shí)間與沖泡溫度、沖泡溫度與料液比交互作用均顯著，沖泡時(shí)間、料液比對(duì)DPPH自由基清除率的曲面效應(yīng)極顯著。此時(shí)，該方程P＜0.000 1，極顯著，其校正決定系數(shù)R2Adj=0.975 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 2，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合度較好，應(yīng)用此響應(yīng)曲面法優(yōu)化朵貝茶抗氧化的沖泡工藝是可行的。

圖7 料液比和溫度交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surfaceof solid-liquid and temperature

圖8 料液比和時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Responsesurfaceof solid-liquid and time

圖9 時(shí)間和溫度交互作用的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surfaceof tim eand tem perature

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化朵貝茶沖泡條件為：料液比1∶48.09（g/mL），溫度80.37℃，時(shí)間3.79min，此時(shí)朵貝茶的DPPH自由基清除率為72.69%。考慮到日常情況，朵貝茶的沖泡工藝優(yōu)化為：料液比1∶48（g/mL），溫度80℃，時(shí)間3.8min，在此優(yōu)化條件下重復(fù)試驗(yàn)，最終得出朵貝茶的DPPH自由基清除率試驗(yàn)值為72.63%，接近響應(yīng)曲面回歸方程值72.69%。

3結(jié)論

本文以抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別探討了茶葉等級(jí)、水質(zhì)、沖泡器皿、投放方法、單次沖泡時(shí)間、沖泡溫度、料液比、沖泡次數(shù)等8個(gè)因素對(duì)朵貝茶DPPH自由基清除率的影響。采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，研究沖泡時(shí)間、沖泡溫度和料液比對(duì)朵貝茶抗氧化活性的影響，最終確定最佳沖泡條件為：時(shí)間3.8min，溫度80℃，料液比1∶48（g/mL），此時(shí)朵貝茶的抗氧化活性達(dá)到最高，DPPH自由基的清除率達(dá)72.63%。朵貝茶是貴州歷史名茶、國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品、安順市地方特色產(chǎn)品，對(duì)于朵貝茶資源的開(kāi)發(fā)，可變資源優(yōu)勢(shì)為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

[1]Harman D.California radiation laboratory report[M].California:California Radiation Laboratory,1955:3038

[2]JamesPKehrer,Lars-Oliver Klotz.Free radicalsand related reactive species asmediators of tissue injury and disease:implications for Health[J].CriticalReviews in Toxicology,2015,45(9):765-798

[3]李海琳,成浩,王麗鴛,等.茶葉的藥用成分、藥理作用及開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(31):10833-10835,10838

[4]張建海,馮彬彬.茶葉主要藥效成分的藥理作用及應(yīng)用[J].寧夏農(nóng)林科技,2012,53(1):84-85,90

[5]Yiannakopoulou ECh.Targeting oxidative stress response by green tea polyphenols:clinical implications[J].Free Radical Research, 2013,47(9):667-671

[6]Ling JX,WeiF,LiN,etal.Amelioration of influenza virus-induced reactive oxygen species for-mation by epigallocatechin gallate derived from green tea[J].Acta PharmacolSin,2012,33(12):1533-1541

[7]Brückner M,Westphal S,Domschke W,et al.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate s-hows therapeutic antioxidative effects in amurinemodelofcolitis[J].JCrohnsColitis,2012,6(2):226-235

[8]聶少平,謝明勇,羅珍,等.用清除有機(jī)自由基DPPH法評(píng)價(jià)茶葉多糖的抗氧化活性[J].食品科學(xué),2006,27(3):34-36

[9]周彤,熊麗萍,楊紹虞.茶葉的抗氧化作用研究[J].世界元素醫(yī)學(xué), 2005,12(2):42-44

[10]貴州省普定縣地方志纂委員會(huì).普定縣志[M].貴陽(yáng):貴州人民出版社,1999

[11]MiliauskasG,Venskutonis PR,Van Beek TA.Screening of radical scavenging activity of somemedicinaland aromaticplantextracts[J]. Food Chemistry,2004,85:231-237

[12]王婉瑩,張?chǎng)维?肖偉,等.Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)藤茶抗氧化活性的最優(yōu)沖泡工藝[J].食品工業(yè)科技,2014,32(9):216-220

[13]胡迎芬,杭瑚.飲茶方式對(duì)茶湯有效成分含量的影響[J].食品工業(yè)科技,2002,23(2):27-29

Optim ization of Brew ing Conditions for the Antioxidant Activity of Duobei Tea by Response Surface M ethod

GUO Jian-jun1，ZHOUYi2，SUNHai-yan3，WANGWan-ying4，XU Li-jia4
（1.CollegeofAgriculture，Anshun University，Anshun 561000，Guizhou，China；2.Schoolof Pharmaceutical Sciences，Guizhou University，Guiyang550000，Guizhou，China；3.Shenzhen InstitutesofAdvanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518055，China；4.Institute ofMedicinalPlant Development，Chinese Academy ofMedicalSciences，Beijing100193，China）

DuobeiTeawasused asmaterial to study ofbrewing temperature，brewing time，material liquid ratio andwaterquality by using DPPH free radicalscavenging rate.And through the response surface analysis to optimize brewing conditionsof Duobei Tea.Our result indicated that the bestbrewing conditionswerematerial liquid ratio 1∶48（g/mL），brewing time 3.8min and brewing temperature 80℃.At this time the tea ofDPPH free radicalscavenging ratewas thehighestavailable.The studieshad shown that the tea had good antioxidantactivity under the optimalprocess conditions.DuobeiTeawith good antioxidantactivity had the potential to be developed as a natural antioxidant.For scientifically drinking and utilizing of Duobei Tea provides valuable references.

DuobeiTea；antioxidantacitivity；dailybrewing tea；responsesurfaceanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.023

2016-10-26

貴州省科技合作計(jì)劃（黔科合LH字[2015]7693號(hào)）；貴州省教育廳青年科技人才成長(zhǎng)項(xiàng)目（黔教合KY字[2016]277）

郭建軍（1986—），男（漢），講師，碩士，研究方向：應(yīng)用生物化學(xué)與天然產(chǎn)物研究。