李冬月，李祥龍，林樟楠，劉宏娟，張建安

（1清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084；2昆明理工大學(xué)國土資源工程學(xué)院，云南 昆明 650093）

共生菌系TSH06連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇

李冬月1，2，李祥龍2，林樟楠1，劉宏娟1，張建安1

（1清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084；2昆明理工大學(xué)國土資源工程學(xué)院，云南 昆明 650093）

傳統(tǒng)的產(chǎn)丁醇生產(chǎn)菌均為嚴(yán)格厭氧，本實(shí)驗(yàn)室分離出一株兼性厭氧共生菌系TSH06，可在微氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁醇。本文研究了共生菌系TSH06微氧條件下的丁醇連續(xù)發(fā)酵，考察了稀釋率對TSH06細(xì)胞生長及丁醇合成的影響。結(jié)果表明，低稀釋率有利于丁醇的生成，高稀釋率有利于酸的積累，丁醇濃度隨著稀釋率的增大而減小，而生產(chǎn)強(qiáng)度隨稀釋率的增大而增大。當(dāng)稀釋率大于0.2h–1時(shí)，生產(chǎn)強(qiáng)度呈下降趨勢。最優(yōu)化的稀釋率為0.2h–1，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)1.06g/(L·h)。研究結(jié)果可為微氧條件下丁醇連續(xù)發(fā)酵的進(jìn)一步優(yōu)化提供理論依據(jù)。

丁醇；微氧發(fā)酵；連續(xù)發(fā)酵；稀釋率；生產(chǎn)強(qiáng)度

近年來，隨著石油資源的日漸枯竭和環(huán)境問題的持續(xù)加劇，新能源的研究越來越受到重視，生物質(zhì)能源作為可持續(xù)發(fā)展的可再生能源，已成為研究和關(guān)注的重點(diǎn)[1-2]。丁醇是優(yōu)良的有機(jī)溶劑和重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、塑料、油漆、有機(jī)合成等行業(yè)[3-5]。作為生物能源與傳統(tǒng)的生物乙醇相比，丁醇具有和汽油相當(dāng)?shù)臒嶂岛托镣橹?、較低的管道腐蝕性和揮發(fā)性，能與汽油以任意比混合、蒸汽壓低和安全性高等優(yōu)良特性[6-8]。因此生物丁醇被認(rèn)為是一種非常具有研究潛力的新型生物質(zhì)能源。傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵通常采用批次發(fā)酵，由于產(chǎn)物抑制，往往存在終產(chǎn)物濃度低、生產(chǎn)強(qiáng)度低等問題，嚴(yán)重制約了生物丁醇的生產(chǎn)。連續(xù)發(fā)酵方式與其他發(fā)酵方式相比縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了設(shè)備利用率和生產(chǎn)強(qiáng)度，便于自動(dòng)化控制。目前我國的丙酮丁醇發(fā)酵工廠基本上采用的是連續(xù)發(fā)酵方式[9]。

稀釋率是連續(xù)發(fā)酵工藝過程的一個(gè)重要指標(biāo)，稀釋率越低，底物在發(fā)酵罐中停留的時(shí)間越長，能更長時(shí)間與菌體接觸，菌體細(xì)胞更容易生長，生產(chǎn)強(qiáng)度較低；稀釋率越高，底物與菌體接觸的時(shí)間越短，菌體細(xì)胞容易被洗出，生產(chǎn)強(qiáng)度會(huì)增大。ANDRADE等[10]利用Clostridium acetobutylicumATCC 824以葡萄糖和乳酸為底物，稀釋率為0.05h–1時(shí)，丁醇產(chǎn)量為8.6g/L，丁醇的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.42g/(L·h)。TASHIRO等[11]利用C. saccharoperbutylacetonicumN1-4以葡萄糖為底物，稀釋率為0.11h–1時(shí)，丁醇產(chǎn)量為6.51g/L，丁醇的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.72g/(L·h)，稀釋率從0.11h–1增大到0.20h–1，生產(chǎn)強(qiáng)度提高了72.2%，達(dá)到1.24g/(L·h)。ZHENG等[12]利用C. saccharoperbutylacetonicumN1-4以木糖為底物，稀釋率從0.14h–1提高到0.26h–1時(shí)，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度從0.235g/(L·h)提高到0.529g/(L·h)。

細(xì)胞固定化技術(shù)能夠提高細(xì)胞密度，增強(qiáng)發(fā)酵穩(wěn)定性和提高溶劑耐受性，提高丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度[13]。CHANG等[14]采用甘蔗渣作為固定化材料，利用C. acetobutyliumABE 1201以玉米秸稈汁為底物進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，稀釋率為0.16h–1時(shí)，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.2g/(L·h)。當(dāng)采用甜高粱甘蔗渣作為固定化載體，以葡萄糖為底物進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，稀釋率為0.08h–1時(shí)，乙醇-丙酮-丁醇（ABE）產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別為16.5g/L和1.32g/(L·h)[15]。SURVASE等[16]采用木漿纖維素固定床反應(yīng)器，利用C. acetobutylicumDSM 792以葡萄糖為底物，稀釋率為0.22h–1時(shí)，丁醇的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.79g/(L·h)。

由于目前報(bào)道的丁醇生產(chǎn)菌均為嚴(yán)格厭氧，因此，現(xiàn)有的連續(xù)發(fā)酵操作均在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)室分離到一株共生菌系TSH06，由厭氧梭菌C. acetobutylicumTSH1和兼性厭氧桿菌B. cereusTSH1組成?？梢栽谖⒀鯒l件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，無需嚴(yán)格厭氧，簡化了實(shí)驗(yàn)操作，節(jié)約了厭氧設(shè)備的投入。

本文以共生菌系TSH06為出發(fā)菌株，采用葡萄糖為底物進(jìn)行單級連續(xù)發(fā)酵，考察了稀釋率對細(xì)胞生長及丁醇合成的影響。其研究結(jié)果有助于深入了解共生菌丁醇代謝機(jī)制，并對微氧條件下進(jìn)一步的丁醇連續(xù)發(fā)酵工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

共生菌系TSH06為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

LB培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉10，酵母浸粉1.0，蛋白胨10，121℃滅菌15 min。

玉米培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的玉米糊，121℃滅菌15min。

RCM培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉3.0，牛肉膏10，蛋白胨10，葡萄糖5.0，可溶性淀粉1.0，氯化鈉5.0，醋酸鈉3.0，半胱氨酸鹽酸鹽0.5，瓊脂2.0，pH 8.5。

P2半合成培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖60，酵母浸粉1.0，115℃滅菌15 min。

緩沖液組分（g/L）：K2HPO450，K2HPO450，CH3COONH4220，過濾滅菌。

微量元素液組分（g/L）：MgSO4·7H2O 20，MnSO4·H2O 1.0，NaCl 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0，對甲基苯甲酸 0.1，維生素 0.1，生物素 0.0001，過濾滅菌。

在發(fā)酵接種前，以1%的比例將緩沖液和微量元素液加入到P2半合成培養(yǎng)基中[17]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

菌種活化：將甘油管保藏的TSH06接入到15mL 6%的玉米培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)24～36h。

種子培養(yǎng)：將充分活化的菌種以體積比7%的接種量接種到60mL P2培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h。

批式發(fā)酵：2L發(fā)酵罐，P2培養(yǎng)基裝液量為1L，接種量為7%，37℃靜置發(fā)酵。

連續(xù)發(fā)酵：2L發(fā)酵罐（BIOTECH，上海）裝液量為1L。發(fā)酵罐中丁醇濃度為6～8 g/L時(shí)開始連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵體積維持在1L左右?？疾煜♂屄剩―）對連續(xù)發(fā)酵的影響，溫度37℃，轉(zhuǎn)速為50r/min。

1.3 分析方法

菌體濃度：用UV 759S紫外可見分光光度計(jì)在600 nm處測定其吸光值OD600。

葡萄糖濃度：使用SBA-40D生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）測定。

發(fā)酵產(chǎn)物測定：乙醇、丙酮、丁醇（ABE）組分濃度采用氣相色譜（GC）進(jìn)行定量測定，以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物，色譜柱為KB-5MS，25m×0.53m×1.00μm，檢測器為FID，進(jìn)樣溫度240℃，檢測溫度為260℃，柱溫80℃。載氣為氮?dú)猓魉贋?.5mL/L，進(jìn)樣量為1μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和進(jìn)樣量計(jì)算發(fā)酵液中溶劑濃度[18]。

乙酸、丁酸和葡萄糖濃度采用高效液相色譜（島津公司LC-20A）測定。色譜柱型號為AminexHPX-87柱（Bio-Red美國），柱溫65℃，流動(dòng)相0.005 mol/L H2SO4，流速為0.8mL/min，檢測器型號為RID-10A，進(jìn)樣量為30uL。

2 結(jié)果與討論

2.1 共生菌株TSH06生理代謝特性

首先研究了共生菌系TSH06生理代謝特性。分別比較了微氧和厭氧條件下，B. cereusTSH1、C. acetobutylicumTSH1、TSH06（B. cereusTSH1+C. acetobutylicumTSH1）在P2培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基的細(xì)胞生長和丁醇合成情況。結(jié)果如表1和表2所示。由表1可知：共生菌系TSH06不僅在厭氧條件下生長，也可以在微氧條件下生長，C. acetobutylicumTSH1只能在嚴(yán)格厭氧條件下生長。

進(jìn)而考查了共生菌株TSH06丁醇合成性能。分別比較了TSH1、B. cereusTSH1、TSH06微氧條件下合成丁醇的性能，初始糖濃度為22g/L，37℃靜置發(fā)酵36h。其中C. acetobutylicumTSH1在厭氧條件下培養(yǎng)作為對照。結(jié)果如表2所示。由表2可知，在微氧條件下，B. cereusTSH1幾乎不能合成丁醇，而TSH06在微氧條件下可以合成丁醇。發(fā)酵36h，丁醇濃度達(dá)到5.15g/L，這與C. acetobutylicumTSH1在厭氧條件下的丁醇發(fā)酵水平相當(dāng)。TSH06丁醇得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別為0.22 g/g和0.14 g/(L·h)，這與也C. acetobutylicumTSH1在厭氧條件下的丁醇發(fā)酵參數(shù)接近。

通過對菌株的生理特性和發(fā)酵特性對比可知，在相同發(fā)酵條件下，共生菌系TSH06可在厭氧和微氧條件下生長并發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，C. acetobutylicumTSH1只能在嚴(yán)格厭氧條件下生長并合成丁醇。微氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁醇無需厭氧操作，簡化了實(shí)驗(yàn)操作，也節(jié)省了厭氧設(shè)備的投入。

2.2 共生菌TSH06批式發(fā)酵特性

TSH06不僅可以在厭氧條件下生長，也可以在微氧條件下生長，這不同于傳統(tǒng)的嚴(yán)格厭氧發(fā)酵[19-20]。在2L發(fā)酵罐中考察了微氧條件下TSH06細(xì)胞生長及丁醇合成情況，初始糖濃度為60.3g/L，結(jié)果如圖1所示。

表1 共生菌株系TSH06的生理特性

表2 微氧條件下共生菌系TSH06的發(fā)酵特性

圖1 共生菌TSH06批式發(fā)酵生產(chǎn)丁醇

由圖1中可知，在微氧條件下，TSH06細(xì)胞可以正常生長并合成丁醇。隨著葡萄糖的不斷消耗，在12h時(shí)開始產(chǎn)生有機(jī)酸，同時(shí)菌體濃度逐漸上升，溶液的pH逐漸下降，此時(shí)主要代謝產(chǎn)物為乙酸和丁酸。發(fā)酵20h后，進(jìn)入產(chǎn)溶劑期，溶劑乙醇、丙酮、丁醇產(chǎn)量迅速增加。OD600在44h達(dá)到其最大值為7.98，發(fā)酵結(jié)束后乙酸和丁酸的濃度分別為1.21g/L和2.24g/L，ABE溶劑的濃度達(dá)到19.5g/L，其中，丙酮4.21g/L、乙醇2.13g/L、丁醇13.0g/L，丁醇得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到0.22g/g和0.19g/(L·h)。

2.3 不同稀釋率對連續(xù)發(fā)酵的影響

在連續(xù)發(fā)酵過程中，稀釋率是影響連續(xù)發(fā)酵工藝過程的重要參數(shù)，稀釋率越低，底物在發(fā)酵罐中停留的時(shí)間越多，能更長時(shí)間與菌體接觸，丁醇濃度更高，但生產(chǎn)強(qiáng)度較低；稀釋率越高，底物與菌體接觸的時(shí)間越短，丁醇的濃度將下降，但丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度越高[21]。本文采用單級連續(xù)發(fā)酵，考察了3個(gè)不同稀釋率0.05h–1、0.2h–1、0.25h–1下連續(xù)發(fā)酵過程中的細(xì)胞生長、底物消耗和產(chǎn)物合成情況，結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 不同稀釋率對TSH06細(xì)胞生長、底物消耗及發(fā)酵pH的影響

圖3 不同稀釋率對TSH06產(chǎn)物合成的影響

初糖濃度為60g/L，初始pH為5.98，當(dāng)稀釋率為0.05h–1時(shí)，溶劑產(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別為14.5g/L和 9.0g/L，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度為0.45g/(L·h)，是批式發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度的2.37倍。隨著稀釋率的增大，菌體濃度變化不大，丁醇濃度下降，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度增大。稀釋率為0.2h–1時(shí)，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.06g/(L·h)，ABE總?cè)軇┖投〈紳舛确謩e為10.2g/L和5.3g/L，是批式發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度的5.58倍，與0.05h–1相比，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度提高了135.6%。當(dāng)稀釋率增大到0.25h–1時(shí)，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.9g/(L·h)，ABE總?cè)軇┖投〈紳舛确謩e為5.8g/L和3.6g/L，是批式發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度的4.74倍，與0.05h–1相比，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度提高了100%。

在3個(gè)不同稀釋率（0.05h–1、0.2h–1、0.25h–1）下，菌體濃度、pH沒有出現(xiàn)明顯變化。OD600平均值分別為5.5、5.8和6.0，pH始終維持在4.0～5.0之間。在稀釋率為0.2h–1時(shí)，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最大，為1.06g/(L·h)。

目前已經(jīng)報(bào)道的丁醇連續(xù)發(fā)酵均嚴(yán)格厭氧，ZHENG等[12]在稀釋率為0.14h–1時(shí)，丁醇產(chǎn)量為1.68g/L，丁醇的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.235g/(L·h)。TASHIRO等[10]在稀釋率為0.20h–1時(shí)，丁醇產(chǎn)量為6.21g/L，丁醇的生產(chǎn)強(qiáng)度為1.24g/(L·h)。本實(shí)驗(yàn)涉及的共生菌TSH06在微氧條件下丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度與文獻(xiàn)報(bào)道相當(dāng)。而在微氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁醇無需厭氧操作，節(jié)省了厭氧設(shè)備的投入，簡化了實(shí)驗(yàn)操作。

3 結(jié)論

本文研究了共生菌TSH06微氧條件下連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的特性。共生菌TSH06不同于傳統(tǒng)的嚴(yán)格厭氧菌，可以在微氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁醇。微氧批式發(fā)酵丁醇濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到13.04g/L和0.19g/(L·h)?？疾炝讼♂屄蕦SH06丁醇合成的影響。稀釋率為0.20h–1時(shí)，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度為達(dá)到最大1.06g/(L·h)，是批式發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度的5.58倍，與稀釋率0.05h–1時(shí)發(fā)酵參數(shù)相比較，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度提高了47.2%。共生菌TSH06微氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁醇無需厭氧操作，節(jié)省了厭氧設(shè)備的投入，簡化了實(shí)驗(yàn)操作。

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The continuous butanol fermentation of symbiotic system TSH06

LI Dongyue1，2，LI Xianglong2，LIN Zhangnan1，LIU Hongjuan1，ZHANG Jian’an1
（1Institute of Nuclear and New Energy Technology，Tsinghua University，Beijing 100084，China；2Faculty of Land Resources Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650093，Yunnan，China）

The traditional butanol producing strain was strict anaerobic bacteria. A facultative anaerobic symbiotic system TSH06 was isolated in our lab，which could produce butanol under micro-aerobic conditions. This work studied the continuous butanol fermentation of TSH06 under the micro-aerobic condition. The effect of dilution rate on the cell growth and butanol production was investigeted. The test results indicated that the lower dilution rate enhanced the butanol production and the higher dilution rate was beneficial for the acid accumulation. However，the butanol productivity decreased when the dilution rate was higher than 0.2h–1. The optimized dilution rate was 0.2h–1with the butanol productivity of 1.06 g/(L·h). The results provided the theoretical basis for the further optimization of butanol continuous fermentation under micro-aerobic conditions.

butanol；micro-aerobic fermentation；continuous fermentation；dilution rate；productivity

Q815

A

1000–6613（2017）04–1418–06

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.04.035

2016-09-21；修改稿日期：2016-10-20。

工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（清華大學(xué)）開放基金（2015301）及工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （清華大學(xué)） 開放基金（2015302）項(xiàng)目。

李冬月（1989—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：張建安，副研究員。E-mail：zhangja@tsinghua.edu.cn。劉宏娟，副研究員。E-mail：liuhongjuan@tsinghua.edu.cn。