伍曉紅，邢磊，聶婉，陳秋玲，王琤，*

（1.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌330013；2.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330029）

克倫特羅的檢測方法研究進展

伍曉紅1，邢磊2，聶婉1，陳秋玲1，王琤1，*

（1.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌330013；2.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330029）

綜述克倫特羅的檢測方法研究進展，分別對各種檢測方法的特點進行討論，并對克倫特羅的檢測方法的研究前景進行了展望，以期對畜產品安全檢測有一定的參考作用。

畜產品；克倫特羅；檢測

克倫特羅（Clenbuterol hydrochloride，CL）是一種β-興奮劑，化學名為羥甲叔丁腎上腺素，俗稱瘦肉精，可通過改變豬的代謝途徑而將其胴體瘦肉率最少提高10%[1-2]。人食用含CL的畜產品15min后到6 h之間，會出現(xiàn)肌肉抽搐、嘔吐、發(fā)熱等中毒癥狀，持續(xù)時間90min甚至6 d。我國明確禁止在飼料及飲水中添加CL，但大面積的CL中毒事件仍然時有發(fā)生，其造成的影響極為惡劣[3]。因此，研究更高效、迅速的檢測方法對可有效地監(jiān)測畜產品安全、保障消費者的健康。目前針對豬體內殘留的CL的檢測普遍選取的的樣品是豬尿與豬肉，且國家相關法律法規(guī)要求被檢樣品中不得檢出CL，因此相應方法的CL檢出限即為其判定限。當下已有不少較為成熟的相應的檢測技術已經面世，但在一些較早的報道中其改進情況以及近年研發(fā)的一些新興檢測技術未完全被推廣。因此本文就豬尿與豬肉中CL的檢測方法及最新研究進展作一概述，以期對實際檢測有一定的參考作用。

1 感官檢測法

感官檢測法是最直接、簡便的方法，通過肉眼等感官對生豬、豬肉進行直接觀察來初步判斷豬肉中是否含有CL。肉眼觀察未屠宰的生豬，若背毛稀疏松軟，皮膚白里泛紅，腹部無下墜感，臀部結實，背部在驅打后易見傷痕；屠宰后豬肉肉色鮮艷、肉質松軟，后臀脂肪層極薄，肌肉鼓起，腹股溝布有充血的毛細血管[4]，則可判斷豬肉中可能含有CL。感官檢測法對檢測人員的技術要求極低，適用于對豬肉中是否含有大量CL進行的粗略估測，但無法準確判定CL的含量，且由于不同人員的判定標準不同而容易造成誤判。

2 免疫分析技術（IA）

2.1 放射免疫分析法（RIA）

RIA又稱放射免疫檢測法，利用放射性核素對抗原或抗體進行標記，再檢測后者與待測物質結合形成的帶放射性的免疫反應產物從而間接檢測待測物質含量的方法，最早由Ropita等報道將其應用于CL的分析。RIA具有高靈敏度、特異性強的優(yōu)點，但是技術難度大，放射性廢物不易處理，儀器昂貴，且放射性同位素對操作員有一定的傷害[5]。因此RIA法一般難以廣泛使用。林杰等[6]對豬尿樣本進行CharmⅡRIA測定，得出其檢測限為200μg/L。由于其檢測限遠高于其他常用的現(xiàn)行CL檢測方法，因此RIA法不能很好地滿足監(jiān)管部門CL的檢測要求。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA是基于酶免疫法（EIA）建立的一種應用較為廣泛的檢測方法。免疫吸附劑為固定的抗原或抗體，與酶標記的待測物發(fā)生特異性結合后，再與酶作用的底物顯色劑發(fā)生反應而顯色，通過觀測或用酶標儀器測定而判定CL的濃度，常見的類型有間接法、雙抗夾心法、競爭法[7]。ELISA法具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、高通量的優(yōu)點，GB/T5009.192-2003《動物性食品中克倫特羅殘留量的測定》中所規(guī)定的檢測方法的最低檢出限為0.5μg/L，而經過改進的ELISA的最低檢出限可降低到0.1μg/L。但由于其檢測結果基于酶作用，檢測過程中對溫度、光照要求較高，同時存在假陽性率較高的問題。林愛玉[8]對生豬尿液進行CL檢測時發(fā)現(xiàn)ELISA在低于20℃、高于25℃的環(huán)境進行檢測均可能造成結果偏差，假陽性率高達15%～20%。

2.3 化學發(fā)光酶免疫法（CLEIA）

CLEIA是基于RIA和ELISA發(fā)展的一種分析方法，以堿性磷酸酶（ALP）、辣根過氧化物酶（HRP）作為標記酶，以魯米諾等發(fā)光劑作為底物，利用魯米諾與過氧化氫構成的化學發(fā)光體系進行標記反應，從而檢測CL濃度。CLEIA法兼?zhèn)銻IA和EILSA法的優(yōu)點，同時克服了ELISA精密性差的缺點。徐曉嬰[9]等對CLEIA法的反應溫度、競爭反應時間等參數進行優(yōu)化，CL測定的線性檢測范圍可達到0.04μg/L～42.5μg/L。王碩等[10]建立的直接競爭化學發(fā)光酶免疫法（dc-CLEIA）優(yōu)化了離子強度和pH值，使優(yōu)化后的dc-CLEIA對豬肉樣本中的CL的樣本回收率在83%～98%之間。楊金易等[11]進一步優(yōu)化了dc-CLEIA法，豬肉樣品CL的回收率提高至91.0%～103.3%，豬尿樣品CL的回收率為93.4%～100.3%。

2.4 膠體金免疫層析法（GICA）

GICA法以膠體金作為示蹤標記物，標記特異性CL單克隆抗體。一般使用拼裝的膠體金試紙條對CL進行檢測，試紙條具有含CL-BSA偶聯(lián)物的檢測線（T）和含羊抗鼠IgG多克隆抗體的對照線（C）。試紙條測試段浸有樣液后CL金標單抗體在試紙條上發(fā)生層析泳動，接觸T線后顯紅色，多余的CL金標單抗體繼續(xù)泳動在C線接觸顯紅色。CL陽性樣本在TC線均顯色，而陰性樣本則只顯示T線。通過T線值法和T/C比值法可以進行CL定量測定。GICA法具有操作簡單、檢測時間短、成本低廉的優(yōu)勢，適合長期的小批量檢測活動，但特異性和靈敏度較差，膠體金需要達到107個/mm2才會形成明顯的紅色，市售檢測卡靈敏度一般為3μg/L～5μg/L，略高于現(xiàn)行標準NY/T 933-2005《尿液中鹽酸克侖特羅的測定膠體金免疫層析法》中CL判定限（3μg/L），因此存在一定的誤判的可能性。張慧嫦等[12]用GICA檢測豬肉等樣品中CL并用EILSA復檢時發(fā)現(xiàn)若降低檢測限值則容易出現(xiàn)假陽性。張洪才等[13]建立的基于GICA的光電傳感檢測方法可利用光電傳感器檢測肉眼無法觀測到的試紙條上的微量顯色，并將檢測限降低到0.05μg/L，在傳統(tǒng)的GICA法上有著很大程度的改進。

2.5 時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）

TRFIA是一種新型的超微量非放射性標記免疫分析技術，利用鑭系元素及其螯合物的的熒光性，以其代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光物質、同位素等標記物對待測物進行檢測。根據反應產物的熒光強度和相對熒光強度的比值進行待測物的濃度測定，穩(wěn)定性強，靈敏度高。雷紅濤等[14]以Eu3+標記抗原檢測豬尿中CL的含量，最低檢測限為0.03μg/L。樊曉博等[15]在此基礎上進行優(yōu)化，建立以Eu3+標記抗原的的直接競爭熒光免疫分析體系，檢測豬尿中CL的靈敏度達到0.02μg/L，與沙丁胺醇等結構類似物交叉反應率小于1%，可有效地避免檢測誤差。

3 色譜分析法

3.1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC是我國規(guī)定的克倫特羅的殘留的半確證性檢測的方法之一，其液相色譜分離系統(tǒng)由固定相（吸附劑）和流動相（溶劑）組成，由流動相攜帶待測物進入色譜柱后，待測物中各組分由于吸附性、分配系數等的差異而被分離。其在國家規(guī)定的HPLC標準方法中最低檢出限為0.5μg/L，可作為較可靠的檢測方法而采用。HPLC具有專屬性好、速度快、檢測精確度高、假陽性率低、檢測前不需衍生化處理的優(yōu)點，但所需儀器昂貴且檢測過程繁瑣，一般需要經過色譜柱凈化前處理。HPLC適用于對不耐熱或具極性的物質的檢測，可以與質譜（MS）等系統(tǒng)聯(lián)用。丁芳林等[16-17]檢測豬肉中CL時使用體積比為甲醇∶水=26∶74的混合液作為流動相，在5min后即得到較理想的峰形，在此基礎上加載液—液—液微萃取系統(tǒng)對含CL的豬尿進行檢測時，其最低檢出濃度可降低到0.025μg/mL，其檢測靈敏度較以往的HPLC方法有更大的提高。

3.2 高效毛細管電泳法（HPCE）

HPCE是一種在高壓直流電場下通過毛細管進行組分分離的液相分離技術。在電解質溶液中施加高壓電場，使樣本中不同組分由于淌度或分配的差異而通過毛細管實現(xiàn)分離。HPCE具有高效、快速、少樣、簡便等的優(yōu)點。張敬敬等[18]在4min內實現(xiàn)CL、萊克多巴胺、沙丁胺醇的分離，加標回收率為89.20%～95.34%，相關系數達到0.997 1。李金祥等[19]將CL在2min內分離，最低檢出限為0.5mg/L，加標回收率達到86.0%～94.0%。趙凌國等[20]采用對毛細管內壁進行納米金材料（QC-Au NPs）的動態(tài)涂層，CL的最低檢出限為0.06μg/mL，定量限為0.20μg/mL。

4 色譜-質譜串聯(lián)法

4.1 氣相色譜-質譜法（GC-MS）

GC-MS是將氣相色譜法與質譜法聯(lián)用的檢測手段，以穩(wěn)壓恒速的氣體作為流動相，與氣化的樣品混合帶入色譜柱進行分離，再將試樣中各組分在離子源中電離并進行質量分析得到質譜圖確定被檢物的質量。國家標準規(guī)定的GC-MS的檢出限為0.5μg/L，但由于其系統(tǒng)優(yōu)化后的檢測限可達到0.02μg/L，相對于HPLC而言靈敏度更高。因檢測前需對待測物質進行衍生化，導致耗時加長，對預處理要求更高。目前一般應用于篩選后陽性樣品尤其集中于對動物尿液的確證分析，衍生化試劑一般采用雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）、甲基三氯硅烷（MTS）等硅烷化試劑?？敌鞯萚21]利用GC-MS對豬肉中CL進行檢測時加入乙氰進行衍生，改善色譜行為并提高檢測靈敏度，加標回收率為99.56%～105.40%。吳銀良等[22]建立乙酸乙酯提取-稀鹽酸反萃取-乙酸乙酯再反萃取相結合的方法，進行GC-MS測定時加標回收率為79.1%～95.7%。

4.2 高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）

HPLC-MS法的檢測原理與GC-MS基本相同，但使用的流動相為液體。具有可分析物質類型多、檢測限低、分離能力強、前處理無需衍生化、耗時較短的優(yōu)點。在國家規(guī)定的HPLC-MS方法中的檢出限為0.5μg/L，與GC-MS一致。陳海玲等[23]對豬尿中的CL和萊克多巴胺同時進行測定，樣品中各組分分離較好，CL的加標回收率為69.2%～76.2%。吳慶潔等[24]對51份豬肉、雞肉等畜禽肌肉樣本進行CL的殘留檢測，最低檢出量達到1.25 ng/μL。朱曉艾等[25]優(yōu)化了其前處理方法，采用乙酸銨溶液提取、蛋白質沉淀的方法，加標回收率提高到88.5%～94.03%，在穩(wěn)定性試驗中24 h內出峰穩(wěn)定。

4.3 超高效液相色譜-四級桿-飛行時間-質譜法（UHPLC-Q-TOF-MS）

UHPLC-Q-TOF-MS法是在近年才應用于檢測CL的一種新型的檢測方法，相關研究報道較少。相對高效液相色譜，UHPLC-Q-TOF-MS具有更強的分離能力和靈敏度，結合墊子噴霧離子源高分辨飛行時間質譜可精確測定待測物質的質量數，推算其分子式[26]。蔣萬楓等[27]對豬肉樣本中CL進行加標回收實驗，分別添加0.5、2.0、5.0、10.0μg/kg的混標溶液，回收率為100%～110%，相對標準偏差為8.8%～18.5%。

4.4 液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）

LC-MS/MS是將液相色譜-質譜法（LC-MS）與質譜檢測系統(tǒng)進一步聯(lián)用的一種檢測方法。通過使LCMS檢測系統(tǒng)中的待測物質的母離子進一步裂解，從而得到更精確的待測物質的質譜信息。LC-MS/MS兼?zhèn)湟合嗌V的分離能力強和質譜的可分析物質結構的優(yōu)點，精確度好、靈敏度高、線性范圍廣，在農業(yè)部1025號公告-18-2008國家標準所規(guī)定的LC-MS/MS方法的豬肉中CL的檢測限為0.25μg/L，定量限為0.5μg/L，在實際檢測中其對于CL的檢出結果可信度較高。黃艷梅等[29]利用LC-MS/MS參照常規(guī)方法進行前處理，對豬肉中9種β-受動劑進行同時測定，結果顯示其相對標準偏差為0.97%～11.53%，回收率為88.31%～118.61%。陳國等[30]測定豬肉中的CL單一對映體和手性對映體時，使用手性色譜柱進行拆分，檢測得到的相關系數分別為0.997 7和0.977 0。

5 生物傳感器技術（BS）

BS是一種新興的濃度測定的技術，可感應待測物濃度并將數值轉換成電信號輸出，從而實現(xiàn)對待測物的檢測。當分子識別元件與被識別物質接觸時，由于化學和物理信號的產生（免疫反應、產生熒光、散發(fā)熱量等），利用電學測量方法可接受信號并進行轉換輸出，最低檢出限為0.1μg/L。BS具有高速、簡便、靈敏、廉價、便攜、可重復利用等特點，可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測和在線監(jiān)測，能在短時間內分析大量待測分子[30-31]。PizaarielloA等首先報道了應用BS進行CL的檢測。肖紅玉等[32-33]對CL進行檢測時建立的免疫生物傳感器，可在20min內完成檢測，準確度高達97%。在后續(xù)研究中肖紅玉等發(fā)現(xiàn)，進行CL檢測的過程中采用雙酶（葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶）體系比采用單酶（葡萄糖氧化酶）體系更為靈敏，前者靈敏度大約為后者的兩倍。

6 其他檢測方法

近年來利用CdTe量子點免疫技術進行CL檢測的研究正在開展，已研發(fā)出基于GICA原理而發(fā)展的CdTe/ZnSe核殼量子點免疫層析法，以CdTe/ZnSe核殼量子點作為標記物，代替膠體金對抗克倫特羅多克隆抗體進行標記[34]。胡華軍等[35]報道了其對CdTe/ZnSe核殼量子點免疫層析試紙條的研制并將試紙條應用于對CL的檢測。研究表明，此免疫層析試紙條的CL檢測靈敏度可達1μg/L，且特異性較強，不與萊克多巴胺、西馬特羅、沙丁胺醇、特布他林發(fā)生交叉反應。

光學表面等離子共振檢測技術在生化、醫(yī)學等領域具有較大的的應用前景，其檢測CL的原理是利用非掃描性光學SPR生物傳感器檢測附著在金膜表面的CL的質量，將光束以一定角度射入，使表面等離子波產生共振，將CL固定在共振時反射光信號最弱的部位，通過競爭免疫分析測定其物質的量的變化而測定CL的含量。李會芹等[36]利用此技術測定豬肉中CL含量時，將10.198 2 g肉樣用20mL 0.1mol/L高氯酸勻漿處理后進行檢測，獲得的相應信號與CL含量的相關系數達到0.997，其最低檢出限為1.25mg/L。

7 展望

目前克倫特羅的檢測的技術正日趨精確化、簡便化、廉價化，但一般不能同時兼?zhèn)溲杆?、準確、廉價、高通量等優(yōu)點。當下的研究方向更傾向于提高精確度、縮短檢測時長、檢測設備的簡易化，這種趨勢在免疫檢測技術與色相檢測技術的發(fā)展、生物傳感器以及采用新型標記物的試紙條的研制等最新的檢測技術的不斷應用上的體現(xiàn)尤為明顯。與此同時，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，在實際應用中需要高通量的新型中大型設備進行快速篩查。因此在今后的發(fā)展中，便捷的現(xiàn)場檢測與先進的儀器確證方法相結合的方式會運用的更加廣泛。

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Research Progress of Detection Methods of Clenbuterol Hydrochloride

WU Xiao-hong1，XING Lei2，NIE Wan1，CHEN Qiu-ling1，WANG Cheng-wei1，*
（1.College of Life Science，Jiangxi Science&Technology Normal University，Nanchang 330013，Jiangxi，China；2.Jiangxi Province Institute of Veterinary and Feed Control，Nanchang330029，Jiangxi，China）

This paper was reviewed some progresses in the detection method of clenbuterol hydrochloride and the characteristics of various detection methods were discussed，besides，prospected the research foreground of the detection method of clenbuterol hydrochloride，expecting this reserch finding had a certain referense value for the livestock product safety test.

animal products；clenbuterol hydrochloride；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.048

2016-05-28

江西科技師范大學第九屆本科生創(chuàng)業(yè)、科研基金項目（20150901008）

伍曉紅（1994—），女（漢），本科生，生物科學專業(yè)。