黃 彥，石 瑞，蘇二正

(南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院酶與發(fā)酵技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210037)

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冠突散囊菌的研究與應(yīng)用進(jìn)展

黃 彥，石 瑞，蘇二正

(南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院酶與發(fā)酵技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210037)

冠突散囊菌是茯磚茶發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌，其數(shù)量和質(zhì)量直接關(guān)系到茯磚茶的品質(zhì)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了比較全面的研究。本文中，筆者綜述了冠突散囊菌的分離鑒定、分子生物學(xué)、培養(yǎng)、發(fā)花過(guò)程、保健功能及其應(yīng)用等幾個(gè)方面，并對(duì)其研究與應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

茯磚茶；冠突散囊菌；發(fā)酵；保健功能

冠突散囊菌，俗稱(chēng)“金花”，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊屬的一種真菌。冠突散囊菌是茯磚茶在“發(fā)花”過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌[1]。茯磚茶獨(dú)特的品質(zhì)和別具的風(fēng)味都主要?dú)w功于冠突散囊菌[2]。所以，在茯磚茶的發(fā)酵過(guò)程中，冠突散囊菌有著舉足輕重的作用。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，茯磚茶也是黑茶中唯一有“冠突散囊菌”這一指標(biāo)的品種[3]。

在黑茶發(fā)酵的過(guò)程中，“金花”的數(shù)量和質(zhì)量往往直接決定了茯磚茶的品質(zhì)。茯磚茶作為一種發(fā)酵茶，具有抗氧化、助消化、降脂減肥、降低膽固醇等保健功效[4]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的日益提高，不少學(xué)者致力于研究飲用茯磚茶的安全性、挖掘其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以開(kāi)拓其市場(chǎng)價(jià)值[1]。本文就冠突散囊菌的分離鑒定、分子生物學(xué)、培養(yǎng)、發(fā)花過(guò)程、保健功能研究及其應(yīng)用等幾個(gè)方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的綜述。

1 冠突散囊菌的研究

1.1 冠突散囊菌的分離、純化及鑒定

冠突散囊菌的分離一般采用稀釋平板法。黃浩等[2]研究發(fā)現(xiàn)，稱(chēng)取2008年的一品茯茶，置于帶有玻璃珠的無(wú)菌水中，充分振蕩，再用10倍稀釋法稀釋102、103、104、105和106倍后涂布于察氏培養(yǎng)基(CZ)平板上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)直至長(zhǎng)出單個(gè)菌落。菌株純化采用平板劃線(xiàn)法，具體操作是在超凈工作臺(tái)上選取長(zhǎng)勢(shì)較好的平板，用接種環(huán)挑取少量菌體在新鮮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上劃線(xiàn)，然后28 ℃恒溫培養(yǎng)，4 d后選取長(zhǎng)勢(shì)較好的平板，挑取單個(gè)菌落于斜面上28 ℃恒溫培養(yǎng)，這樣反復(fù)繼代3～4次后即可獲得純菌株[2]。

將純化后的冠突散囊菌接種到CZ上，在28 ℃左右的溫度下恒溫恒濕倒置培養(yǎng)7～10 d后，對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)的菌種鑒定有3種方法：宏觀目測(cè)法、光學(xué)顯微鏡觀察法和電鏡掃描法。宏觀目測(cè)法的操作方法是培養(yǎng)一定時(shí)間后定時(shí)觀察記錄菌落的顏色、形態(tài)，進(jìn)行初步判斷。光學(xué)顯微鏡法則可以運(yùn)用插片法、棉蘭染色法等，在顯微鏡下觀察分生孢子、子囊孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)等。

早在1986年以前，冠突散囊菌被認(rèn)為是謝瓦氏曲霉，因?yàn)楫?dāng)時(shí)的研究受到條件的限制，僅靠光學(xué)顯微鏡的結(jié)果并未能夠?qū)⒐谕簧⒛揖拿w棺定論。溫瓊英[3]、齊祖同等[4]研究發(fā)現(xiàn)，冠突散囊菌的有性型孢子——子囊孢子的特征是具有冠狀的突起、表面明顯粗糙；無(wú)性型的分生孢子則具有小刺。對(duì)比謝瓦氏曲霉，這一特征與之并不相符。之后的研究中，齊祖同等[4]分別對(duì)分離自廣西磚茶、湖南茯磚茶、湖南桃江茯磚茶、湖南益陽(yáng)茯磚茶的冠突散囊菌進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)在25 ℃下培養(yǎng)12 d，菌落直徑達(dá)到45～50 mm，周邊為淺黃色，中心為褐色，黃色的閉囊殼大量包纏于具飾菌絲中；21 d后菌落直徑達(dá)到了60～65 mm，顏色都變?yōu)樯詈稚ｉ]囊殼呈球形或半球形，子囊孢子為雙凸鏡型，有兩個(gè)明顯的冠狀突起，凸面明顯粗糙，具小疣，分生孢子頭灰綠色，幼時(shí)呈球型、老時(shí)呈放射狀。于是，按照國(guó)際植物命名規(guī)則，推翻了“冠突曲霉”的命名，正式更名為冠突散囊菌。

王文濤[5]將來(lái)自于全國(guó)各地的茯磚茶樣品中分離出的23株“金花”菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)比，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)它們有一些共同的特征：如菌落中心顏色為深褐色，周邊為淺黃色。但5株菌株之間也存在著差異，例如，相比已有文獻(xiàn)的描述，4號(hào)菌株邊緣有乳白色至淺黃色過(guò)渡，子囊孢子也偏??；B1號(hào)菌株的分生孢子與子囊孢子的大小等特征與冠突散囊菌的特征相同[5]。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在茯磚茶發(fā)花的過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)微生物具有多樣性。

胡治遠(yuǎn)等[6]從18種茶葉樣品中分離出18株菌株，通過(guò)電鏡掃描進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，并根據(jù)微生物經(jīng)典鑒定法[7-8]，得出其中8株為冠突散囊菌，3株為黑曲霉，3株謝瓦散囊菌，2株肋狀散囊菌，1株阿姆斯特丹散囊菌和1株蠟葉散囊菌。在這些菌株中，15株為散囊屬，說(shuō)明散囊屬的菌株在茯磚茶發(fā)花過(guò)程中已占據(jù)了主導(dǎo)地位。

阮林浩等[9]對(duì)從浙江武義和湖南長(zhǎng)沙的茶葉樣品中分離出的冠突散囊菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，得到初步分離純化的鑒定結(jié)果，其中5株(標(biāo)號(hào)為G1～G5)為冠突散囊菌，2株散囊屬(G6、G7)，其中G3為標(biāo)準(zhǔn)的冠突散囊菌菌株，G6為阿姆斯特丹散囊菌，G7為肋狀散囊菌。

黃浩等[2]將冠突散囊菌的培養(yǎng)分別置于CZ和含200 g/L蔗糖CZ(CZ20)上，發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌在CZ20上生長(zhǎng)較快。這在一定程度上說(shuō)明培養(yǎng)條件不同，對(duì)冠突散囊菌的生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生不同的影響。

1.2 冠突散囊菌的分子生物學(xué)研究

劉石泉等[10]研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶破壁法、纖維素酶破壁法、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法等提取冠突散囊菌DNA效果較為理想。魏國(guó)美等[11]分別用超聲破碎和液氮研磨的方式來(lái)提取冠突散囊菌基因組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200 W的超聲波無(wú)法破碎冠突散囊菌的細(xì)胞壁，因此不能提取DNA ；而用600 W超聲波和液氮研磨的方式提取的基因組DNA的雜質(zhì)含量均較高；相對(duì)而言，400 W超聲波的提取方法所提取的基因組DNA濃度大、純度高、效果好，更加適用于冠突散囊菌的基因組 DNA的提取。

據(jù)報(bào)道，真菌中的veA基因片段參與了細(xì)胞有性發(fā)育和無(wú)性發(fā)育的調(diào)節(jié)。利用DNA 克隆技術(shù)，可探究冠突散囊菌中與有性發(fā)育有關(guān)聯(lián)的veA 基因片段[12-14]。馬權(quán)等[15]先通過(guò)液體培養(yǎng)抑制菌體產(chǎn)生孢子，待其生長(zhǎng)到足夠的量之后，固體培養(yǎng)誘導(dǎo)其產(chǎn)生子囊果及子囊孢子，16 h左右收集菌絲體提取RNA，結(jié)果證明，該基因片段確實(shí)為veA基因片段。而就目前而言，關(guān)于無(wú)性孢子的發(fā)育過(guò)程的研究已經(jīng)較為透徹，而有性孢子的研究卻尚未成熟，進(jìn)一步研究冠突散囊菌veA基因片段，能夠?yàn)楣谕簧⒛揖a(chǎn)生有性孢子的研究提供一定的理論依據(jù)。譚玉梅等[16]利用cDNA末端快速克隆技術(shù)獲得冠突散囊菌stf1基因的全長(zhǎng)DNA序列，并利用相對(duì)定量SYBR Green I 熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)該基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量的差異，該實(shí)驗(yàn)為深入研究冠突散囊菌產(chǎn)孢調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

1.3 培養(yǎng)條件對(duì)冠突散囊菌的影響

1.3.1 用于冠突散囊菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基

蘇鳳等[17]為了確定最佳的培養(yǎng)基，將等量的孢子懸液培養(yǎng)在PDA、改良察氏培養(yǎng)基(CZG)和察氏培養(yǎng)基上，96 h后測(cè)定菌絲干質(zhì)量濃度分別為1.064、1.625和1.348 g/L，以此為指標(biāo)，確定最佳培養(yǎng)基為CZG培養(yǎng)基。而劉作易等[18]用了8種培養(yǎng)基來(lái)觀測(cè)冠突散囊菌在這些培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在溫度相同時(shí)，兩種孢子在這些培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小相似、生長(zhǎng)速度一致。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與周楊艷等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相去甚遠(yuǎn)。周楊艷等[19]在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，將優(yōu)勢(shì)菌接種在14種培養(yǎng)基上，9和18 d后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，判斷其生長(zhǎng)狀況，結(jié)果顯示，冠突散囊菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況差異較大，產(chǎn)生孢子的數(shù)量與分泌色素物質(zhì)情況的差異最為明顯，并且差異隨著時(shí)間的延長(zhǎng)更加明顯。

1.3.2 碳源和氮源的影響

冠突散囊菌的繁殖方式分為有性繁殖(子囊孢子)和無(wú)性繁殖(分生孢子)兩種。碳源和氮源對(duì)冠突散囊菌孢子的產(chǎn)生都有不同程度的影響。碳源的濃度不僅會(huì)影響孢子產(chǎn)生的數(shù)量，而且會(huì)影響冠突散囊菌的繁殖方式。劉作易等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在不同蔗糖濃度下，冠突散囊菌的繁殖方式也不同：當(dāng)蔗糖濃度較低時(shí)，繁殖方式以有性孢子為主；當(dāng)蔗糖濃度較高時(shí)，繁殖方式以無(wú)性孢子為主。鄭欣欣[21]以蔗糖、葡萄糖和淀粉為碳源，設(shè)置濃度梯度來(lái)測(cè)定最佳的碳源，結(jié)果表明：碳源為50 g/L時(shí)，有性孢子的數(shù)量最多，幾乎不產(chǎn)生無(wú)性孢子；碳源為200 g/L左右時(shí)，無(wú)性孢子開(kāi)始出現(xiàn)，并隨濃度的增加而增加。進(jìn)一步研究確定蔗糖為最佳碳源，在以蔗糖為碳源的研究中發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于孢子的產(chǎn)生，蔗糖濃度過(guò)低時(shí)幾乎不產(chǎn)生孢子；而過(guò)高的蔗糖濃度則會(huì)抑制孢子的產(chǎn)生，當(dāng)蔗糖為50和300 g/L時(shí)，菌落直徑和有性孢子的數(shù)量都多，但考慮到300 g/L時(shí)已有無(wú)性孢子產(chǎn)生，因此最終選定50 g/L蔗糖為最佳碳源[21]。尹旭敏[22]以淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖等作為碳源，考察碳源的影響結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)以葡萄糖和蔗糖最好，麥芽糖和乳糖較差，而可溶性淀粉最差。劉作易[23]用蔗糖、葡萄糖、山梨糖、棉子糖和單寧等17種糖作為碳源來(lái)考察碳源的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：其中只有14種糖能被利用，D-果糖效果最好，山梨糖生長(zhǎng)最差，還有3種糖不能利用，分別是瓊脂、單寧和淀粉。

在含有不同氮源的培養(yǎng)基上，冠突散囊菌的生長(zhǎng)繁殖情況也不盡相同。無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源對(duì)冠突散囊菌的影響也各異。無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌落直徑的影響小于有機(jī)氮源[23-24]。但是，無(wú)機(jī)氮源促進(jìn)孢子萌發(fā)的效果較好，而有機(jī)氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較大。所以，在配制冠突散囊菌培養(yǎng)基時(shí)，可以采用有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源相結(jié)合的方式。為了探究氮源對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響，尹旭敏[22]測(cè)定了KNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、牛肉膏和酵母膏等作為氮源時(shí)的影響，結(jié)果與上述一致，無(wú)機(jī)氮源的影響明顯不如有機(jī)氮源大，菌絲在牛肉膏、蛋白胨和酵母膏上生長(zhǎng)最好，菌絲發(fā)達(dá)，在對(duì)照和(NH4)2SO4上生長(zhǎng)最差。但劉作易[23]研究發(fā)現(xiàn)，在促進(jìn)孢子萌發(fā)的方面，無(wú)機(jī)態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨態(tài)氮更具優(yōu)勢(shì)；而有機(jī)氮源中，DL-蘇氨酸、L-谷氨酰胺、DL-α-氨基丙酸對(duì)菌落生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較大。

1.3.3 pH的影響

冠突散囊菌可以在偏酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)，而堿性環(huán)境不利于其生長(zhǎng)。劉作易等[18]研究，冠突散囊菌生長(zhǎng)的最適pH為3～6，在pH為4～6時(shí)，菌株生長(zhǎng)較好，最適pH為5。當(dāng)pH小于2或大于7的時(shí)候均不能萌發(fā)生長(zhǎng)。而呂嘉櫪等[25]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的 pH 達(dá)到10時(shí)，冠突散囊菌幾乎不生長(zhǎng)；pH為7時(shí)，有性孢子和無(wú)性孢子的數(shù)量都達(dá)到極值，隨著 pH 的增大，有性孢子的數(shù)量呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，無(wú)性孢子的趨勢(shì)則相反。鄭欣欣[21]的研究也表明：pH為7時(shí)產(chǎn)生的有性孢子數(shù)量最多，而在極酸或極堿的環(huán)境中，都極其容易產(chǎn)生無(wú)性孢子。這些結(jié)果都說(shuō)明，pH也會(huì)影響冠突散囊菌的繁殖方式。但在不同的pH環(huán)境下，冠突散囊菌的繁殖方式也有所不同。陳云蘭[26]研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌普遍在偏酸性的條件下生長(zhǎng)較好，而培養(yǎng)基呈堿性時(shí)，菌株生長(zhǎng)較慢。

1.3.4 培養(yǎng)溫度的影響

極端的高溫和低溫環(huán)境都不利于冠突散囊菌的生長(zhǎng)。低溫有利于有性孢子的產(chǎn)生，高溫有利于無(wú)性孢子的產(chǎn)生。冠突散囊菌的最適生長(zhǎng)溫度在28 ℃左右。在適宜的溫度下，有性孢子的產(chǎn)量較高；當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，開(kāi)始產(chǎn)生無(wú)性孢子；當(dāng)培養(yǎng)溫度過(guò)高，甚至高于冠突散囊菌自身生長(zhǎng)繁殖所需的溫度時(shí)，冠突散囊菌的生長(zhǎng)受到抑制，菌落直徑相應(yīng)變小。由此表明，冠突散囊菌的生長(zhǎng)和繁殖方式不僅受到碳源、氮源和pH 的影響，培養(yǎng)溫度同樣有影響。

陳云蘭[26]在研究中發(fā)現(xiàn)，25～35 ℃為冠突散囊菌生長(zhǎng)的適宜的溫度。大多數(shù)菌株在25 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，35 ℃時(shí)生長(zhǎng)較慢，當(dāng)溫度升高到40 ℃時(shí)，一些菌株停止生長(zhǎng)。曹聰?shù)萚27]研究發(fā)現(xiàn)，在40 ℃條件下培養(yǎng)的菌株形成的菌落較稀疏，顏色較淺；經(jīng)過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌落基本由菌絲組成，并有灰綠色分生孢子頭產(chǎn)生。由此可見(jiàn)，高溫可促使冠突散囊菌進(jìn)行無(wú)性繁殖。溫瓊英等[28]對(duì)“金花”菌進(jìn)行溫度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌在28 ℃時(shí)生長(zhǎng)較快，在20～22 ℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢、而在32～34 ℃時(shí)比在28 ℃時(shí)生長(zhǎng)得緩慢。呂嘉櫪等[25]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在28 ℃時(shí)菌落直徑最大，有性孢子密集，30 ℃時(shí)開(kāi)始產(chǎn)生無(wú)性孢子。因此，28 ℃通常用作冠突散囊菌培養(yǎng)的最適溫度。

1.4 冠突散囊菌發(fā)花過(guò)程中的色、香、味變化

1.4.1 冠突散囊菌產(chǎn)色素類(lèi)物質(zhì)的研究

經(jīng)壓制后的茯磚茶呈黑褐色，茶磚中有冠突散囊菌發(fā)花后形成的金黃色“金花”，烹煮后的茶湯色澤鮮明，呈透亮的橙紅色。溫瓊英等[28]在研究茯磚茶加工過(guò)程中的微生物優(yōu)勢(shì)種群變化規(guī)律中提到，在發(fā)花過(guò)程中大量繁殖的冠突散囊菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)與色素物質(zhì)的變化呈現(xiàn)出高度的同步性。以此推測(cè)，色素物質(zhì)的形成與積累可能與微生物代謝有關(guān)，也就是說(shuō)，茯磚茶鮮亮色澤的形成與冠突散囊菌的生長(zhǎng)代謝休戚相關(guān)。劉仲華等[29]利用薄層色譜分析法和分光光度法分析了加工過(guò)程中茯磚茶的脂溶性色素和水溶性色素的變化，以此來(lái)弄清色素形成的機(jī)制，結(jié)果顯示：在冠突散囊菌的繁殖過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的胞外多酚氧化酶(PPO)[30-31]，這種酶可以將兒茶素氧化為茶褐素、茶黃素和茶紅素等水溶性的色素。這些色素的積累，共同形成了茯磚茶的獨(dú)特色澤。

1.4.2 冠突散囊菌發(fā)花香氣來(lái)源的研究

因加工工藝的特殊性，茯磚茶中香氣成分的組成比較復(fù)雜，除原料黑毛茶自身具有的香氣成分外，還具有一種獨(dú)特的菌花香。呂毅[32]研究發(fā)現(xiàn)，在伏磚茶中沒(méi)有檢測(cè)到在其他茶葉中常見(jiàn)的香葉醇，但是檢測(cè)到了與這種萜烯類(lèi)化合物類(lèi)似的酮類(lèi)化合物香氣成分，這被認(rèn)為是茯磚茶也是黑茶香氣上的一個(gè)特點(diǎn)。

在茯磚茶特有的香氣中有許多具有揮發(fā)性香氣成分，如戊醛、正乙醛和1-戊烯-3-酮等。王華夫等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)花的過(guò)程中，還添加了一些新的特征化合物，如芳樟醇、α-紫羅酮和壬酸等，這些香氣成分在發(fā)花前能夠檢測(cè)到的含量還很低，發(fā)花后含量明顯增加，并且在茯磚茶壓制成型的過(guò)程中，含量可以一直維持在較高的水平。同時(shí)，還檢測(cè)到了一種獨(dú)特的成分——愈創(chuàng)木酚。愈創(chuàng)木酚是一種微生物作用后的茶葉降解產(chǎn)物[34]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)、香料及染料的合成，它是一種受熱不穩(wěn)定的香氣物質(zhì)。

由于冠突散囊菌的作用，在發(fā)花過(guò)程中，部分醛、酮類(lèi)香氣化合物明顯增加。一些雜環(huán)化合物的含量，如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和1-甲基酰吡咯等，也隨著發(fā)花過(guò)程的深入而增加。這類(lèi)化合物通常被認(rèn)為是糖和氨基酸加熱后降解的產(chǎn)物[35-36]，就是所謂的“火功香”。糖類(lèi)物質(zhì)在高溫條件下會(huì)產(chǎn)生脫水、聚合發(fā)生焦糖化反應(yīng)，產(chǎn)生焦糖的香氣。

由此可見(jiàn)，發(fā)花過(guò)程中香味的形成，是微生物分泌胞外酶、發(fā)酵熱和空氣中的水和氧氣等許多因素共同作用的結(jié)果。

1.4.3 冠突散囊菌發(fā)花過(guò)程中風(fēng)味的形成

茶葉中的水溶性成分通常是賦予茶葉香醇口感的主要因素。劉武嫦等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)花過(guò)程中，茶多酚、游離氨基酸、生物堿、可溶性糖、兒茶素和沒(méi)食子酸等含量均發(fā)生了不同程度的變化。其中，由于生物作用，冠突散囊菌在代謝過(guò)程中會(huì)大量消耗茶葉中原有的游離氨基酸，使得茶湯風(fēng)味更加醇和；冠突散囊菌在代謝過(guò)程中還會(huì)分泌一些胞外酶，如纖維素酶，它可將原料中的纖維素分解成麥芽糖，使得茶湯風(fēng)味更加甘甜；另外，一些酯類(lèi)兒茶素被微生物降解生成沒(méi)食子酸，可以降低茶湯中的澀味。

茯磚茶在發(fā)花過(guò)程中，盡管物質(zhì)的味感與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的內(nèi)在聯(lián)系并不十分明確，但分子結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化，如取代基發(fā)生變化、立體位置的差異都是有可能導(dǎo)致呈味的差異因素。王增盛等[38]研究發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸總量較原料中的相對(duì)含量降低了38.7%，且各類(lèi)氨基酸組成的配比發(fā)生了較大的變化，其中茶氨酸、谷氨酸和丙氨酸等主要氨基酸降解幅度較大。而在發(fā)花期間，蘇氨酸、酪氨酸和賴(lài)氨酸的含量則有所增加[31]。這些氨基酸的變化對(duì)協(xié)調(diào)茶湯的滋味形成了不容忽視的作用。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)茶多酚的相對(duì)含量降低了46.6%，兒茶素組分中下降的幅度最大[31]，這對(duì)進(jìn)一步改善茶湯滋味、使之醇而不澀具有積極的作用。同時(shí)，在生物酶的作用下，兒茶素氧化產(chǎn)物的進(jìn)一步形成與積累，不僅對(duì)色澤品質(zhì)具有極為重要的意義，而且在形成茯磚茶品質(zhì)風(fēng)味中起著不可替代的作用[38]。此外，茶黃素的鮮爽、刺激性口感，茶紅素的甜醇滋味及其咖啡堿形成的絡(luò)合物，使得茯磚茶成品茶滋味在黑毛茶的基礎(chǔ)上進(jìn)一步協(xié)調(diào)而獨(dú)具一格；不溶于水的纖維素在微生物胞外酶的作用下，分解成可溶于水的多糖、雙糖或單糖，對(duì)增進(jìn)茶湯干厚醇和的口感起著不容小覷的作用[38]。

最后，冠突散囊菌在發(fā)花過(guò)程中大量繁殖，后期發(fā)生菌體自溶，菌體自身的代謝產(chǎn)物又溶入茶湯中，對(duì)茶湯風(fēng)味的形成同樣也是不無(wú)裨益。

1.5 冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物活性研究

1.5.1 降脂減肥活性成分的研究

呂嘉櫪等[39]用乙酸乙酯從冠突散囊菌的液體發(fā)酵物中分離提取目標(biāo)物，用薄層色譜析法和高效液相色譜法來(lái)分析提取物，結(jié)果與以純度為99.8%的類(lèi)脂類(lèi)物質(zhì)——洛伐他汀一致，說(shuō)明在冠突散囊菌的發(fā)酵液中，含有降脂類(lèi)物質(zhì)。與此同時(shí)，傅冬和等[40-41]采用高通量篩選的方式研究了茯磚茶降低血脂的功效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茯磚茶有多條降脂途徑，綜合降脂減肥效果強(qiáng)。宋魯彬等[42-43]研究發(fā)現(xiàn)，黑茶不僅具有良好激活PRARδ和 PRARγ(PRAR為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體)核受體模型的作用，而且具有良好的法尼基衍生物X受體(FXR)活性。

黃群等[44]通過(guò)研究冠突散囊菌發(fā)酵液中的酶類(lèi)在模擬腸液、胃液中的作用，發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性都有激活作用，而對(duì)脂肪酶的活性具有抑制作用。這就說(shuō)明冠突散囊菌發(fā)酵液能夠有效地阻止脂肪的消化代謝，從而起到減肥的作用。

綜上所述，黑茶具有良好的降脂減肥、調(diào)節(jié)糖代謝的作用。

1.5.2 抗氧化活性成分的研究

在冠突散囊菌黑茶發(fā)酵的過(guò)程中，發(fā)酵液中含有相當(dāng)?shù)膬翰杷兀捎诰w的代謝作用，兒茶素會(huì)被進(jìn)一步氧化。兒茶素及其氧化物是含有酚羥基的化合物，具有酚類(lèi)抗氧化劑的性質(zhì)。相關(guān)研究表明，兒茶素及其氧化物可以直接清除自由基，避免氧化損傷[45-46]。Charlton等[47]研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素及其氧化物具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)化等防癌抗癌功效以及抗突變、抗輻射、抗菌抗病毒等多種藥理作用。

在鄧放明[48]的研究中，提到了一種綠原酸的物質(zhì)。綠原酸是一種有效的酚型抗氧化劑，其抗氧化能力要強(qiáng)于一些常見(jiàn)的抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚和生育酚，和丁基羥基甲苯的抗氧化能力相當(dāng)[49]。

1.5.3 調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤活性成分的研究

在冠突散囊菌液體發(fā)酵過(guò)程中，由于菌體的生長(zhǎng)代謝作用，會(huì)分泌一定量的胞外多糖。真菌多糖是一種很好的免疫調(diào)節(jié)劑，能夠有效地激活免疫細(xì)胞，參與宿主的特異性和非特異性的免疫，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。Honda等[50]的研究證實(shí)，來(lái)自真菌多糖的抗腫瘤活性與其相對(duì)分子質(zhì)量的大小有關(guān)，只有當(dāng)分子質(zhì)量大于1.6×104時(shí)，才具有抗腫瘤活性。在鄧放明[48]的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)分析冠突散囊菌胞外多糖的相對(duì)分子質(zhì)量，判斷其具有抗腫瘤活性。其實(shí)，冠突散囊菌液體發(fā)酵提取物的成分相當(dāng)復(fù)雜，就拿胞外多糖來(lái)說(shuō)，它不僅具有抗腫瘤活性的作用，而且同樣具有降血脂、抗氧化等功效。所以，冠突散囊菌發(fā)酵過(guò)程中的次生代謝產(chǎn)物的保健功效，是多種生物活性成分相輔相成、共同作用的結(jié)果。對(duì)于某一特定成分的功效，還需要對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，進(jìn)行分類(lèi)研究，方能弄明白。

2 冠突散囊菌的應(yīng)用

2.1 冠突散囊菌在食品方面的應(yīng)用

目前，市售的色素與香料都分為天然與合成兩種。隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品安全性的關(guān)注度日趨提高，而食品的生產(chǎn)離不開(kāi)食品添加劑的錦上添花，以改善食品感觀性質(zhì)，增強(qiáng)其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。因此，使用天然的香料、色素等食品添加劑必定是大勢(shì)所趨。

冠突散囊菌在茯磚茶的發(fā)酵過(guò)程中，是形成其獨(dú)特的感官品質(zhì)的首要“功臣”。王波[51]在分離提取冠突散囊菌產(chǎn)黃色素的研究中發(fā)現(xiàn)，冠突散囊菌的色素并不穩(wěn)定，不能成為理想的食品添加劑。因此，能否進(jìn)一步提高色素的穩(wěn)定性，使其成為優(yōu)良的食品添加劑，還有待研究。

冠突散囊菌發(fā)酵產(chǎn)物——愈創(chuàng)木酚，是一種重要的精細(xì)化工的中間體。因?yàn)樘烊缓铣傻挠鷦?chuàng)木酚的量不能滿(mǎn)足生產(chǎn)生活的需要，而且提取天然愈創(chuàng)木酚步驟繁瑣、耗費(fèi)巨大，所以目前有不少研究者致力于其人工合成的研究，但是，這種化學(xué)合成物質(zhì)在醫(yī)藥、食品中的應(yīng)用受到限制。因此，天然的愈創(chuàng)木酚依然有很大的發(fā)展空間。

蔡正安等[52]研究發(fā)現(xiàn)，冠突散囊菌不僅可以在以黑茶作為原料的基礎(chǔ)上進(jìn)行“發(fā)花”，而且在沒(méi)有人工接種冠突散囊菌的條件下也可以進(jìn)行“發(fā)花”，這個(gè)實(shí)驗(yàn)就為冠突散囊菌發(fā)酵復(fù)合茶奠定了基礎(chǔ)。

黃亞亞[53]研究發(fā)現(xiàn)，茯磚茶中多酚類(lèi)、咖啡堿等物質(zhì)的部分減少，在一定程度上對(duì)其飲料的開(kāi)發(fā)提供了良好的基礎(chǔ)。因此，作為飲料開(kāi)發(fā)的原料用茶，茯磚茶有其獨(dú)特的品質(zhì)特色。

田鴻等[54]用冠突散囊菌直接發(fā)酵茶汁，研究了發(fā)酵過(guò)程各工藝參數(shù)及最優(yōu)組合對(duì)品質(zhì)的影響，最后感官評(píng)審的結(jié)果表明，在最優(yōu)參數(shù)組合下，發(fā)酵茶汁具有很好的感官品質(zhì)，湯色紅艷透明、味道香甜濃郁、滋味醇和。

歐陽(yáng)梅[55]選用炒青綠茶作為茶坯，人工接種冠突散囊菌，制成一種新型的黑散茶。

2.2 冠突散囊菌在醫(yī)藥方面的應(yīng)用

劉閆等[56]從冠突散囊菌含阿魏酸的初篩培養(yǎng)基上看到了清晰可見(jiàn)的透明圈，由此證明了冠突散囊菌能夠產(chǎn)生阿魏酸酯酶，并且通過(guò)水解透明圈的大小，證明了阿魏酸酯酶的活性較高。阿魏酸酯酶是冠突散囊菌分泌的一種胞外酶，能夠通過(guò)水解作用，釋放出游離的阿魏酸。阿魏酸具有抗氧化、消炎止痛、增強(qiáng)免疫功能等作用。劉閆等[56]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：冠突散囊菌在麩皮和黑茶發(fā)酵中都能產(chǎn)生一定量的阿魏酸，與其他原料相比，黑茶因?yàn)槔w維素、半纖維素和果膠含量較高，產(chǎn)生的阿魏酸豐富，因此具有更好的保健功能。

呂嘉櫪等[57]以金花菌固態(tài)培養(yǎng)物為研究對(duì)象，選擇降脂類(lèi)物質(zhì)洛伐他汀標(biāo)品為對(duì)照，采用高效液相色譜法確定了該菌種含有具備降脂功能的洛伐他汀，對(duì)金花菌固態(tài)發(fā)酵樣品進(jìn)行測(cè)定，最高洛伐他汀含量為0.49 mg/kg。該實(shí)驗(yàn)為開(kāi)發(fā)他汀類(lèi)藥物提供了理論依據(jù)。

楊麗等[58]通過(guò)對(duì)冠突散囊菌、黑茶和菊苣根等的研究分析，研制了黑茶復(fù)方顆粒，可以緩解高血壓、高血脂等病癥。

李瑩[59]采用混合發(fā)酵的方式，研究了藥物及細(xì)菌對(duì)冠突散囊菌的代謝調(diào)控，其結(jié)果顯示：煙酰胺、伏立諾他和5-氮雜胞嘧啶核苷對(duì)冠突散囊菌的代謝調(diào)控均顯示出負(fù)調(diào)控的效果；Vc對(duì)冠突散囊菌沒(méi)有代謝調(diào)控效果；金黃色葡萄球菌對(duì)冠突散囊菌的代謝調(diào)控顯著，刺激產(chǎn)生大量新物質(zhì)，可成為冠突散囊菌發(fā)酵的新研究方向；肺炎鏈球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌對(duì)冠突散囊菌的代謝調(diào)控均有一定的作用，但并不顯著。

3 展望

當(dāng)前，分子生物學(xué)技術(shù)手段日趨完善，但冠突散囊菌的分子生物學(xué)研究還處于初步階段，未來(lái)可以通過(guò)分子生物學(xué)手段，改造冠突散囊菌，使其次生代謝產(chǎn)物高效表達(dá)，成為各類(lèi)生物活性成分的高產(chǎn)菌株。冠突散囊菌產(chǎn)孢子受很多因素影響，未來(lái)可以通過(guò)分子生物學(xué)手段闡明基因影響冠突散囊菌產(chǎn)孢方式的機(jī)制，并利用基因工程的手段定向改造，達(dá)到只產(chǎn)并且高產(chǎn)有性孢子的目的。

目前，“金花”菌發(fā)花固態(tài)磚茶的研究和生產(chǎn)工藝已經(jīng)較為成熟，而液態(tài)茶發(fā)酵卻鮮有報(bào)道。因此，優(yōu)化冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵條件，組合優(yōu)化工藝參數(shù)，開(kāi)發(fā)金花茶飲料也將成為冠突散囊菌發(fā)展藍(lán)圖中的黃金板塊。另外，冠突散囊菌能夠在多種植物、藥物材料上進(jìn)行發(fā)花，并且具有各種保健功效，有望開(kāi)發(fā)成多功能的復(fù)合保健類(lèi)飲品。

此外，冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物的活性成分有降脂功效，有望生產(chǎn)降脂類(lèi)藥物或保健品。金黃色葡萄球菌對(duì)冠突散囊菌的代謝調(diào)控作用相當(dāng)明顯，也將成為冠突散囊菌研究發(fā)展的新方向。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

《Advanced Functional Materials》報(bào)道我刊編委徐虹教授課題組仿生水凝膠敷料最新成果

水凝膠作為一種軟物質(zhì)材料，往往具有良好的生物相容性，可以為細(xì)胞提供高度模擬細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的微環(huán)境而在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究。然而，潮濕的生理環(huán)境和水凝膠固有的高水含量引發(fā)的“氫鍵失效效應(yīng)”嚴(yán)重阻礙了凝膠材料與生物體組織表面的整合并引起傷口感染，成為制約水凝膠材料整體性能提升和醫(yī)學(xué)應(yīng)用的瓶頸。

近日，《Advanced Functional Materials》報(bào)道了我校材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、食品與輕工學(xué)院徐虹教授、遲波副教授及其博士后王瑞等人在仿生水凝膠敷料領(lǐng)域的最新成果。該水凝膠從海洋貝類(lèi)生物濕性粘合的靈感出發(fā)，在抗菌高分子材料ε-聚賴(lài)氨酸體系中引入多巴胺基團(tuán)，采用酶催化原位構(gòu)建了貽貝仿生水凝膠。聚合物中鄰近的賴(lài)氨酸-鄰苯二酚(catechol-lysine)仿生結(jié)構(gòu)分布產(chǎn)生的“協(xié)同粘合效應(yīng)”賦予水凝膠材料在生理?xiàng)l件下高強(qiáng)度的濕性組織整合強(qiáng)度(～147 KPa)和傷口封堵止血能力，同時(shí)，該水凝膠呈現(xiàn)出優(yōu)異的體外抗菌和體內(nèi)抗感染能力，高效誘導(dǎo)皮膚再生修復(fù)。該研究為海洋貝類(lèi)仿生材料的設(shè)計(jì)提供了新的思路。

相關(guān)工作發(fā)表在材料領(lǐng)域著名期刊《AdvancedFunctional Materials(先進(jìn)功能材料)》。A Biomimetic Mussel-Inspired ε-poly-L-lysine Hydrogel with Robust Tissue-Anchor and Anti-Infection Capacity (DOI:10.1002/adfm.201604894,http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.201604894/epdf)。 (王瑞：第一作者，徐虹、遲波：共同通訊作者)。

徐虹教授實(shí)驗(yàn)室主要通過(guò)微生物代謝工程及酶催化的手段，開(kāi)發(fā)聚氨基酸和功能糖(醇)的綠色生產(chǎn)工藝，并探索基于聚氨基酸設(shè)計(jì)的組織修復(fù)與再生醫(yī)用高分子材料的應(yīng)用研究。實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有教授2人，副教授3人，講師1人，博士后2人，博士研究生8人，碩士研究生20余人。

徐虹教授本課題組當(dāng)前的研究方向?yàn)樯锘牧系纳镏圃炫c應(yīng)用研究，主要涉及以下方面：

1、生物基材料的生物制造

1)生物高分子功能開(kāi)發(fā)與應(yīng)用；2)高效生物催化劑的發(fā)現(xiàn)與改造；3)生物高分子發(fā)酵過(guò)程的調(diào)控優(yōu)化；4)生物大分子結(jié)構(gòu)解析和構(gòu)效機(jī)制。

2、組織工程與再生醫(yī)學(xué)材料的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

1) 組織修復(fù)再生支架材料的設(shè)計(jì)(功能水凝膠、納米纖維等)；2) 材料與細(xì)胞的相互作用；組織誘導(dǎo)再生材料的應(yīng)用研究(皮膚、軟骨、骨等)。

(供稿人：李莎)

Progress in the research and application of theEurotiumcristatum

HUANG Yan,SHI Rui,SU Erzheng

(Enzyme and Fermentation Technology Laboratory,College of Light Industry Science and Engineering, Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

Eurotiumcristatumis the dominant fungus in the fermentation of ′Fu-brick′ tea.The quantity and quality ofE.cristatumare directly related to the quality of brick tea.Extensive studies had been done.We review the researches in the isolation and identification,molecular biology,cultivation,growing process of the so-called′ golden flower′ fungusE.cristatum.We also indicate the research and application prospects ofE.cristatum.

Fu-brick tea;Eurotiumcristatum; fermentation;health function

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.008

2016-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(31401679)；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(2015-JY-016)

黃 彥(1992—)，女，江蘇宜興人，研究方向：食品生物技術(shù)；蘇二正(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:ezhsu@njfu.edu.cn

TQ272； Q949.32

A

1672-3678(2017)01-0049-08