刁 碩,王紅旗,許 潔,趙一村

(北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京 100875)

低溫耐鹽芘降解菌的篩選鑒定及降解特性研究

刁 碩,王紅旗*,許 潔,趙一村

(北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京 100875)

低溫條件(10℃)下,采用定時(shí)定量轉(zhuǎn)接、間歇式逐步提高PAHs濃度的方法,從天津?yàn)I海濕地石油污染土壤中獲得能以多環(huán)芳烴芘為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌群H和純化菌株DYC-1,經(jīng)生理生化和16S rDNA基因序列BLAST對(duì)比結(jié)果分析,菌株DYC-1屬于紅球菌屬(Rhodococcus).降解特性分析結(jié)果表明,10℃低溫條件下,紅球菌DYC-1與菌群H降解能力相似,對(duì)20mg/L芘的15d降解率達(dá)到35%以上;紅球菌DYC-1具有較好的耐鹽能力和較廣的降解底物譜,菌株DYC-1的最優(yōu)降解條件為:低溫10 ℃,鹽度2%的條件下,在pH8,搖床轉(zhuǎn)速為110r/min,接菌量為5%時(shí),對(duì)于初始濃度為20mg/L的芘能達(dá)到35%以上的降解率.

低溫；耐鹽；芘；降解；紅球菌DYC-1

多環(huán)芳烴(PAHs)作為典型的持久性有機(jī)污染物[1],不僅存在大氣中,由于其自身的穩(wěn)定性,進(jìn)入土壤后便長(zhǎng)期殘留其中,在土壤中的半衰期為2～24個(gè)月[2],隨著地表水及降水的沖刷,不斷向地下水釋放,對(duì)地下水環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染和破壞[3].有研究表明,在PAHs污染土壤中,土著微生物對(duì)PAHs的轉(zhuǎn)化能力顯著高于外源微生物,轉(zhuǎn)化率相差3000倍以上.同時(shí),土著菌及混合菌對(duì)污染物具有更好的降解能力,對(duì)外界環(huán)境的變化(如溫度、pH等)也有更好的適應(yīng)性,易于在環(huán)境中保持競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[4].因此,從長(zhǎng)期受PAHs污染的土壤中分離篩選出高效PAHs降解菌,是生物修復(fù)PAHs污染土壤的第一步,也是關(guān)鍵的一步.

天津?yàn)I海濕地處于我國(guó)北方濱海地區(qū),年平均溫度多在15℃或以下.近年來(lái)濱海濕地由于油田開發(fā)等生產(chǎn)活動(dòng)的進(jìn)行,在經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng)的同時(shí)也造成了石油污染.PAHs是濱海濕地石油污染土壤中的主要污染物,其中含四個(gè)苯環(huán)的芘(Pyrene)是主要污染物之一.石油的生產(chǎn)多伴隨著高鹽環(huán)境的產(chǎn)生,降解芘的微生物在低溫高鹽條件下的生長(zhǎng)和代謝都要受到一定程度的限制.Whyte等[5]指出,耐冷型假單胞菌在低溫下(5～10℃)可降解萘,Deppe等[6]發(fā)現(xiàn),北極的細(xì)菌共生體也可以在4℃降解萘.宋立超等[7]分離出一組菌群,在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～2%,15d后對(duì)菲、芘的降解率可達(dá)到92.1%和65.8%.張巧巧[8]研究發(fā)現(xiàn),菌株SE12在液體培養(yǎng)條件下對(duì)芘的降解效果十分顯著,在芘初始濃度為50,100,200mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d,降解率分別達(dá)到86.4%, 96.4%與79.6%.SE12能將初始濃度100mg/L的芘在15d幾乎完全降解,但是當(dāng)初始濃度低于或者高于100mg/L時(shí)降解率都有所降低.但目前針對(duì)低溫高鹽復(fù)合環(huán)境下PAHs芘降解菌的研究較少,其在低溫高鹽環(huán)境下的生長(zhǎng)特性及對(duì)PAHs芘的降解特性尚不明確.本文可科學(xué)指導(dǎo)濱海濕地PAHs污染土壤的生物修復(fù)工作,也可為PAHs污染治理提供適宜菌株及理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

本研究所用土壤樣品均采自天津?yàn)I海濕地石油污染地區(qū)(采樣坐標(biāo)N38°44′57.1″E117°29′51.1″)土壤表層10～15cm處,采取占地面積最大的鹽漬化污染區(qū)域土壤樣品后放于塑料自封袋中,封口,帶回實(shí)驗(yàn)室后過(guò)2mm篩,放在4℃冰箱進(jìn)行保存.理化性質(zhì)如表1所示.

1.2 藥品與試劑

本文所使用的主要藥品及來(lái)源:芘、菲、苯并b熒蒽、苯并a蒽(分析純,日本TCL公司);熒蒽、芴(分析純,美國(guó)Sigma公司);Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4·7H2O、CaCl2、NaCl、NaNO3、FeSO4·7H2O、K2HPO4等、水楊酸、葡萄糖、牛肉膏、瓊脂粉(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司);蛋白胨(分析純,北京鼎國(guó)生物試劑公司);酵母粉(分析純,OXOID公司);瓊脂糖(分析純,Spain公司);正己烷、乙腈、丙酮(分析純,美國(guó)J.T.Baker公司).

試劑及來(lái)源:磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4),醋酸鉛濾膜,安捷倫小瓶.

1.3 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM):K2HPO41.0g, NH4H2PO41.0g,(NH4)2SO41.0g,MgSO4·7H2O 0.2g,KNO33.0g,微量元素1.0mL(MnSO439.9mg,ZnSO4·H2O 42.8mg, (NH4)2MoO4·4H2O 34.7mg,蒸餾水1000mL),NaCl 20.0g(鹽度為2%),瓊脂15.0g(固體培養(yǎng)基)去離子水定容到1000mL,pH調(diào)為8.0,121℃高壓蒸汽滅菌20min;

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g,NaCl 20.0g(鹽度為2%),瓊脂15.0g(固體培養(yǎng)基),去離子水定容到1000mL,pH值調(diào)為8.0, 121℃高壓蒸汽滅菌20min;

選擇性無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基:無(wú)菌條件下,在已滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入一定量芘的丙酮溶液,使其達(dá)到預(yù)定濃度,置于恒溫振蕩器上以120r/min的振蕩頻率振蕩24h,待丙酮完全揮發(fā)后使用;

選擇性無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基121℃下高壓滅菌20min,倒入平板,在其表面涂布芘的丙酮溶液,于超凈臺(tái)上待丙酮完全揮發(fā)后使用.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 篩選方法 在低于正常室溫的10℃低溫條件下,采用土壤菌懸液制備——初篩——保存混合菌及分離純化——復(fù)篩——保藏菌株的方法獲得芘降解菌群H和單菌DYC-1.

1.4.2 菌株鑒定 表型特征鑒定:參照伯杰氏手冊(cè)第八版[9]細(xì)菌分類學(xué)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn).

分子生物學(xué)鑒定:利用16S rDNA 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定.采用北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成的引物,以該菌株基因組DNA為模板,擴(kuò)增出該菌株16S rDNA序列.PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL:2×TaqPCR MasterMix 12.5μL (0.1U Taq Polymerase/μL;500μmol/L dNTP;20mmol/L Tris-H Cl (pH8.3);100mmol/L KCl;3mmol/L MgCl2),引物27F (10μmol/L)1μL,引物1492R (10μmol/ L)1μL,菌液模板1μL,ddH2O 9.5μL,總體積25μL. PCR擴(kuò)增條件為: 94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s,55℃復(fù)性430s, 72℃延伸1.5min,進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min,在4℃下保存.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行純化測(cè)序,測(cè)序結(jié)束后,將所測(cè)基因序列輸入到NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中,用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具與已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì),從而確定微生物的種屬.使用軟件MEGA6.0進(jìn)行序列同源性分析,構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4.3 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 菌懸液的制備:從-20℃冰箱取出保存單菌及菌群的甘油管,分別移出200μL至2瓶滅菌的100mL LB培養(yǎng)基中,在10℃、110r/min的搖床振蕩培養(yǎng)48h, 8000r/ min離心10min,棄去LB培養(yǎng)基,用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基液洗滌3次,制成OD600=0.8的菌懸液,備用.

本研究采用光密度法測(cè)定菌群及單菌的生長(zhǎng)曲線.在裝有已滅菌的50mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中加入芘的丙酮溶液,使培養(yǎng)基中芘濃度為20mg/L,待丙酮揮發(fā)后,準(zhǔn)確加入制備好的單菌及菌群的菌懸液2.5mL(接菌量5%),調(diào)節(jié)pH值為8.0,在溫度設(shè)置為10℃的恒溫振蕩器上以110r/min的振蕩頻率振蕩培養(yǎng).每隔24h取發(fā)酵液進(jìn)行分析,以無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值來(lái)表征菌體的生長(zhǎng)情況.以發(fā)酵液的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D600值為縱坐標(biāo),繪制菌群及單菌的生長(zhǎng)曲線.

1.4.4 芘降解能力的測(cè)定 在裝有已滅菌的50mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入一定量芘的丙酮溶液,使培養(yǎng)基中芘濃度為20mg/L,待丙酮揮發(fā)后,準(zhǔn)確加入制備好的單菌及菌群的菌懸液2.5mL,設(shè)置不加菌作為對(duì)照組,調(diào)節(jié)pH值為8.0,在溫度設(shè)置為10℃的恒溫振蕩器上以110r/min的振蕩頻率振蕩培養(yǎng),以考察菌株對(duì)芘的耐受性及降解能力.培養(yǎng)一段時(shí)間后,用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定芘的降解率,考察菌株降解能力.

1.4.5 高效液相(HPLC)分析水相中殘留的芘 樣品的前處理:采用高效液相法來(lái)分析水相中殘留的芘.首先對(duì)錐形瓶中的樣品進(jìn)行殘留芘的提取(總量50mL,整瓶萃取),加入等體積(50mL)的正己烷,在40Hz下超聲萃取30min,靜置20min后對(duì)有機(jī)相進(jìn)行分離,重復(fù)萃取兩次,合并有機(jī)相.用針管取2mL合并后的有機(jī)相,過(guò)0.2μm的醋酸鉛濾膜后置于安捷倫小瓶中,待HPLC分析.

HPLC測(cè)定條件:采用高效液相對(duì)安捷倫小瓶中萃取液進(jìn)行分析,分析儀器為配有自動(dòng)進(jìn)樣器的德國(guó)戴安公司U3000液相色譜儀,色譜柱為PAHs專用高效液相分析柱(安捷倫, 250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈/水(65:35),流速為1.2mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,柱溫25℃,進(jìn)樣體積為20μL.

1.4.6 菌株對(duì)不同底物的利用能力 準(zhǔn)備裝有無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶,分別加入濃度為100mg/L的碳源物質(zhì):鄰苯二甲酸、菲、芴、苯酚、熒蒽、鄰苯二酚、苯并[b]熒蒽、苯并[a]蒽、水楊酸,再分別加入5%菌懸液,在10℃,110r/min的搖床中振蕩培養(yǎng).依據(jù)相關(guān)研究選擇的9種碳源物質(zhì)(見3.5),每種做3個(gè)平行,共27瓶培養(yǎng)基.培養(yǎng)10d,考察紅球菌DYC-1對(duì)不同底物的利用情況.

1.4.7 降解菌的耐鹽特性研究 本研究立足濱海濕地現(xiàn)狀,選擇2%鹽度為篩選菌株條件,并探索篩選出的單菌DYC-1的耐鹽特性.

不同NaCl濃度對(duì)降解菌生長(zhǎng)狀況的影響:將DYC-1接種到LB液體培養(yǎng)基中,調(diào)整NaCl濃度分別為0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、15%、20%,檢測(cè)菌株是否生長(zhǎng).

降解菌分別在5%、10%、15%鹽度條件下的降解效果:將篩選出的單菌DYC-1接種在NaCl濃度分別為5%、10%、15%,芘濃度為20mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,觀察菌株的生長(zhǎng)特性,測(cè)定菌株對(duì)四環(huán)PAHs芘的降解率,考察其對(duì)鹽的耐受性及對(duì)高分子量PAHs的降解能力.

1.4.8 搖瓶降解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 不同初始濃度對(duì)芘降解效能的影響:準(zhǔn)備150mL的三角瓶,滅菌后在無(wú)菌操作臺(tái)上每瓶加入已滅菌的50mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,分別加入不同量芘的丙酮溶液,使芘的濃度分別為20,50,80,100,150,200,300,500mg/L,待丙酮揮發(fā)后,各加入制備好的菌液2.5mL(接種量為5%),調(diào)節(jié)pH值為8.0,在溫度設(shè)置為10℃的恒溫振蕩器上以110r/min的振蕩頻率培養(yǎng),定期取樣,測(cè)定芘降解率.

pH值變化對(duì)降解效果的影響:準(zhǔn)備150mL的三角瓶,滅菌后在無(wú)菌操作臺(tái)上每瓶加入已滅菌的50mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,加入芘的丙酮溶液,使芘的初始濃度為20mg/L,待丙酮揮發(fā)后,加入制備好的菌液2.5mL(接種量為5%),調(diào)節(jié)pH值分別為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0.在溫度設(shè)置為10℃的恒溫振蕩器上以110r/min的振蕩頻率培養(yǎng),考察菌株DYC-1對(duì)芘的降解率.

轉(zhuǎn)速變化對(duì)降解效果的影響:由于搖床轉(zhuǎn)速直接反應(yīng)水中溶解氧的含量,因此在其他條件不變的情況下,以搖床轉(zhuǎn)速來(lái)控制溶解氧的含量,設(shè)搖床轉(zhuǎn)速分別為80,110,140,170,200r/min,考察紅球菌DYC-1對(duì)芘的降解能力.

不同接種量對(duì)降解效果的影響:在其他條件不變的情況下,將菌懸液按照0.5%、1%、3%、5%、8%、10%、15%的接種量接入到含芘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,考察紅球菌DYC-1對(duì)芘的降解能力.

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選馴化菌株過(guò)程中反應(yīng)體系變化情況

錐形瓶中加入PAHs芘作為唯一碳源和能源進(jìn)行富集培養(yǎng),15d內(nèi)培養(yǎng)液顏色出現(xiàn)如下變化:乳白色(透明無(wú)色的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加入一定濃度芘后變?yōu)槿榘咨?,出現(xiàn)白色混濁,變成淡黃色-最后穩(wěn)定不變.可能是因?yàn)檐诺纳锝到膺^(guò)程中會(huì)產(chǎn)生某種中間產(chǎn)物,而在隨后各階段的富集培養(yǎng)中,變化過(guò)程會(huì)再次出現(xiàn)且所需時(shí)間逐漸縮短,表明微生物的酶體系適應(yīng)了芘存在的環(huán)境,可將其作為生長(zhǎng)基質(zhì).

2.2 菌株DYC-1的鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株DYC-1的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 菌株DYC-1的菌落呈淡黃色,圓形,直徑約3mm,表面濕潤(rùn),不透光,邊緣光滑,未向四周擴(kuò)散.相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 紅球菌DYC-1生理生化特性Table 2 Physical and biochemical characteristics of Rhodococcus sp. DYC-1

由表2的細(xì)菌生理生化反應(yīng)總特征,相關(guān)的文獻(xiàn)以及伯杰氏手冊(cè)[9],初步鑒定篩選出的芘降解單菌為紅球菌屬.

2.2.2 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 采用較易操作的16S rDNA分析方法對(duì)菌株進(jìn)行同源性序列分析.BLAST工具的對(duì)比結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)所用菌種為紅球菌(Rhodococcussp.),在GenBank中挑選與DYC-1同源性達(dá)99%的菌種,利用MEGA6.0做紅球菌DYC-1的基因發(fā)育進(jìn)化樹(圖1),結(jié)果表明DYC-1與紅球菌最為接近,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所用的菌種的確為紅球菌,課題組將其命名為紅球菌DYC-1(Rhodococcussp. DYC-1, GenBank Entry:KR029576;保藏編號(hào):CGMCC 10289).

紅球菌屬目前被認(rèn)為是可參與共代謝降解,且能降解芘效果較好的菌屬.

2.3 菌株DYC-1及菌群的生長(zhǎng)曲線

在10℃,2%鹽度條件下篩選出的菌群記為H,菌株DYC-1及菌群H的生長(zhǎng)曲線如圖2所示.

單菌DYC-1與菌群H的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)大致相同,0～2d為停滯期.單菌DYC-1在3～8d期間處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而菌群H在3～11d期間處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.菌群相對(duì)于單菌對(duì)數(shù)期較長(zhǎng),進(jìn)入穩(wěn)定期較慢,可能由于不同菌株之間競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)元素,拮抗作用所致.也可能由于不同菌株之間的促進(jìn)作用減緩了衰亡進(jìn)程,菌群在15d之后進(jìn)入衰亡期,而單菌DYC-1則衰亡得比較快,在12d之后已經(jīng)進(jìn)入衰亡期.

圖1 菌株DYC-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Rhodococcus sp. DYC-1

圖2 菌株DYC-1及菌群H的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Rhodococcus sp. DYC-1and mixed culture H

綜上所述,如果把菌株用于以后的降解試驗(yàn)時(shí),菌液的發(fā)酵時(shí)間定為8～11d之間比較合適.

2.4 單菌及菌群對(duì)芘的降解能力分析

菌群H由于含多種菌株理論上降解能力會(huì)高于單菌,但從圖3可以看出,菌群的降解能力與單菌DYC-1的降解能力相當(dāng),只是略高于單菌.這可能是由于不同菌株之間拮抗作用所致.因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中只考察單菌DYC-1對(duì)芘的降解情況.

圖3 菌株DYC-1及菌群H的降解曲線Fig.3 Degradation curve of Rhodococcus sp. DYC-1and mixed culture H

2.5 菌株對(duì)不同底物的利用

考查菌株DYC-1對(duì)不同底物利用情況時(shí),因其對(duì)四環(huán)芳烴芘具有一定降解能力,故分別選定低環(huán)芳烴菲、芴,高環(huán)芳烴熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[a]蒽,苯系物苯酚作為底物,而鄰苯二甲酸、鄰苯二酚、水楊酸均為芘的中間代謝產(chǎn)物[10-12],因而也選定為底物.菌株對(duì)不同底物的利用情況見表3.可知,菌株DYC-1對(duì)鄰苯二甲酸、水楊酸、鄰苯二酚都可以降解,可能是由于它們是PAHs代謝中間產(chǎn)物,對(duì)菲、芴低環(huán)PAHs可以降解,對(duì)五環(huán)熒蒽也可以降解,但卻難以降解苯并[b]熒蒽和苯并[a]蒽.

表3 菌株DYC-1對(duì)不同底物的利用情況Table 3 The utilization of different substrates

2.6 不同NaCl濃度對(duì)降解菌生長(zhǎng)效果的影響

本研究實(shí)驗(yàn)樣品采自天津?yàn)I海濕地石油污染區(qū)土壤,濱海鹽土的特點(diǎn)是鹽分組成單一,以氯化物占絕對(duì)優(yōu)勢(shì);土壤表層含鹽量多為0.6%～1.0% 部分區(qū)域高達(dá)2%～3%,除南方濱海地區(qū)“咸酸田”呈強(qiáng)酸性反應(yīng)外,一般pH值為8.0-8.5.天津?yàn)I海新區(qū)濱海鹽土(0～30cm)土壤含鹽量大于0.6%的土壤面積占總面積的43.9%[13].因此改變LB培養(yǎng)基的鹽度,測(cè)試所篩選出的降解菌DYC-1耐鹽特性.結(jié)果表明,芘降解菌DYC-1在0%～10%的鹽度范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng),鹽度升高至15%時(shí),因OD600數(shù)值低于0.02,認(rèn)定為不能生長(zhǎng),鹽度耐受范圍相對(duì)較寬.

紅球菌DYC-1具有較強(qiáng)的耐鹽特性,證明它在高鹽條件下能夠保持酶活,可為其在高鹽條件下去除環(huán)境中PAHs提供基礎(chǔ)生境條件.

表4 菌株DYC-1耐鹽特性Table 4 The salt resistance of Rhodococcus sp. DYC-1

2.7 不同鹽度條件下菌株DYC-1對(duì)芘的降解效果

圖4 不同鹽度條件下菌株對(duì)芘的降解Fig.4 The degradation of pyrene in the condition of different salinity

研究表明,菌株對(duì)鹽分有一定的適應(yīng)范圍,尤其是生長(zhǎng)在鹽堿土壤中的土著菌[14]. Kushner[15]認(rèn)為中度嗜鹽菌其生長(zhǎng)最適NaCl濃度約為3%～15%,韓言柱等[16]分離出一株降解菲的中度嗜鹽菌,其在pH中性條件下對(duì)菲的降解耐鹽性達(dá)到15%.有學(xué)者發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽度超過(guò)3%時(shí),非嗜鹽微生物因其代謝受到一定程度的抑制,使得生物修復(fù)效率明顯降低,甚至喪失修復(fù)能力[17].而菌株DYC-1在5%鹽度條件下仍表現(xiàn)出不錯(cuò)的降解能力,從而證明菌株DYC-1是一株能高效降解芘的耐鹽菌.而當(dāng)鹽度達(dá)到15%時(shí),菌株雖能降解芘,但降解能力非常微弱.總體來(lái)說(shuō),菌株DYC-1具有較好的耐鹽性,這可能與其土壤來(lái)源有關(guān),土壤取自天津?yàn)I海濕地,屬于鹽漬化土地,對(duì)天津?yàn)I海鹽堿土壤14個(gè)樣點(diǎn)的土壤鹽分測(cè)定結(jié)果顯示,土壤含鹽量分布在0.049% ～1.85%之間.

2.8 不同初始濃度對(duì)芘降解效果的影響

圖5 不同初始濃度菌株芘的降解Fig.5 The degradation of pyrene in the condition of different initial concentration

如果菌株能夠降解高濃度的污染物,則說(shuō)明該菌株具有很強(qiáng)的生物降解能力[18].本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5,10,20,50,80,100,150mg/L共7種濃度的液相好氧降解體系,如圖5所示,芘的初始濃度在5,10, 20mg/L時(shí),30d后總降解率雖相差不多,但降解速率卻在明顯增加,芘濃度為20mg/L時(shí)降解率可達(dá)到最高38.42%,說(shuō)明在5～20mg/L的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),并未出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象,即芘作為唯一碳源和能源還不能完全滿足微生物新陳代謝的需要.而當(dāng)芘的初始濃度達(dá)到50mg/L時(shí),降解率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大,但并沒有隨著芘濃度的增大而升高,這可能是由于菌株DYC-1是在10℃、鹽度為2%、芘的濃度為20mg/L的條件下篩選出來(lái)的,低溫高鹽的條件本就不適于微生物的生長(zhǎng),當(dāng)芘的濃度升高至50mg/L,微生物降解PAHs的能力受到一定程度的限制.如果繼續(xù)增大芘的初始濃度,降解率則幾乎不增長(zhǎng),隨著芘濃度的升高,降解率增更慢,這時(shí)的降解率與空白對(duì)照(不加微生物的芘無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基)相差不大,因此降解率多是由于芘的自然揮發(fā)所致,則芘的初始濃度高于100mg/L時(shí),微生物無(wú)法對(duì)芘的降解發(fā)揮作用,可能是由于過(guò)高濃度的芘對(duì)菌株DYC-1產(chǎn)生毒害作用.由于低溫耐鹽等嚴(yán)苛的篩選條件及實(shí)驗(yàn)條件,本研究選定的芘濃度低于馬姍姍[18]選定的80mg/L,定為20mg/L.

2.9 不同pH值對(duì)降解效果的影響

研究表明,細(xì)菌對(duì)PAHs降解的最適pH值為中性[14,19]. pH值變化對(duì)微生物降解PAHs的影響非常復(fù)雜,可以通過(guò)影響降解酶的活性還可通過(guò)影響氧化還原電位來(lái)影響降解率.另外微生物的新陳代謝活動(dòng)與環(huán)境介質(zhì)的pH值密切相關(guān),在不同的pH值條件下,微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用及吸附作用、胞外酶的產(chǎn)生及分泌等均不相同.在其他條件相同的情況下,將無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的初始pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,分別接入紅球菌DYC-1,10℃,110r/min振蕩培養(yǎng)15d后測(cè)定剩余PAHs含量,計(jì)算降解率,結(jié)果如圖6所示.

圖6 不同pH值條件下菌株對(duì)芘的降解Fig.6 The degradation of pyrene in the condition of different pH

從圖6可以看出,菌株DYC-1在pH值為7～9的范圍內(nèi)降解PAHs的能力較強(qiáng),當(dāng)pH值小于7或者大于9降解能力都明顯減弱,這可能是由于每種微生物都有其生長(zhǎng)的最適pH值,pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響微生物酶的分泌及活性,從而抑制微生物對(duì)PAHs的降解.因此中性或弱堿性條件下最有利于菌株DYC-1發(fā)揮對(duì)芘的降解作用,本研究中選取pH值為8.

2.10 不同轉(zhuǎn)速對(duì)降解效果的影響

由圖7所示,隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高,15d后菌株DYC-1對(duì)PAHs的降解率逐漸增高.但從80r/min升高至110r/min時(shí),降解率顯著增加,而從110r/min升高至200r/min的過(guò)程中降解率變化不大,這可能是由于溶解氧對(duì)于微生物降解污染物的促進(jìn)作用是有一定范圍的,當(dāng)超過(guò)了這個(gè)范圍,即使供氧量繼續(xù)增加,對(duì)降解率的促進(jìn)作用也是有限的,因此本研究將搖床轉(zhuǎn)速控制為110r/min,既能促進(jìn)菌株對(duì)PAHs的降解,又節(jié)省了能源.

圖7 轉(zhuǎn)速不同對(duì)菌株降解芘的影響Fig.7 The degradation of pyrene in the condition of different oxygen gas content

2.11 不同接種量對(duì)降解效果的影響

接種量的大小對(duì)縮短菌株在新環(huán)境中延滯期有一定作用,降解菌的生物量是影響污染物生物降解效率的重要因素之一[17,20].將菌懸液以不用的接種量接入到含芘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,15d后測(cè)定芘的降解速率(10℃,110r/min),考察初始不同接種量對(duì)菌株DYC-1降解芘的影響,結(jié)果見圖8.總的來(lái)說(shuō),接種量與芘的降解率呈正相關(guān):接種量在0.5%～5%之間,芘的降解率隨著接種量的增加而增大,但隨著接種量的進(jìn)一步增加,降解率維持在32%左右,變化相差不大.由此可見,生物量的增加與降解率的提高并非呈線性關(guān)系,超出一定范圍后,接種量的增加反而不利于菌體的新陳代謝及分泌表面活性劑[21].因此本研究選取5%的接種量.

芘作為一種穩(wěn)定的四環(huán)高分子量PAHs,在室溫低鹽條件下仍然不易降解.段燕青等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了米曲霉以芘為單基質(zhì)代謝時(shí),降解率為33%;一些學(xué)者對(duì)菌株的選擇更地域化,Patel等[23]驗(yàn)證了海洋微藻集胞藻對(duì)芘的降解率可達(dá)36%,陸泗進(jìn)等[24]在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定芽孢桿菌B6和假單孢菌B17對(duì)芘的降解效果,發(fā)現(xiàn)降解率為24.45%和18.77%.而本研究中,在相對(duì)低溫高鹽的環(huán)境下,紅球菌DYC-1降解高濃度芘仍可達(dá)35%以上的降解率.

圖8 不同接種量對(duì)菌株降解芘的影響Fig.8 The degradation of pyrene in the condition of different capacity of bacteria

后續(xù)將在改變降解溫度或提供并改善共代謝降解環(huán)境方面進(jìn)一步探索,還可對(duì)芘的降解途徑、產(chǎn)物及芘污染土壤的實(shí)際修復(fù)效果方面深入開展研究,以期為石油烴污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)提供優(yōu)勢(shì)菌株和理論支持.

3 結(jié)論

3.1 采用定時(shí)定量轉(zhuǎn)接、間歇式逐步提高PAHs濃度的方法,從天津?yàn)I海濕地石油污染土壤中獲得能以PAHs芘為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌株DYC-1,經(jīng)生理生化和16S rDNA分析鑒定為紅球菌(Rhodococcus sp. DYC-1).

3.2 紅球菌DYC-1與菌群H降解能力相似,可能是各菌株之間的拮抗作用導(dǎo)致或者紅球菌DYC-1是該菌群中的優(yōu)勢(shì)菌株.

3.3 紅球菌DYC-1具有較好的耐鹽能力,在10%鹽度條件下仍可以生長(zhǎng),同時(shí)在5%鹽度條件下仍可到達(dá)20%的芘降解率.

3.4 紅球菌DYC-1具有較廣的降解底物譜,可以降解低環(huán)PAHs菲、芴,可以降解代謝中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸、水楊酸、鄰苯二酚,還可降解五環(huán)PAHs熒蒽,具有廣泛的降解潛力.

3.5 通過(guò)單因素?fù)u瓶實(shí)驗(yàn),得到了菌株DYC-1的最優(yōu)降解條件:菌株在低溫10℃,鹽度為2%的條件下,在pH值為8,初始濃度為20mg/L,搖床轉(zhuǎn)速為110r/min,接菌量為5%時(shí),能達(dá)到35%以上的降解率.

[1] Hua F, Wang H. Uptake modes of octadecane by Pseudomonas, sp. DG 17and synthesis of biosurfactant [J]. Journal of Applied Microbiology, 2012,112(1):25—37.

[2] Mackay D, Shiu W Y, Ma K C. Illustrated handbook of physical-chemical properties and environmental fate for organic chemicals. Volume 5: pesticide chemicals.[M]// Illustrated handbook of physical-chemical properties and environmental fate for organic chemicals /. Lewis Publishers, 1992:551-552.

[3] 張 旭,李廣賀,黃 巍.包氣帶土層中石油污染物生物降解的溫度效應(yīng) [J]. 環(huán)境科學(xué), 2001,22(4):108-110.

[4] 溫桂照,陳 敏.高效優(yōu)勢(shì)混合菌降解廢水中的氯代芳香族化合物 [J]. 上海環(huán)境科學(xué), 2000,(8):379-381.

[5] Whyte L G, Greer C W, Inniss W E. Assessment of the biodegradation potential of psychrotrophic microorganisms. [J]. Canadian Journal of Microbiology, 1996,42(2):99-106.

[6] Deppe U, RichnowH H, Michaelis W, et al. Degradation of crude oil by an arctic microbial consortium[J]. Extremophiles, 2005, 9(6):461-70.

[7] 宋立超,李培軍,劉 宛,等.鹽堿土壤PAHs降解菌的篩選鑒定及其降解特性 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2011,38(2):282-287.

[8] 張巧巧.芘降解菌株SE12的分離和鑒定及其降解效果研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[9] 布瑞德.伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè) [M]. 8版.中國(guó):科學(xué)出版社(譯), 1984.

[10] 鐘 鳴,張佳慶,吳小霞,等.芘高效降解菌的分離鑒定及其降解特性 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2010,21:1334-1338.

[11] 鞏宗強(qiáng),李培軍,王 新,等.芘在土壤中的共代謝降解研究 [J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2001,(3):447-450.

[12] 周 樂,盛下放.芘降解菌株的篩選及降解條件的研究 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2006,25(6):1504-1507.

[13] 溫 靜.天津?yàn)I海新區(qū)鹽堿地景觀生態(tài)化設(shè)計(jì)研究 [D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[14] 王震宇,趙 建,李鋒民,等.鹽漬化土壤中土著菌的石油烴降解潛力研究 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2009,(7):1416-1421.

[15] D J Kushner. Life in high salt and solute concentrations: halophilic bacteria [J]. Microbial life in extreme environments, 1978:317-368.

[16] 韓言柱,王立成,許學(xué)工,等.黃河三角洲土壤(潮土)石油類含量對(duì)小麥的影響研究 [J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2000,(4):1-4.

[17] 馬 靜.多環(huán)芳烴降解菌的篩選、降解機(jī)理及降解性能研究[D]. 大連:大連理工大學(xué), 2013:144.

[18] 馬姍姍.一株芘高效降解菌的選育及降解特性、固定化研究[D]. 鎮(zhèn)江:江蘇科技大學(xué), 2010,52.

[19] 姚治華,王紅旗,劉敬奇,等.石油污染土壤中苯降解菌的篩選及降解特性研究 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2006,(6):1498-1503.

[20] 楊 樂.石油降解菌群的構(gòu)建及其生物修復(fù)研究 [D]. 石河子:石河子大學(xué), 2008:77.

[21] 謝丹平,尹 華,彭 輝.石油降解菌株的分離及其降解特性研究 [J]. 上海環(huán)境科學(xué), 2003,(12):951-954.

[22] 段燕青,岳秀萍,白凡玉,等.耐受重金屬的芘降解真菌的篩選及芘降解動(dòng)力學(xué)研究 [J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2015,9(2):977-982.

[23] Patel J G, Kumar J I N, Kumar R N, et al. Enhancement of pyrene degradation efficacy of Synechocystis sp. by construction of an artificial microalgal-bacterial consortium[J]. Cogent Chemistry, 2015,1(1).

[24] 陸泗進(jìn),何立環(huán),孫 聰.兩株高效芘降解菌對(duì)土壤中芘的降解研究 [J]. 環(huán)境科學(xué)與管理, 2013,38(5):47-51.

Isolation, identification and analysis of degradation ability of a cold-resistant haloduric pyrene-degrading strains.

DIAO Shuo, WANG Hong-qi*, XU Jie, ZHAO Yi-cun
(College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China). China Environmental Science, 2017,37(2)：667～685

The community H and single-strain DYC-1 was isolated by timing quantitative culture and domestication method of adding the concentration of PAHs gradatimfromTianjin coastal wetland petroleumcontaminated soil under the lowtemperature condition. The community H and single-strain DYC-1used pyrene as solo carbon source for growth. The bacteria were identified as Rhodococcus sp. based on the BLAST sequence analysis of 16s rDNA and its morphological and physio-biochemcial characteristics. Analysis results showed that the degrading ability of single-strain DYC-1 was similar to community H under the lowtemperature condition. The degradation rate of themwas above 35% at high concentrations of pyrene. The single-strain DYC-1 had more salt-resisting ability and wide substrate degradation ability. The optimal degradation conditions of single-strain DYC-1 was 2% salinity, pH8, 10℃, 110r/min rotate speed and 5% capacity of bacteria. The degradation rate of pyrene was high with 20mg/L initial concentration in the optimal degradation conditions.

cold-resistant；haloduric；pyrene；degradation；bioremediation

X172

A

1000-6923(2016)02-0677-09

刁 碩(1992-),女,山東荷澤人,北京師范大學(xué)碩士研究生,從事污染土壤修復(fù)與治理研究.

2016-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41372232);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)重大課題(2013AA 06A205);中國(guó)博士后科學(xué)基金第54批面上資助項(xiàng)目

* 責(zé)任作者, 教授, whongqi310@sohu.com