張勝男　張浩洋　張躍華

摘 要：對(duì)生物堆肥中的高溫纖維素分解菌進(jìn)行篩選及分離純化，探索其對(duì)纖維素的降解能力及生物學(xué)特性，研究對(duì)應(yīng)的菌種特性，使其純化利用于現(xiàn)代堆肥技術(shù)中以促進(jìn)東北黑土地的修復(fù)，改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)。采用透明圈法，篩選出此生物堆肥中的高溫纖維素分解菌；純化培養(yǎng)后比較其纖維素分解效率。通過(guò)篩選及分離純化共獲得有效菌種5種，分別命名為G1到G5，其中G2的濾紙失重率最高，可達(dá)70%，G1的濾紙失重率最低，為25%。生物堆肥中存在多種高溫纖維素分解菌，不同菌株對(duì)纖維素類物質(zhì)的分解能力具有一定的差異。

關(guān)鍵詞：堆肥；高溫纖維素分解菌；篩選；分離

中圖分類號(hào)：Q89 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170331001

引言

生物堆肥是利用微生物的特性生產(chǎn)具有優(yōu)異性能的有機(jī)肥料，是農(nóng)業(yè)固體有機(jī)廢棄物的有效利用重要方式[1]。堆肥秸稈中的纖維素是一種由葡萄糖組成的多糖，常溫下較為穩(wěn)定，是植物細(xì)胞壁的主要成分，由于其本身的結(jié)構(gòu)致密且難于降解，從而阻礙了堆肥技術(shù)的發(fā)展[2]。為推進(jìn)堆肥技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，目前，主要采用利用纖維素分解菌或其產(chǎn)生的酶來(lái)降解纖維素的生物手段對(duì)纖維素加以降解利用。在各種堆肥中，高溫放線菌是高溫條件下有機(jī)物的旺盛分解者，真菌對(duì)纖維素的分解和穩(wěn)定起重要角色[3]，其在堆肥的快速腐熟中具有重要作用。相對(duì)于其它微生物類群而言，現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的高溫放線菌的種類較少[4]。因此，篩選和分離純化高效纖維素分解菌的工作凸顯尤為迫切。佳木斯市地處中國(guó)東北部，屬北方高寒地帶。本文通過(guò)對(duì)該地區(qū)生物堆肥樣品中的高溫纖維素降解菌進(jìn)行篩選及分離的研究，篩選出5個(gè)耐高溫纖維素降解菌株，并用于降解堆肥中的纖維素成分，可促進(jìn)東北黑土地的修復(fù)，對(duì)于改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，增加土壤保水、保肥的能力，改善生物堆肥中纖維素的降解效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種采集

供試菌種分離于高溫堆肥（作物秸稈（玉米、水稻）、馬糞、牛糞等均按一定比例5：1：1混合而成，內(nèi)部溫度最高時(shí)可接近60℃），在此堆肥中選取帶有白色菌絲的作物秸稈，置于冰箱保存。

1.2 培養(yǎng)基

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：K2HPO4 1.0g，CMC-Na 3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，（NH4）2SO4 2.0g，胰蛋白胨1.0g，剛果紅0.0692g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH=7.0。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200.0g，葡萄糖 20.0g，

瓊脂 20.0g，蒸餾水1000mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏5.0g，蛋白胨10g，

NaCl 5.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0g，KNO3 1.0g，

K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4。

1.3 高溫纖維素分解菌的篩選

將采集的樣品置于無(wú)菌操作臺(tái)中，用消毒鑷子挑取白色菌絲，放入潔凈培養(yǎng)皿中，白色菌絲接于培養(yǎng)基中，置于50℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24h觀察1次，拍照并做相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)記錄，持續(xù)5d。觀察是否有透明圈出現(xiàn)。若出現(xiàn)透明圈，則證明為有分解纖維素能力的菌株，其中透明圈的通透度和直徑與該菌種的降解纖維素的效率呈正相關(guān)。

1.4 高溫纖維素分解菌的分離

選取培養(yǎng)基中出現(xiàn)透明圈的菌種，將其分別接在真菌、細(xì)菌、放線菌的培養(yǎng)基上，置于上述溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，觀察菌種生長(zhǎng)狀況用鏡檢手段幫助判斷。將菌種純化培養(yǎng)并保存。

1.5 CMC酶相對(duì)活性的計(jì)算及比較

參照文獻(xiàn)蔡燕飛等人的方法[5]，測(cè)量上述產(chǎn)生透明圈菌種的透明圈直徑，利用公式（1）計(jì)算不同菌種CMC酶的相對(duì)活性，數(shù)值越大代表該種菌CMC酶的相對(duì)活性越高。

1.6 濾紙崩解試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)中張淑彬的方法[6]，將篩選出的菌株接種到以濾紙為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，同時(shí)做不接種的對(duì)照處理，在45℃下培養(yǎng)7d。進(jìn)行過(guò)濾操作，將殘留物在80℃下烘干稱重，用公式（2）計(jì)算出濾紙失重率。

1.7 秸稈分解效果測(cè)定

參照文獻(xiàn)蔡燕飛等方法[5]，將干秸稈切成3cm左右，將各菌株分別接種至以干秸稈為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為110r/min的搖床45℃下培養(yǎng)4d，將殘?jiān)鼮V出，80℃烘至恒重，計(jì)算降解后每克干秸稈的殘重。

2 結(jié)果分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

觀察5d內(nèi)纖維素剛果紅培養(yǎng)基內(nèi)透明圈產(chǎn)生情況，結(jié)果表明：此堆肥中主要存在5種高溫纖維素分解菌使培養(yǎng)基產(chǎn)生透明圈，且產(chǎn)生的透明圈直徑均在可測(cè)量的范圍內(nèi)。其它雜菌在碳源，溫度均符合其生長(zhǎng)條件的情況下也可以在此培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，但是不會(huì)產(chǎn)生具有降解特性的透明圈出現(xiàn)。

2.2 菌種分離結(jié)果

分離結(jié)果表明：5種高溫纖維素分解菌的生長(zhǎng)形態(tài)均不相同，若命名于G1到G5，則G1可在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，其他培養(yǎng)基中無(wú)明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象，結(jié)合鏡檢結(jié)果判斷其為放線菌，菌落始終為白色，無(wú)氣生菌絲產(chǎn)生，且長(zhǎng)勢(shì)緩慢，初次觀察和3d后觀察到的菌落大小無(wú)明顯差別，相對(duì)其他直徑較小，而G2可在PDA培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，但其他培養(yǎng)基中無(wú)明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象，結(jié)合鏡檢結(jié)果判斷其為真菌，其菌絲呈叢枝狀、有隔，分生孢子為淺褐色，呈現(xiàn)頂生或側(cè)生，生長(zhǎng)速率較其他快速，3d左右菌絲即可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。其他3種菌株均可在PDA培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)（見(jiàn)表1）。

2.3 CMC酶相對(duì)活性的比較結(jié)果

比較結(jié)果比較表明，在培養(yǎng)3d的情況下，G2 的CMC酶的相對(duì)活性最高，G1的CMC酶的相對(duì)活性最低，且G2的CMC酶的相對(duì)活性約為G4的2倍（見(jiàn)表2）。

2.4 羧甲基纖維素鈉的分解能力比較結(jié)果

濾紙條崩解試驗(yàn)的結(jié)果顯示，G2的濾紙失重率稍高，可達(dá)70%，G1的濾紙失重率小于其他4種，約為25%；G3的濾紙失重率約為35%，G4的濾紙失重率約為40%，G5的濾紙失重率也較低，可達(dá)28%。由此表明，G2具有較強(qiáng)的分解羧甲基纖維素鈉的能力，而G1的分解能力最弱（見(jiàn)表2）。

2.5 秸稈的分解能力比較結(jié)果

經(jīng)過(guò)4d的培養(yǎng)后，G2所在的培養(yǎng)基內(nèi)干秸稈殘重最小，為0.5230.025/g，而G1所在的培養(yǎng)基內(nèi)干秸稈殘重最大，為0.8360.013/g，表明G2的纖維素分解效果較其他菌株更為理想（見(jiàn)表2）。

3 結(jié)論分析

實(shí)驗(yàn)用生物堆肥中獲得5種高溫纖維素分解菌，分別為G1到G5，且G2的CMC酶相對(duì)活性最高，分解纖維素的能力也相對(duì)出眾；分離純化后結(jié)合鏡檢結(jié)果判斷G1為放線菌，而G2為真菌，其他3種菌均可在PDA培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，但并未判斷出其具體種類。由此可以判斷，纖維素分解菌廣泛存在于生物堆肥中，且種類多樣；微生物對(duì)來(lái)源具有差異的纖維素降解能力也不相同。從以上分析結(jié)果可見(jiàn)，CMC酶活力高的菌株，其濾紙分解效果也比較明顯[7]；本實(shí)驗(yàn)所篩選得到的高溫纖維素分解菌均可用于分解生物堆肥中的纖維素，將其用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，將會(huì)大幅度提高堆肥中纖維素的利用效率，并提高土壤肥力，推動(dòng)堆肥技術(shù)的發(fā)展。由于纖維素的降解速率及效果受多方面因素的影響，在實(shí)際應(yīng)用中，還需在理論依據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行具體的多方面的研究。

參考文獻(xiàn)

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[7]晉昕，褚艷琴，晉小軍.堆肥中高效纖維素分解菌的分離與純化[J].中國(guó)沼氣，2011，29（6）：7-11.

作者簡(jiǎn)介：張勝男（1996-）， 女， 黑龍江省大慶人， 研究方向： 環(huán)境科學(xué)； 馬軍（1981-）， 男， 黑龍江省哈爾濱人，博士， 助理研究員， 研究方向： 農(nóng)業(yè)環(huán)境分子生態(tài)學(xué)。