陳小瓊，李洋，張伊婧，吳蓉，席志超，譚紅勝＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院上海201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海201203）

Guttiferone K抑制胰腺癌的體內外活性研究＊

陳小瓊1，2，李洋1，2，張伊婧1，2，吳蓉1，2，席志超1，2，譚紅勝1，2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院上海201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海201203）

目的：本文主要探討從藤黃屬植物云南藤黃Garcinia yunnanensis中提取分離得到的化合物Guttiferone K（GUTK）抑制人胰腺癌增殖的體內外作用。方法：用MTT法檢測GUTK對5株人胰腺癌細胞增殖的抑制作用；利用免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白Caspase-3、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（Poly Adenosinediphosphate-Ribose Polymerase，PARP）和Bcl-xL蛋白水平的變化；將人胰腺癌細胞MIA PaCa-2接種到裸鼠胰腺上，腹腔注射GUTK進行干預，隔天給藥，4周后摘取小鼠胰腺腫瘤并檢測瘤體積和瘤重；通過免疫組化法檢測cleaved Caspase-3在各組腫瘤組織中表達水平的差異。結果：GUTK在低濃度時能有效抑制5種人胰腺癌細胞的增殖；GUTK呈時間及劑量依賴地誘導Caspase-3和PARP剪切，并下調Bcl-xL的表達；體內實驗表明GUTK能顯著抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤的生長，并誘導cleaved Caspase-3在腫瘤組織中的表達。結論：GUTK在體內外均能誘導胰腺癌細胞的凋亡，具有潛在的抗胰腺癌作用，有望開發(fā)成治療胰腺癌的藥物。

云南藤黃Guttiferone K胰腺癌凋亡

藤黃屬植物主產于越南、緬甸、印度和中國西南地區(qū)，其中在中國分布有22種[1]。近年來本課題組一直專注于藤黃屬Garcinia L.植物抗腫瘤活性成分的提取分離及作用機理的研究，目前已經從17種中國產藤黃屬植物中發(fā)現(xiàn)了多個具有抗腫瘤活性的化合物[2-6]。在前期活性篩選發(fā)現(xiàn)GUTK對5株人胰腺癌細胞均具有較強的細胞毒活性，提示GUTK可能具有抑制胰腺癌的作用。本研究基于以上發(fā)現(xiàn)，進一步評價GUTK抑制胰腺癌的體內外活性，并對其作用機理進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

胰腺癌細胞株MIA PaCa-2、BxPC-3、SW1990、Capan-1細胞，人胰腺上皮樣癌PANC-1細胞均購自于美國ATCC細胞庫。

1.1.2 藥品與試劑

Guttiferone K（GUTK）是從云南藤黃果實中提取得到，純度為98%；DMEM與RPMI1640（美國Sigma化工公司，批號：8117011、8116506），胎牛血清（美國Hyclone公司，批號：sh30068.02），Trypsin（JiNuo生物科技有限公司，批號：2016092102），PBS（美國Corning公司，批號：16110102），MTT（美國Sigma化工公司，批號：M5655），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司，批號：RNBF4512），RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑三聯(lián)試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒和ECL發(fā)光液（上海威奧生物科技有限公司）；PARP兔多克隆抗體（美國CST公司，批號：13），Caspase-3兔單克隆抗體（美國CST公司，批號：6），Bcl-xL兔多克隆抗體（美國CST公司），cleaved Caspase-3兔多克隆抗體（美國CST公司），GAPDH兔單克隆抗體（英國Abcam公司，批號：GR90965-16）；二抗采用羊抗兔IgG（H+L）多克隆抗體（美國seracare公司，批號：474-1506）；聚偏氟乙烯膜（PVDF，美國Millipore公司，批號：R6BA9402C）。

1.2 儀器

細胞培養(yǎng)箱（美國Themo公司，型號：3541），光學倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：SZ51/SZ61），離心機（美國Beckman公司，型號：Allegra X-12R），Countstar自動細胞計數(shù)儀（艾立特國際貿易有限公司，型號：IC1000），全波長酶標儀（美國Bio-Tek公司，型號：PowerWave XS2），LASMINI 4000化學發(fā)光儀器（美國GE公司，型號：ImageQuant LAS4000mini）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與處理

MIA PaCa-2、BxPC-3、Capan-1、PANC-1和SW 1990分別用含10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中；當細胞長至70%-80%時，用PBS洗后加入含0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，按合適的比例將細胞種于培養(yǎng)皿中。

1.3.2 MTT篩選

將MIA PaCa-2、BxPC-3、Capan-1、PANC和SW 1990細胞以4×103個/孔的濃度接種于96孔板中；次日分別加入1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μM的GUTK，100μL/孔，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后加入10μL/孔的MTT（5mg·mL-1），孵育4 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入100μL的DMSO，避光振搖10min，使甲臢結晶充分溶解，于酶標儀上570 nm波長下檢測各孔OD值。細胞生長抑制率（%）按如下方程計算：抑制率/%=（對照組-給藥組）/對照組×100%。IC50值：能抑制50%腫瘤細胞增殖的藥物濃度。

1.3.3 蛋白免疫印跡檢測Caspase-3、PARP、Bcl-xL的表達

將MIA PaCa-2細胞以4×105個/mL種于培養(yǎng)皿中，次日分別加入0、1、3、5、10μM的GUTK處理，24、48 h后將細胞消化、離心收集于1.5mL的EP管中；將按100∶1∶1∶1比例混合好的細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF加入細胞樣品中吹打混勻，置冰上裂解30min；于4℃，14 000 rpm離心20min，取上清，用BCA法測定樣品的蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，于99℃金屬浴上加熱8min。然后進行蛋白電泳，轉膜，牛奶封閉，TBST洗膜3次并孵育一抗，置于4℃的搖床上孵育過夜；回收一抗，TBST洗膜3次，置搖床上孵育二抗90min；TBST洗膜3次后，將ECL液的A液與B液按1∶1比例混合，將膜浸漬混合液后拿出置于曝光儀下曝光、攝片。采用ImageJ1.46軟件對條帶進行灰度定量分析。

1.3.4 動物實驗

BALB/c裸鼠，雌性，5周齡，體質量16-18 g，購于中國科學院上海實驗動物中心；將裸鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學SPF級動物房，飼養(yǎng)一周后進行實驗；飼養(yǎng)條件為12 h光暗循環(huán)，22±1℃，濕度為55±5%。飼料和水均在消毒后由小鼠自由攝?。粍游飳嶒灥某绦蛞勋@得動物倫理委員會批準，所有動物均按照國家和上海中醫(yī)藥大學動物中心動物實用管理條例進行實驗設計和實施。

將人胰腺癌細胞MIA PaCa-2消化計數(shù)，PBS重懸后將細胞濃度調整至2×107個/mL，置于冰上備用。腹腔注射2%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，腹腔開小口，將100μL腫瘤細胞混懸液從胰腺尾部注入胰腺組織，切口縫合后，待小鼠蘇醒放回籠中。一周后，將小鼠隨機分為三組，對照組隔天腹腔注射生理鹽水，給藥組隔天腹腔注射GUTK（10mg·kg-1），陽性藥對照組每周兩次腹腔注射gemcitabine（20mg·kg-1），小鼠給藥4周后進行解剖，取腫瘤組織，用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑；腫瘤體積=ab2/2，a、b代表腫瘤的長徑和短徑。

1.3.5 免疫組織化學

將裸鼠處死后，取下胰腺癌組織，立即用10%的中性多聚甲醛固定，置于4℃搖床上過夜，依次經過50%乙醇-75%乙醇-85%乙醇-95%乙醇-無水乙醇脫水，每次1 h，放置于石蠟與二甲苯（1：1）的混合液中浸漬30min，在轉移至石蠟液中浸漬2次，每次2 h，待組織表面的蠟液凝固，后迅速冷卻；將包埋好的組織蠟塊切成4μM，貼于載玻片上，60℃烤片，存于通風處；經抗原修復后孵育一抗cleaved Caspase-3抗體，一抗?jié)舛葹?∶500，4℃過夜；棄一抗，洗片3次，孵育二抗，30min；棄二抗，洗片3次，孵育HRP生物標志鏈30min；棄生物標志鏈，洗片，DAB顯色后蒸餾水沖洗10min，蘇木素染色10 min，鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗至泛藍20min；脫水后用中性樹脂封閉固定；顯微鏡下觀察、拍照。采用Image-Pro Plus6.0軟件進行定量分析。每只動物選取切片3張，每張選取細胞分布均勻的3個視野進行觀察，記錄400倍鏡下cleaved Caspase-3呈陽性的細胞個數(shù)，3個視野取均值做統(tǒng)計。

1.3.6 統(tǒng)計分析方法

實驗數(shù)據用平均值±標準差(xˉ±s)表示，使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，各實驗組之間的差異采用One-Way ANOVA進行方差分析，P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001表示具有顯著或極顯著統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 GUTK具有抑制胰腺癌細胞增殖的作用

首先，我們采用MTT法分別在5株人胰腺癌細胞MIA PaCa-2、PANC-1、BxPC-3、SW 1990和Capan-1上檢測了GUTK（結構式如圖1所示）抑制細胞增殖的作用。結果如表1所示，在GUTK作用72 h后，對5株人胰腺癌細胞均表現(xiàn)出一定的增殖抑制作用，其中GUTK在MIA PaCa-2、BxPC-3和PANC-1細胞上的IC50均在5μM左右，具有較強的細胞毒作用。

2.2 GUTK誘導M IA PaCa-2細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡

為進一步闡明GUTK對胰腺癌細胞株產生的細胞毒作用，本文運用蛋白免疫印跡法觀察GUTK處理前后，MIA PaCa-2細胞中凋亡相關蛋白表達水平的變化。如圖2所示，在10μM GUTK處理24 h和5μM GUTK處理48 h后均出現(xiàn)明顯的cleaved Caspase-3和cleaved PARP條帶，表明GUTK可以誘導Caspase-3和PARP的剪切，使細胞不能修復DNA的損傷，而發(fā)生細胞凋亡。隨后本文進一步檢測了Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-xL的變化，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，Bcl-xL有下降趨勢，并呈一定的時間依賴性。這些結果說明GUTK能激活Caspase-3級聯(lián)反應，誘導MIA PaCa-2細胞發(fā)生線粒體途徑的細胞凋亡。

2.3 GUTK具有抑制人胰腺癌裸鼠原位移植瘤生長的作用

體外實驗結果表明GUTK能誘導人胰腺癌細胞MIA PaCa-2發(fā)生線粒體途徑的凋亡，進而發(fā)揮抑制胰腺癌細胞增殖的作用。為了進一步探討GUTK可否在體內抑制胰腺癌的生長，本文采用裸鼠原位移植人胰腺癌MIA PaCa-2細胞的動物模型，一周后腹腔注射GUTK（10mg·kg-1）進行治療，隔天給藥，陽性藥對照組每周兩次腹腔注射gemcitabine（20mg·kg-1）。結果如圖3所示，在給藥4周后，與對照組相比，GUTK組的瘤重和瘤體積均有明顯減小的趨勢（P＜0.01），并且效果與陽性藥相當，表明GUTK在體內具有較好地抑制胰腺癌生長的作用。

圖1 云南藤黃中提取的化合物Guttiferone K的結構式

表1 化合物Guttiferone K（GUTK）在人胰腺癌細胞株上的IC50/μM(±s)

表1 化合物Guttiferone K（GUTK）在人胰腺癌細胞株上的IC50/μM(±s)

細胞株GUTK MIA PaCa-2 4.65±0.63 BxPC-3 4.57±0.27 PANC-1 5.10±0.57 SW1990 15.41±0.72 Capan-1 16.47±4.06

2.4 GUTK誘導裸鼠原位移植人胰腺癌瘤細胞凋亡

本文進一步通過免疫組織化學染色的方法來檢測腫瘤組織中cleaved Caspase-3的變化水平。結果如圖4所示，GUTK組和gemcitabine組的cleaved Caspase-3蛋白表達水平均明顯高于對照組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。說明GUTK通過誘導人胰腺癌裸鼠原位移植瘤發(fā)生細胞凋亡，進而發(fā)揮其體內抗腫瘤的效果，且這一作用機理與體外實驗結果相吻合。

3 討論

酮（xanthones）和PPAP是中國藤黃屬植物中最主要的兩類次生代謝物的化學成分，具有廣泛的生物活性，尤其是抗腫瘤活性較為突出，其中從云南藤黃果實中提取分離的PPAP類化合物Guttiferone K（GUTK）是典型的代表，具有多種抗腫瘤活性。在營養(yǎng)缺乏條件下，GUTK能通過抑制Akt、mTOR的磷酸化來誘導細胞自噬，并通過誘導細胞內活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的積累和升高JNK激酶的磷酸化水平誘導人宮頸癌細胞Hela細胞的凋亡[7]；能通過升高PFN1蛋白的表達水平影響肌動蛋白的功能，從而抑制肝癌轉移和侵襲[8]；可降低cyclins D1、cyclins D3及CDK4、CDK6蛋白的表達水平誘導人結腸癌HT-29細胞發(fā)生細胞周期阻滯，亦可調控HT-29細胞中JNK通路影響細胞Caspase-3表達活性，進而誘導細胞凋亡[9]。在靜止期前列腺癌腫瘤復發(fā)模型中，能夠通過穩(wěn)定FBXW7蛋白，調控c-MYC蛋白的泛素化降解途徑，具有潛在的抑制前列腺癌復發(fā)的作用[10]。綜上，GUTK能通過誘導凋亡、細胞周期阻滯、誘導自噬、抑制轉移及靜止期癌細胞激活等作用來發(fā)揮其抗腫瘤活性，提示GUTK抑制癌癥的作用具有多靶點的特征。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測GUTK處理MIA PaCa-2細胞后Caspase-3、cleaved Caspase-3、PARP、cleaved PARP和Bcl-xL蛋白的表達水平

圖3 GUTK對裸鼠原位移植人胰腺癌MIA PaCa-2細胞的生長抑制作用（n=6）

圖4 免疫組織化學檢測腫瘤組織中cleaved Caspase-3蛋白的表達水平（標尺=20μm，n=3）

本課題組前期對GUTK在多種人源腫瘤細胞中的抗癌活性進行了篩選，得出GUTK對于胰腺癌、前列腺癌、肝癌、結腸癌、宮頸癌等均具有良好的抑制作用，提示其具有廣譜的抗癌作用。其中，GUTK對胰腺腺癌BxPC-3細胞、胰腺癌MIA PaCa-2細胞具有較強的細胞毒性，胰腺癌素有“癌中之王”之稱，這一發(fā)現(xiàn)對于開發(fā)治療胰腺癌的藥物具有重要意義。為探究GUTK對于胰腺癌各亞型是否具有廣譜抑制能力，本實驗進一步檢測了GUTK對5株人胰腺癌細胞MIA PaCa-2、Bx-PC-3、SW1990、Capan-1和PANC-1的細胞毒作用。結果顯示，GUTK在MIA PaCa-2、BxPC-3和PANC-1 3株胰腺癌細胞中的IC50均在5mM左右，抑制作用較強。這3株癌細胞都源自于人胰腺組織，分別是胰腺癌導管癌細胞、人原位胰腺癌細胞，以及導管癌細胞。而對于肝轉移的Capan-1細胞和脾轉移的SW1990胰腺癌細胞的IC50在15mM左右?；谝陨辖Y果分析，GUTK對原位胰腺癌細胞的生長抑制作用強于發(fā)生轉移的胰腺癌細胞，提示GUTK更適合開發(fā)成為對原位胰腺癌進行早期干預的藥物。

本研究還采用人胰腺癌裸鼠原位移植瘤的動物模型對GUTK體內抑癌活性進行研究，發(fā)現(xiàn)GUTK可以有效地抑制胰腺癌原位移植瘤的生長，并誘導腫瘤組織發(fā)生細胞凋亡。與之前已報道的GUTK體內抑癌研究的動物模型相比，原位接種移植瘤的動物模型更能模擬臨床腫瘤生長的環(huán)境[11]，考查藥物到達靶器官的能力，更加準確的評估GUTK體內抑制胰腺癌的藥效。

綜上所述，本文通過對GUTK體內和體外抑制胰腺癌的活性進行研究，發(fā)現(xiàn)GUTK可以誘導人胰腺癌細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡，從而發(fā)揮其抑癌作用，且無明顯的毒副作用。提示GUTK有望開發(fā)成為對原位胰腺癌進行早期干預的治療藥物，但其作用機理需進行更加深入的研究和探討。

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TheActivity Study of Pancreatic Cancer Inhibited by Guttiferone K both in vitro and in vivo

Chen Xiaoqiong1,2,LiYang1,2,Zhang Yijing1,2,Wu Rong1,2,XiZhichao1,2,Tan Hongsheng1,2
(1.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.Engineering Research CenterofShanghaiCollegesfor TCM New Drug Discovery,Shanghai201203,China)

This study aimed atexploring the effects of Guttiferone K(GUTK),a compound isolated from G.yunnanensis, on inhibiting the proliferation of pancreatic cancer cells both in vitro and in vivo.MTT assay was used to detect the inhibitory effects of GUTK on the proliferation of five human pancreatic cancer cell lines.Western blotwas adopted to detect the apoptosis-related protein expressions of Caspase-3,poly adenosinediphosphate-ribose polymerase(PARP) and Bcl-xL.For in vivo study,the human pancreatic cancer cell MIA PaCa-2 was orthotopically injected into the pancreatic tail of the orthotopicmice.One week later,GUTK was administered by intraperitoneal(i.p.)injection every other day for 4 weeks.The volume and weightof the tumor tissueweremeasured.The protein expression levelof cleaved caspase-3 in tumor tissue ofall the groupswas quantified by immunohistochemistry.As a result,itwas found thatGUTK effectively inhibited the proliferation of the five human pancreatic cancer cell lines at a low concentration.GUTK induced caspase-related apoptosisby triggering a seriesofevents in MIA PaCa-2 cells including cleaved Caspase-3 and PARPactivation,Bcl-xL down-regulation,and eventually cell death in a time and dose dependentmanner.Furthermore, in vivo study revealed that intraperitoneal injection of GUTK significantly suppressed the growth of pancreatic cancer cells in the orthotopic mouse models,and the protein level of cleaved caspase-3 was increased in the GUTK and gemcitabine treated groups.Itwas concluded thatGUTK induced apoptosis in human pancreatic cancer both in vitro and in vivo,and waspotential to develop intoa clinicalanticanceragent.

Garcinia yunnanensis,Guttiferone K,pancreatic cancer,apoptosis

10.11842/wst.2017.02.009

R28

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2017-02-20

修回日期：2017-02-20

＊中國博士后科學基金會第60批中國博士后科學基金面上項目（2016M601641）：藤黃屬PPAPs類化合物抑制前列腺癌復發(fā)的活性研究，負責人：席志超

＊＊通訊作者：譚紅勝，博士，副研究員，主要研究方向：中藥活性成分研究及中藥新藥研發(fā)。