孟敏君

[摘要]目的觀察胰島素對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Erk信號通路的影響及其對MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。方法分別采用0、50、100和200nM不同劑量的胰島素處理MCF7細(xì)胞0、24、48和72h，采用Western blot方法檢測MCF-7細(xì)胞中Erk信號通路的磷酸化活化情況，采用MTT方法檢測MCF-7細(xì)胞的增殖情況。通過傷口愈合實驗和Boyden小室檢測200nM胰島素處理72h對MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。采用Erk信號通路抑制劑預(yù)處理MCF-7細(xì)胞，觀察Erk信號通路在胰島素促MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力中的作用。結(jié)果同0nM胰島素處理組相比，不同劑量的胰島素均可顯著上調(diào)Erk的磷酸化水平，加強MCF-7細(xì)胞的增殖能力（P<0.05），且這種作用具有計量依賴性。同對照組相比，200nM胰島素處理72h后，MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著增強（f=188.000、95.640，P<0.05）。采用Erk信號通路阻斷劑U0126阻斷MCF-7細(xì)胞中的Erk信號通路后，胰島素促MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力顯著降低（P<0.05）。結(jié)論胰島素可通過激活MCF-7細(xì)胞中的Erk信號通路，增強腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

[關(guān)鍵詞]胰島素；乳腺癌；MCF-7；增殖；遷移

[中圖分類號]R737.9

[文獻標(biāo)識碼]B

[文章編號]2095-0616（2016）23-33-06

胰島素可與胰島素樣生長因子-1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）和胰島素受體（insulin receptor，IR）及向下游傳遞活化信號，進而促進細(xì)胞的有絲分裂，胰島素的這一作用促使研究者們猜想其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展是密不可分的。研究結(jié)果證實，高胰島素血癥、2型糖尿病以及肥胖等代謝相關(guān)性疾病可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)病風(fēng)險顯著升高。目前女性乳腺癌的發(fā)病率已成為女性惡性腫瘤中發(fā)病率最高的一種，而胰島素作為一種生長因子，其在女性乳腺癌發(fā)病中的作用也得到相關(guān)文獻的證實。而目前關(guān)于胰島素參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究仍需要更深層次地探索。據(jù)此，本研究期待通過觀察胰島素對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Erk信號通路活化情況的影響及其對MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，初步探討胰島素參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制。結(jié)果如下。

1.材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑

首先由取中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供的人乳腺癌細(xì)胞株MCF7，然后采用DMEM培養(yǎng)基（含胎牛血清，濃度為10%）對其進行培養(yǎng)。一抗為鼠抗人p-Erk抗體，由深圳晶美生物科技有限公司提供；羊抗兔和羊抗鼠IgG（由辣根過氧化物酶標(biāo)記）均購自Bio-Rad公司；Erk信號通路抑制劑、蛋白酶、CytoBuster蛋白、磷酸酶抑制劑購自Thermo公司；Boyden小室（用作侵襲實驗）購自美國Millipore公司。

1.2研究方法

1.2.1細(xì)胞處理方法分別采用不同濃度的胰島素對受試細(xì)胞分別處理0、24、48和72h，其中胰島素濃度分別為0、50、100和200nM。

1.2.2細(xì)胞總蛋白提取首先利用冰PBS對待檢細(xì)胞連續(xù)兩次洗滌，然后實施離心分離處理，離心加速度和時間分別設(shè)置為400×g、5min；處理完成后在沉淀中依次加入蛋白酶、磷酸酶抑制劑，然后加入CytoBuster蛋白，劑量為100uL，將所得實際混合均勻后于25℃條件下孵育處理15min；再次行離心分離處理，離心加速度和時間分別設(shè)置為12000×g、15min，溫度為4°C。取上清液對蛋白濃度進行檢測，另取部分上清液分裝15uL，保存于-80℃恒溫冰箱中。

1.2.3蛋白濃度測定首先采用BCA法測定：對標(biāo)準(zhǔn)品進行稀釋處理，并按照50：1的體積比混合完成工作液的配置，在96孔板中分別加入200uL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，并加入25uL待測樣品或者標(biāo)準(zhǔn)品，每個待測標(biāo)本均需要設(shè)置3個復(fù)孔。在37°C的條件下完成時長為30min的孵育處理，測定OD值后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所得結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并據(jù)此推算出待測樣品的水平。采用Western blot測定：將提取的蛋白經(jīng)SDS-PAGE（濃度為8%-10%）和濃縮膠（濃度為5%）進行分離處理，待樣品半干后需要將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，并加入BSA（濃度為5%）進行時長為2h的封閉孵育，加入一抗后在4℃條件下孵育，時長為12h。次日采用TBST（濃度為0.1%）的溶液對膜片反復(fù)3次沖洗，每次沖洗時長均為5min。在待測樣品中添加相應(yīng)標(biāo)記二二抗，25℃條件下進行時長為1h的封閉孵育。完成后采用TBST（濃度為0.1%）的溶液沖洗膜片，并利用深圳晶美生物科技有限公司提供的敏感化學(xué)發(fā)光底物處理條帶，以便顯色。內(nèi)參為Actin，判讀結(jié)果。

1.2.4細(xì)胞增殖能力檢測利用MTT方法：首先需要將處于良好的對數(shù)生長期的細(xì)胞接種，并分別采用不同濃度的胰島素滴入接種板孔中，孵育不同時間。完成操作后均加入MTT溶液20uL，等待4h，將上清液徹底吸出后加入DMSO溶液15020uL，低速震蕩處理，時長為10min，測定OD值（490nm波長位置）。

1.2.5遷移和侵襲強度檢測采用傷口愈合實驗方法：參照文獻操作。將待檢細(xì)胞首先采用臺盼藍染色計數(shù)處理，然后實施重懸干預(yù)，取1×105個細(xì)胞于Boyden小室的上層，添加培養(yǎng)基直至整個體系為300uL，取500uL胎牛血清培養(yǎng)基（濃度為10%）于Boyden小室下層，上層和下層樣品均孵育12h，利用棉拭子將未出現(xiàn)侵襲的細(xì)胞除去，取結(jié)晶紫（濃度為0.1%）對下層細(xì)胞實施固定染色處理，計算侵襲強度。最后，向含有待檢樣品的培養(yǎng)基中加入Erk信號通路阻斷劑，劑量為U0126 10umol/L，觀察并評估阻斷情況。

1.3觀察指標(biāo)

觀察Western blot法測定不同濃度和時間下胰島素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響，包括0、24、48和72h時0、50、100和200nM濃度下胰島素間A值變化；觀察MMT法測得不同濃度和時間下胰島素對MCF-7增殖指數(shù)的影響；對比胰島素對MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力中的作用；比較不同處理方式下A值、細(xì)胞增殖指數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、切口寬度百分比數(shù)據(jù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSSl6.0軟件，計量資料以（x±s）描述量形式的數(shù)據(jù)，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1Western blot法測定不同濃度和時間下胰島素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響

每兩個時刻和每兩個濃度間A值比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中A值隨著時間的延長和濃度的增高均不斷增加，見表1～3、圖1。

2.2MMT法測得不同濃度和時間下胰島素對MCF-7增殖指數(shù)的影響

每兩個時刻和每兩個濃度間細(xì)胞MCF-7增殖指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），隨著時間的延長和濃度的增加，細(xì)胞增殖指數(shù)水平均不斷升高，見表4、圖2。

2.3胰島素對McF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力中的作用

對照組與胰島素組72h后轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均較0h明顯增多（P<0.05），且72h胰島素組轉(zhuǎn)移和侵襲細(xì)胞數(shù)均較對照組顯著增多（P<0.05），見表5、圖3。

2.4不同處理方式TA值、細(xì)胞增殖指數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、切口寬度百分比比較

對照組、胰島素組、胰島素+U0126組A值、細(xì)胞增殖指數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、切口寬度百分比兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表6、圖4。

3.討論

乳腺癌在全世界范圍內(nèi)的發(fā)生率均呈現(xiàn)出大幅增長的態(tài)勢，盡管我國的發(fā)病率較低，但是增長

態(tài)勢相對來說也比較明顯。據(jù)相關(guān)資料顯示，女性乳腺癌發(fā)病率在我國范圍內(nèi)已經(jīng)躍居女性癌癥的第1位。可知該病形勢嚴(yán)峻，已經(jīng)成為當(dāng)前重大的公共衛(wèi)生問題。但是此類病例的病因病機尚未完全清楚。近年來相關(guān)研究通過對乳腺癌病例進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)其中存在明顯的規(guī)律性，也基本明確了該病的高危因素。近年來的研究結(jié)果顯示，胰島素可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，提示胰島素可能也會作為一種致病因素參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

胰島素作為一種多功能的蛋白質(zhì)激素，除外可調(diào)節(jié)人體代謝，還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂促進細(xì)胞生長。本研究發(fā)現(xiàn)以0、50、100和200nM的胰島素及200nM的胰島素處理MCF7細(xì)胞O、24.48和72h，MCF7細(xì)胞的增殖能力明顯增強（P<0.05），與之前報道的胰島素通過有絲分裂促進細(xì)胞生長相一致。此外，本研究還證實，以200nM的胰島素處理MCF-7細(xì)胞72h，MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著升高（P<0.05）。據(jù)此，上訴研究結(jié)果提示，胰島素可對乳腺癌病例腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移均起到巨大的推動作用，進而增加機體乳腺癌發(fā)生和惡化的風(fēng)險。

胰島素促細(xì)胞生長機制方面，Zhang等認(rèn)為，胰島素可通過激活P13K信號通路，從而刺激肝星狀細(xì)胞增殖。此外還有研究認(rèn)為胰島素可對胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF）受體的表達產(chǎn)生誘導(dǎo)，進而刺激軟骨細(xì)胞增殖。胰島素作為一種生長因子在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用已日益得到肯定。而關(guān)于胰島素在乳腺癌發(fā)生和惡化過程中的機制尚未完全清楚。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular-sigual regulated kinase 1/2，ERKl/2）是機體必不可少的物質(zhì)，屬于MAPK家族成員，一旦生長因子、激素與神經(jīng)遞質(zhì)受體結(jié)合可以激活該物質(zhì)的磷酸化，促使活化的因子進入細(xì)胞核，進而參與細(xì)胞的增殖和分化。另有資料顯示，采用Erk信號通路抑制劑U0126預(yù)處理MCF-7細(xì)胞后，再以200nM的胰島素處理MCF-7細(xì)胞72h，癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力則被顯著抑制（P<0.01），提示胰島素不僅參與乳腺癌的發(fā)生，同時還可增強其增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移強度，導(dǎo)致其預(yù)后更為惡化。

本研究結(jié)果中，每兩個時刻和每兩個濃度間A值比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中A值隨著時間的延長和濃度的增高均不斷增加，說明不同隨著時間的延長和胰島素濃度的升高，MCF-7細(xì)胞中Erk信號通路則被顯著阻斷；每兩個時刻和每兩個濃度間細(xì)胞MCF-7增殖指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），隨著時間的延長和濃度的增加，細(xì)胞增殖指數(shù)水平均不斷升高，且對照組與胰島素組72h后轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均較0h明顯增多（P<0.05），且72h胰島素組轉(zhuǎn)移和侵襲細(xì)胞數(shù)均較對照組顯著增多（P<0.05），則說明經(jīng)過Erk信號通路抑制劑U0126預(yù)處理MCF-7細(xì)胞后，乳腺癌惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移強度則被顯著抑制；最后對照組、胰島素組、胰島素+U0126組A值、細(xì)胞增殖指數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、切口寬度百分比兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），證實胰島素不僅在乳腺癌的發(fā)展中有重要作用，也能顯著增強其轉(zhuǎn)移和侵襲能力，而加用Erk信號通路抑制劑U0126后可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲作用，與上述研究結(jié)論相符合。

綜上所述，胰島素可激活MCF-7細(xì)胞中的Erk信號通路，提升其增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移強度。然而是否還存在其他的信號通路參與調(diào)控胰島素的促MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力還有待進一步的深入研究。