涂文亞，曾 馳

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

脊柱關(guān)節(jié)病致敏蛋白HLA-B27的非經(jīng)典同源二聚體的表達(dá)與純化

涂文亞，曾 馳

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)與人體白細(xì)胞抗原HLA-B27編碼基因高度相關(guān)。強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確。HLA-B27重鏈同源二聚導(dǎo)致強(qiáng)直性脊柱炎的假說近年來受到關(guān)注。但是一直缺乏結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)去分析證實(shí)這種假說。解析HLA-B27同源二聚體的結(jié)構(gòu)有望從結(jié)構(gòu)角度闡明強(qiáng)直性脊柱炎的分子機(jī)理，并為后續(xù)的藥物設(shè)計和過敏預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。本研究在E.coli中表達(dá)出包涵體形式的HLA-B27蛋白，將包涵體溶解、復(fù)性和純化。最終從20 mg HLA-B27包涵體中得到0.2 mg純度高且性狀均一的HLA-B27同源二聚體，為獲得高質(zhì)量HLA-B27同源二聚體蛋白晶體及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)奠定了重要基礎(chǔ)。

強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎;HLA-B27;同源二聚體;純化

1 引言

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthritides, SpA)的一種，屬于風(fēng)濕性疾病。強(qiáng)直性脊柱炎與HLA-b27基因高度相關(guān)，94%的強(qiáng)直性脊椎炎患者其HLA-B27抗原表達(dá)為陽性[1]。強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，有效的治療方案也比較匱乏。關(guān)于HLA-B27致強(qiáng)直性脊柱炎機(jī)制，主要有2種假說[2]。

第一種假說是風(fēng)濕性病原多肽提呈理論。HLA(人體白細(xì)胞抗原)在體內(nèi)承擔(dān)1種經(jīng)典角色，即與β2m(β2-微球蛋白)、病原多肽形成異源三聚復(fù)合物，提呈多肽被TCR(T細(xì)胞受體)識別，激活T細(xì)胞，引發(fā)下游炎癥反應(yīng)[3]。HLA-B27可能也是通過類似方式，將人體的某些與抗原肽高度相似的內(nèi)源肽提呈給TCR，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，并且這種反應(yīng)是持續(xù)的[4]。第二種假說是HLA-B27重鏈(heavy chain)的非經(jīng)典的錯誤折疊理論。HLA-B27的重鏈會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的裝配過程中錯誤折疊導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力反應(yīng)和自噬反應(yīng)[5]。Allen等人首先在體外發(fā)現(xiàn)了HLA-B27的重鏈在缺乏β2m的情況下，67位的Cys之間產(chǎn)生二硫鍵，形成同源二聚體(B272)，并且在培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面也檢測到了這種二聚體的存在[6]。因此引發(fā)猜想，人體內(nèi)的細(xì)胞表面有這種非常規(guī)的二聚體存在時就會致病，而且這種二聚體僅形成于特定HLA-b27基因型中[7]。這也正好呼應(yīng)了強(qiáng)直性脊柱炎與HLA-b27基因高度相關(guān)而與其他基因型關(guān)聯(lián)度低的問題。

HLA-B27重鏈同源二聚導(dǎo)致強(qiáng)直性脊柱炎的假說是近年來的研究熱點(diǎn)。但是一直缺乏結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)去分析證實(shí)這種假說。解析HLA-B27同源二聚體的結(jié)構(gòu)有望從結(jié)構(gòu)角度闡明強(qiáng)直性脊柱炎的分子機(jī)理，并為后續(xù)的藥物設(shè)計和過敏預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過原核表達(dá)、體外復(fù)性、純化得到純度高且性狀均一的HLA-B27同源二聚體蛋白，為獲得高質(zhì)量HLA-B27同源二聚體蛋白晶體及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)奠定了重要基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 儀器設(shè)備及材料

UH06高壓破碎儀(上海永聯(lián)生物)；ZQZY-CT振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器)；4 ℃冷柜(中科美菱)；pH計(賽多利斯，北京)；ST40R離心機(jī)(美國Thermo)；超濾管Centrifugal Filter Units(美國Millipore)；Biologic Duo Flow FPLC(美國Bio-rad)；HP Q預(yù)裝柱(美國GE)；Superdex 200 10/300 GL分子篩預(yù)裝柱(美國GE)。

2.2 方法

2.2.1 HLA-B27的原核表達(dá)

將HLA-B*2705(HLA-B*2705是最普遍的HLA-B27亞型)的胞外序列(24-299aa，全文特指HLA-B27)插入表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒構(gòu)建HLA-B27表達(dá)載體。將構(gòu)建的HLA-B27表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coli菌株Rosetta(DE3)。將轉(zhuǎn)化子菌株接入1.5L LB培養(yǎng)基中，搖菌(37 ℃ 200 r/min)。待菌液OD600nm達(dá)到0.6—0.8時，加入終濃度1 mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)搖菌(37 ℃，200 r/min)4 h；冷凍離心(4 500 g，10 min,4 ℃)收菌。

2.2.2 包涵體提取

向收集的菌中加入50 mL重懸液(50 mM Tris-HCL,25% 蔗糖，1mM EDTA,1mM PMSF,10 mM DTT,pH 8.0)重懸，加入100 mL裂解液(50mM Tris-HCl,1% Triton X-100,1% 脫氧膽酸鈉，100 mM NaCl,10 mM DTT,pH 8.0)。菌懸液攪拌均勻后倒入高壓破碎儀破碎(700 bar，10 min)。將裂解物離心(10 000 g,15 min)。棄上清液，向沉淀中加入150 mL清洗液I(50 mM Tris-HCl,0.5% Triton X-100,100 mM NaCl,1 mM EDTA,1 mM DTT,1 mM PMSF,pH 8.0)，在磁力攪拌器上快速攪拌1 h,然后離心(10 000 g,15 min,4 ℃)。重復(fù)此步驟3次。棄上清液，向沉淀中加入100 mL清洗液II(50mM Tris-HCl,1 mM EDTA,1mM DTT,1mM PMSF,pH 8.0),在磁力攪拌器上快速攪拌1h,然后離心(10 000 g,15 min)。棄上清液，向沉淀中加入10 mL變性劑溶解液(20 mM Tris-HCL,8 M尿素,0.5 mM EDTA,1 mM DTT,1mM PMSF，pH 6.0,現(xiàn)配現(xiàn)用)，在研磨器中研磨加速溶解。將溶解后的包涵體溶液離心(18 000 g,2 h)。收集上清液，SDS-PAGE檢測，-80 ℃凍存。以上提取步驟均在4 ℃進(jìn)行。

2.2.3 復(fù)性

復(fù)性條件高通量篩選：按照文獻(xiàn)[8]配制96種復(fù)性溶液(如表1、表2所示)。在96孔板中每孔加入99 μL復(fù)性溶液和1μL包涵體蛋白(上步提取的HLA-B27包涵體)，置于震動搖床上震動，4 ℃復(fù)性36 h，Native-PAGE檢測。擴(kuò)大復(fù)性：根據(jù)篩選出來的條件配100 mL復(fù)性溶液，在轉(zhuǎn)子的快速攪拌下用注射器緩慢注入包涵體，1 mL包涵體溶液分3次注入，每隔12 h加一次，每次加入包涵體后再將轉(zhuǎn)子調(diào)至低速，復(fù)性36 h。

表1 前80種復(fù)性液(A-H，1-10)的成分組成

緩沖液(50mM)離子強(qiáng)度兩親試劑去垢劑(100mM)還原劑(10mM)添加劑NaAc，pH4MES，pH5MES，pH6TRIS，pH7TRIS，pH8CHES，pH9NaCl100mMNaCl200mMKCl200mM甘油20%(V/V)PEG40000．05%(W/V)PEG4000．05%(W/V)NDSB195NDSB201NDSB256β?MSH精氨酸800mM葡萄糖500mM混合物aEDTA1mM

注：以上濃度指加入蛋白之前的溶液濃度；“混合物a”包含以下成分(每種成分的濃度均為50 μM)：NADH, 鹽酸硫胺素, 生物素, CaCl2, MgCl2, CuSO4, ZnCl2, CoSO4, ADP, NiCl2。

表2 96孔復(fù)性板中每孔復(fù)性液的具體成分

123456789101112ApH4，β?MSH，精氨酸pH4，KCl，β?MSH，NDSB256，葡萄糖pH5，NaCl200mMpH5，KCl，葡萄糖pH6，KClpH7pH7，NDSB201，精氨酸pH8，KCl，β?MSH，NDSB201，精氨酸pH8，β?MSHpH9，甘油，NDSB201?GSH5mM?GSH5mM，GSSG5mM，DsbA10mMBpH4，β?MSH，NDSB256pH4，β?MSH，NDSB201，葡萄糖pH5，NDSB256pH5，混合物apH6，NDSB256，葡萄糖pH7，KClpH7，PEG4000，β?MSHpH8，葡萄糖pH8，NDSB201pH9，NaCl100mM，葡萄糖?GSH5mM，GSSG2mM?GSH2mM，GSSG5mM，DsbA10mMCpH4，NaCl100mM，β?MSHpH4，KCl，NDSB195pH5，EDTA，β?MSH，NDSB201pH6，PEG400，β?MSH，NDSB201pH6，甘油，β?MSHpH7，NaCl200mM，NDSB201pH7，NDSB195，葡萄糖pH8pH9，PEG4000，β?MSH，葡萄糖pH9，β?MSH，NDSB195，精氨酸?GSH5mM，GSSG5mM?GSSG5mM，DsbA10mMDpH4，甘油pH4，PEG4000，葡萄糖pH5，β?MSH，甘油pH6，β?MSH，NDSB195，葡萄糖pH6，EDTApH7，甘油，β?MSHpH7，EDTA，β?MSH，NDSB195pH8，PEG4000，NDSB195pH9，KCl，β?MSH，NDSB201，葡萄糖pH9，PEG400?GSH2mM，GSSG5mM?GSSG10mM，DsbA10mMEpH4，PEG400，葡萄糖pH5，EDTA，精氨酸pH5，PEG400，β?MSH，精氨酸pH6，甘油，NDSB256，精氨酸pH6，NaCl100mM，β?MSH，NDSB195pH7，PEG4000，NDSB256，精氨酸pH7，混合物apH8，β?MSH，葡萄糖pH9，β?MSHpH9?GSSG5mM?dbGroeL10mM

續(xù)表

注：“*”的成分為Tris(pH8),NaCl 150 mM,EDTA;GroEL是可溶的分子伴侶。

2.2.4 透析

將復(fù)性后的溶液倒入透析袋，再將透析袋放入4 L透析液(10 mMTris-HCl pH 8.0),轉(zhuǎn)子緩慢攪動下透析12 h。透析完成后進(jìn)行抽濾。

2.2.5 純化

通過蠕動泵上樣，將抽濾后的復(fù)性液流動穿過HP Q預(yù)裝柱。復(fù)性后的蛋白富集掛在Q柱上。然后將Q柱接到FPLC(快速蛋白液相色譜)進(jìn)行梯度洗脫純化。對應(yīng)檢測器顯示的洗脫峰取相應(yīng)的收集管進(jìn)行SDS-PAGE檢測。根據(jù)檢測結(jié)果取含有目的蛋白的樣品，用超濾管濃縮換液(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)，濃縮到200 μL上樣過Superdex 200 10/300 GL分子篩預(yù)裝柱。每個收集管收集體積0.5 mL。整個過程在4 ℃進(jìn)行。根據(jù)檢測峰取對應(yīng)的收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

3 結(jié)果與討論

3.1 HLA-B27的原核表達(dá)SDS-PAGE檢測

由SDS-PAGE的結(jié)果(圖1)可以看出，相比于未誘導(dǎo)的菌表達(dá)的總蛋白、加IPTG誘導(dǎo)后的菌的破碎上清液中的蛋白，誘導(dǎo)后的菌的破碎沉淀樣品在膠上有明顯加粗的條帶位于30—40 kD之間，HLA-B27的大小約為33 kD，說明HLA-B27在E.coli中表達(dá)為包涵體。

圖1 HLA-B27的原核表達(dá)SDS-PAGE檢測

3.2 HLA-B27包涵體提取溶解后的SDS-PAGE檢測

3 L菌表達(dá)的包涵體，最后用10 mL高濃度尿素溶液溶解，用梯度稀釋法點(diǎn)樣SDS-PAGE檢測，每孔點(diǎn)樣10 μL(圖2)。與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)比對可知溶解的包涵體濃度為20 mg/mL。

3.3 HLA-B27的復(fù)性條件篩選

由Native-PAGE結(jié)果(圖3)看出，在A10(50 mM CHES pH 9.0, 20% 甘油,100 mM NDSB201)條件下，在膠上可見幾條收斂的條帶。由于未變性的蛋白在Native-PAGE中的遷移速率是由蛋白的大小和表面電荷共同決定的，在Native-PAGE中能看到的收斂的條帶往往代表著此條帶的蛋白的大小和表面電荷等性狀一致，并且是具有一定結(jié)構(gòu)的。所以結(jié)果表明，HLA-B27包涵體在A10條件復(fù)性成功。

圖2 HLA-B27包涵體SDS-PAGE檢測

圖3 A10條件下的Native-PAGE

3.4 HLA-B27擴(kuò)大復(fù)性純化后的分子篩鑒定和SDS-PAGE檢測

由監(jiān)測器可以看出(圖4)，第1個出峰位置為8 mL(第16管)，第2個出峰位置為13 mL(第26管)。根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白過Superdex 200 10/300 GL分子篩的檢測圖譜比較可知，第1個峰為HLA-B27蛋白的多聚體，第2個峰出來的蛋白大小約為67 kD(圖5),正好與HLA-B27同源二聚體的大小(66 kD)相近。將在第2個峰收集的樣品(26管)，通過在上樣緩沖液里未加和加入β-巰基乙醇對比進(jìn)行SDS-PAGE(圖5)可以看出，加入β-巰基乙醇時蛋白條帶在33 kD處，未加β-巰基乙醇時蛋白條帶在66 kD處，進(jìn)一步證實(shí)第二個峰出來的蛋白確實(shí)是HLA-B27的同源二聚體，而且是通過二硫鍵形成的。通過膠圖的估算和Nanodrop測量，最終得到0.2 mg。

圖4 Superdex 200 10/300 GL分子篩純化圖

圖5 第二個峰樣品SDS-PAGE

4 結(jié)束語

本研究從3 L Rosetta(DE3)表達(dá)菌中提取和多步清洗溶解處理，得到較純的HLA-B27包涵體約200 mg。取20 mg包涵體作復(fù)性、透析、純化，最后得到HLA-B27同源二聚體蛋白0.2 mg，得率為1%。我們曾按照文獻(xiàn)[6]中的條件和方法進(jìn)行包涵體復(fù)性，當(dāng)尿素溶解后的包涵體加入配制好的復(fù)性溶液時，包涵體在復(fù)性溶液中迅速沉淀析出，無法復(fù)性。所以本實(shí)驗(yàn)選擇通過高通量篩選的方法，首先篩選出適合HLA-B27復(fù)性的條件，然后擴(kuò)大復(fù)性純化出目的蛋白HLA-B27同源二聚體，為以后的蛋白晶體生長以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

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Expression and purification of unconventional homodimer of spondyloarthritides associatied HLA-B27

TUWen-ya，ZENGChi

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

Ankylosing spondylitis is highly associated with a certain HLA allotype-HLA-B27. But the pathogenic role of HLA-B27 remains unclear. Recently,the theory of HLA-B27 homodimer inducing ankylosing spondylitis is becoming popular, but the corresponding structural evidence is lacked. The crystal structure data of HLA-b27 homodimer might provide the most intuitive evidence for this pathogenic mechanism and theoretical guidance for effective drug design and clinical treatment. In this study, the HLA-B27 protein was expressed inE.colias inclusion body. After refolding and purification, 0.2mg HLA-B27 homodimer with high purity and homogeneity was obtained from 20mg inclusion bodies, which laid an important foundation for obtaining high quality protein crystal and structure data of HLA-B27 homodimer.

ankylosing spondylitis;HLA-B27;homodimer;purification

2017-01-06.

涂文亞(1990-)，男，碩士研究生，E-mail:wenya_tu@163.com.

曾馳(1980-)，男，副教授，E-mail:232881046@qq.com.

2095-7386(2017)01-0048-06

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.010

Q 512

A