李志濤，趙娟娟，王敏，郭繼平，朱冰清

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水053000）

復(fù)合食用菌多糖的免疫活性研究

李志濤，趙娟娟，王敏，郭繼平，朱冰清

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水053000）

研究了香菇、靈芝、平菇多糖按一定的比例混合得到的復(fù)合食用菌多糖對(duì)小鼠免疫活性的影響。小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合食用菌多糖在低劑量下即對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能有顯著提高作用；非特異性免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)小鼠的非特異性免疫功能只有在中劑量組和高劑量組才顯示出增強(qiáng)作用；體液免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合多糖在低劑量下即對(duì)小鼠體液免疫功能有顯著提高作用。動(dòng)物體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，在適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鷥?nèi)，與單一食用菌多糖相比，食用菌復(fù)合多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)功能。

食用菌；復(fù)合多糖；免疫活性

國(guó)內(nèi)一些研究表明香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖均具有提高免疫能力的作用[1-3]。目前對(duì)食用菌多糖的免疫活性研究主要集中在研究單一食用菌多糖方面，而對(duì)復(fù)合多糖的免疫活性的研究很少。本文研究了香菇、靈芝、平菇多糖以一定比例復(fù)合后的復(fù)合食用菌多糖的免疫活性，為將來進(jìn)一步將其開發(fā)成免疫調(diào)節(jié)劑提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

香菇、靈芝、平菇：市售。

1月齡清潔級(jí)小鼠[體重（20±2）g]：由天津醫(yī)科大學(xué)提供。

RPMI1640完全培養(yǎng)液：Gibco公司；刀豆蛋白：Sigma公司；噻唑藍(lán)：Sigma公司；臺(tái)盼藍(lán)：Amresco公司；胎牛血清：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。

1.2試驗(yàn)儀器

FA1104A型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；Finnpipette移液器（100μL～1 000μL）：熱電（上海）儀器有限公司；EMS-9B型加熱磁力攪拌器：天津歐諾儀器儀表有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面潔凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；752型分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

將香菇、靈芝、平菇分別通過沸水浸提，95%乙醇沉淀后，經(jīng)冷凍干燥得粗多糖。根據(jù)3種粗多糖中的活性多糖含量，將3種多糖分別按質(zhì)量比1∶0.5∶1的比例混合得到復(fù)合食用菌多糖。測(cè)定該復(fù)合多糖的含量為7.1%。

1.3.1細(xì)胞免疫試驗(yàn)

參照毛學(xué)英[4]的方法進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)以及OD值（光密度）的測(cè)定：將小鼠處死，取脾臟制備細(xì)胞懸液。在酶標(biāo)板的每個(gè)孔加100μL細(xì)胞懸液，然后加入20μL完全培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照；加10μL完全培養(yǎng)液，10μLCon A（刀豆蛋白A）作為陽性對(duì)照；取香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復(fù)合食用菌多糖分別配制成低、中、高劑量（分別為0.1、0.5、1mg/mL）組，陽性試驗(yàn)孔上同時(shí)加入10μLConA和10μL樣品，在CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中進(jìn)行孵育72h。在培養(yǎng)結(jié)束前7小時(shí)時(shí)每個(gè)孔加入10μLMTT（噻唑藍(lán)，劑量為5mg/mL），培養(yǎng)結(jié)束以后每個(gè)孔加100μL 10%的SDS（十二烷基硫酸鈉），然后測(cè)OD490nm值。免疫調(diào)節(jié)活性用刺激指數(shù)（Stimulate index，SI）來表示。SI值越大，代表樣品免疫調(diào)節(jié)活性越強(qiáng)。

1.3.2非特異性免疫試驗(yàn)

用碳粒廓清試驗(yàn)[5]檢測(cè)4種樣品對(duì)小鼠的非特異性免疫的影響。

將78只小鼠隨機(jī)分成13組，每組為6只。取香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復(fù)合食用菌多糖分別配制成低、中、高劑量（分別為0.1、0.5、1mg/mL）組，以生理鹽水作為對(duì)照。每天灌胃1次，直至15天后結(jié)束。最后一次灌胃一天后，用印度墨汁對(duì)尾靜脈進(jìn)行注射，每只小鼠體重注射0.2mL墨汁，在注入后的第2、10分鐘，分別從內(nèi)眥靜脈叢中取血20μL，然后加入到2mL 0.1% Na2CO3當(dāng)中。用0.1%Na2CO3為空白對(duì)照，測(cè)OD600nm值。試驗(yàn)結(jié)束以后稱量小鼠的體重、肝重、脾臟重。計(jì)算吞噬速率（K）、校正吞噬指數(shù)（a）：

式中：t1、t2分別表示第2、10分鐘的采血時(shí)間；OD1和OD2分別表示t1和t2時(shí)對(duì)應(yīng)樣品的OD600nm。

1.3.3體液免疫試驗(yàn)

用定量溶血分光光度法[6]測(cè)小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞生成含量。

試驗(yàn)小鼠分組的方法與灌胃劑量與1.3.2試驗(yàn)相同。每組為8只小鼠，每天灌胃1次，30天后灌胃結(jié)束。試驗(yàn)結(jié)束前5天，對(duì)小鼠腹腔注射2%的綿羊紅細(xì)胞進(jìn)行免疫。對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后，通過檢測(cè)溶血過程中血紅蛋白的量來反映其抗體產(chǎn)生的水平，在一定程度上能夠代表機(jī)體的體液免疫水平[7]。試驗(yàn)結(jié)束后，取小鼠的脾臟研磨，PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌。離心10min（轉(zhuǎn)速為2 000 r/min），取沉淀，之后加入1mL紅細(xì)胞裂解液，靜置10min后再次離心，加入2mLPBS懸浮。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法使細(xì)胞的劑量為5×106CFU/mL。取該懸液0.5mL，分別取1mL 0.2%的SRBC（綿羊紅細(xì)胞）和10%的豚鼠血清加入其中，對(duì)照組中不加懸液，用PBS補(bǔ)充。在37℃下溫育，1 h后離心10min（轉(zhuǎn)速為2 500 r/min），取其上清液，測(cè)OD430nm值。用OD430nm表示脾臟抗體形成細(xì)胞生成含量。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞免疫試驗(yàn)

4種樣品在不同劑量下對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性影響如表1所示。

表1 4種樣品在不同劑量下對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的影響Table1 Effectsof different dosagesof four kindsof sampleson sp lenic lymphocytemultiplication

從表1所示可以看出，低、中、高劑量的香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復(fù)合食用菌多糖與對(duì)照組相比刺激指數(shù)差異都顯著（P＜0.05），這表明了4種樣品在不同劑量下對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性均有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)復(fù)合多糖劑量為0.5mg/mL時(shí)，與香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖相比刺激指數(shù)差異都顯著（P＜0.05），與其他樣品相比免疫調(diào)節(jié)活性最高，表明在適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鷥?nèi)，與單一食用菌多糖相比，復(fù)合食用菌多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)功能；但是當(dāng)劑量在超過0.5mg/mL時(shí)，免疫調(diào)節(jié)活性沒有相應(yīng)的提高，卻呈下降的趨勢(shì)，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖呈現(xiàn)一定的濃度效應(yīng)，表明復(fù)合多糖的劑量過高，并不能夠相應(yīng)地提高小鼠的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性，這說明劑量與提高小鼠的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性沒有線性關(guān)系，導(dǎo)致這種情況發(fā)生的原因還有待于進(jìn)一步研究。

2.2非特異性免疫試驗(yàn)

當(dāng)細(xì)菌等外源性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體以后，可迅速被單核-巨噬細(xì)胞吞噬和清除，因此，巨噬細(xì)胞校正吞噬指數(shù)的多少可以反映吞噬功能的強(qiáng)弱[4]。4種樣品在不同劑量下對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力的影響如表2所示。

表2 4種樣品在不同劑量下對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力的影響Table2 Effectsof different dosagesof four kindsof sampleson phagocytosisability ofmacrophage

由表2可以看出，低劑量的香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復(fù)合食用菌多糖與對(duì)照組相比差異不顯著，中劑量組和高劑量組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），表明4種低劑量樣品不能顯著提高小鼠清除碳顆粒的能力，不能對(duì)小鼠的免疫力產(chǎn)生良好的效應(yīng)，而中、高劑量樣品能顯著提高小鼠清除碳顆粒的能力，可能是食用菌多糖可以激活處于抑制狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，又能夠顯著提高已經(jīng)處于活化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞的功能，從而增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫功能。中、高劑量復(fù)合食用菌多糖與香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖相比差異顯著（P＜0.05），其校正吞噬指數(shù)最高，對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞吞噬碳顆粒的能力顯著提高。由試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)復(fù)合食用菌多糖達(dá)到一定劑量后，隨著劑量的增加能顯著提高小鼠清除碳顆粒的能力。

2.3體液免疫試驗(yàn)

在小鼠的腹腔內(nèi)注射綿羊紅細(xì)胞后，其B淋巴細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生抗綿羊紅細(xì)胞抗體，通過補(bǔ)體的參與使細(xì)胞溶解，然后通過檢測(cè)血紅蛋白的含量反映抗體產(chǎn)生水平，以此代表機(jī)體的體液免疫水平[7]。4種樣品在不同劑量下小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞生成含量的影響如表3所示。

表3 4種樣品在不同劑量下對(duì)小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞生成含量的影響Table3 Effectsof different dosagesof four kindsof sam pleson productiveability of splenic antibody form ing cells inm ice

由表3可以看出，低、中、高劑量的香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復(fù)合食用菌多糖與對(duì)照組相比，小鼠抗體細(xì)胞生成含量差異顯著（P＜0.05），這表明4種樣品在不同劑量下對(duì)小鼠抗體細(xì)胞生成含量均有促進(jìn)作用。高劑量復(fù)合食用菌多糖與香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖相比差異顯著（P＜0.05）。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)樣品達(dá)到一定劑量后，隨著灌胃劑量的增加，樣品對(duì)小鼠抗體細(xì)胞生成含量的影響逐漸提高，尤其是復(fù)合食用菌多糖提高最明顯，這表明復(fù)合食用菌多糖對(duì)機(jī)體體液免疫具有正調(diào)節(jié)作用。

3討論

評(píng)價(jià)一種樣品對(duì)機(jī)體免疫功能影響，至少要觀察細(xì)胞免疫、非特異性免疫與體液免疫各一種，才能確認(rèn)其對(duì)免疫功能的影響。本文就這3個(gè)方面考察了3種單一食用菌多糖和復(fù)合食用菌多糖對(duì)正常小鼠免疫功能的影響。本試驗(yàn)研究表明，復(fù)合食用菌多糖在低劑量下即對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能有顯著提高作用，但對(duì)小鼠的非特異性免疫功能只有在中劑量組和高劑量組才顯示出增強(qiáng)作用，動(dòng)物體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，將香菇、靈芝、平菇多糖按一定比例復(fù)合后，在適當(dāng)?shù)膭┝肯?，與單一食用菌多糖相比，復(fù)合食用菌多糖能顯著提高小鼠的免疫功能，以上結(jié)果說明復(fù)合食用菌多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)功能。復(fù)合食用菌多糖比單一食用菌多糖對(duì)小鼠免疫功能提高明顯，這可能是3種單一食用菌多糖復(fù)合后能相互補(bǔ)充，起到了協(xié)同增效的效果，這種情況發(fā)生的機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

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Study on the Immune Effects of Edible Fungus Polysaccharides Compounds

LIZhi-tao，ZHAO Juan-juan，WANGMin，GUO Ji-ping，ZHUBing-qing
（Departmentof Life Science，HengshuiUniversity，Hengshui053000，Hebei，China）

Thisstudywasperformed to determinate immunoregulatory activity of themixture ofpolysaccharides of Lentinus edodes，Ganoderma luncidum and Pleurotus ostreatus.Splenic lymphocyte immunity：in the situation of low doses，polysaccharides compounds significantly promoted the splenic lymphocyte immunity inmice.Non-special immunity：polysaccharides compoundsonly atbothmedium and high doses significantly promoted the non-special immunity in mice.Humoral immunity：in the situation of low doses，polysaccharides compounds significantly promoted the humoral immunity inmice.All of the animal test showed thatedible fungus polysaccharides compounds significantly promoted the immunologic function inmice.atmoderate dose comparingwith single edible funguspolysaccharide.

edible fungus；polysaccharidescompounds；immunoregulatoryactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.009

2016-09-10

李志濤（1983—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)。