汪祺 戴忠 張玉杰++馬雙成

[摘要]以膽紅素代謝過(guò)程中UGT1A1酶介導(dǎo)的膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合環(huán)節(jié)為切入點(diǎn)，通過(guò)考察待測(cè)物大黃素對(duì)該酶的抑制作用預(yù)測(cè)其肝毒性。以膽紅素為UGT1A1酶底物，于人肝微粒體、大鼠肝微粒體及人重組UGT1A1酶中加入不同濃度膽紅素及大黃素，分別以膽紅素的總代謝產(chǎn)物生成量對(duì)膽紅素底物濃度作圖，以米氏方程雙倒數(shù)法繪圖，并以不同曲線的斜率對(duì)應(yīng)膽紅素底物濃度繪制slop圖計(jì)算表觀抑制常數(shù)Ki，考察其對(duì)膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合的抑制作用，預(yù)測(cè)其肝毒性有無(wú)及大小。結(jié)果顯示大黃素在3個(gè)體系中對(duì)UGT1A1酶均有中強(qiáng)抑制作用，且抑制類型均為競(jìng)爭(zhēng)型抑制。HLM，RLM，rUGT1A1體系的Ki分別為（5400±0956），（10020±0611），（4850±0528），P均<005。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，大黃素對(duì)于UGT1A1酶的抑制在大鼠及人之間無(wú)明顯種屬差異。大黃素可通過(guò)抑制UGT1A1酶活性導(dǎo)致膽紅素代謝異常，從而存在引發(fā)肝毒性的潛在危險(xiǎn)。該試驗(yàn)所建立的體外研究方法為中藥肝毒性藥物的篩選提供了新思路和新方法，對(duì)中藥安全性評(píng)價(jià)具有借鑒意義。

[關(guān)鍵詞]大黃素； 肝毒性； 代謝酶； 肝微粒體； 表觀抑制常數(shù)

Hepatotoxicity of emodin based on UGT1A1 enzymemediated

bilirubin in liver microsomes

WANG Qi1， DAI Zhong1， ZHANG Yujie2*， MA Shuangcheng1*

（1 National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China；

2 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract]To study the hepatotoxicity of emodin based on bilirubin metabolism mediated by glucuronidation of UGT1A1 enzyme In this study， three different incubation systems were established by using RLM， HLM， and rUGT1A1， with bilirubin as the substrate Different concentrations of bilirubin and emodin were added in the incubation systems The double reciprocal Michaelis equation was drawn based on the total amount of bilirubin glucuronidation The apparent inhibition constant Ki was then calculated with the slope curve to predict the hepatotoxicity The results indicated that emodin had a significant inhibition to the UGT1A1 enzyme in all of the three systems， with Ki=5400±0956（P<005） in HLM system， Ki =10020±0611（P<005） in RLM system， Ki=4850±0528（P<005） in rUGT1A1 system Meanwhile， emodin had no significant difference between rat and human in terms of inhibition of UGT1A1 enzyme Emodin had a potential risk of the hepatotoxicity by inhibiting the UGT1A1 enzyme activity And the method established in this study provides a new thought and new method to evaluate hepatotoxicity and safety of traditional Chinese medicines

[Key words]emodin； hepatotoxicity； metabolic enzyme； human liver microsome； apparent inhibition constant

doi：10.4268/cjcmm20162321

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine 5′diphosphate glucuronosyltransferases， UGTs）是人體中最重要的二相代謝酶，能催化具有羥基、巰基、胺基、羧基和稀醇基團(tuán)的脂溶性藥物或內(nèi)源性物質(zhì)與尿苷5′二磷酸葡萄糖酸酸的結(jié)合，使其水溶性增加，從而隨尿與膽汁排出，防止內(nèi)源和外源性物質(zhì)在體內(nèi)蓄積產(chǎn)生毒性[1]。UGT1A1是人體UGTs家族中非常重要的一員，能代謝內(nèi)源性物質(zhì)膽紅素和炔雌醇等[26]。膽紅素是人體內(nèi)一種非常重要的內(nèi)源性物質(zhì)，是臨床上判定黃疸的重要依據(jù)，也是肝功能的重要指標(biāo)和肝損害的重要生物標(biāo)志物。膽紅素在體內(nèi)主要由UGT1A1酶轉(zhuǎn)化為水溶性膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合物BMG1，BMG2，BDG，從肝細(xì)胞分泌至膽汁中消除[78]。若UGT1A1酶受到外源性藥物抑制，UCB無(wú)法轉(zhuǎn)化為BG或轉(zhuǎn)化減少，膽紅素代謝則出現(xiàn)障礙，繼而導(dǎo)致UCB在肝細(xì)胞和血液內(nèi)蓄積，引發(fā)毒性。因此考察藥物對(duì)UGT1A1介導(dǎo)的膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合的影響將有助于預(yù)測(cè)該藥物對(duì)肝臟是否具有毒性及毒性大小。

近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道[913]中藥及其制劑導(dǎo)致的肝損傷病例逐年增加，如何首烏及其制劑，患者往往出現(xiàn)膽紅素水平顯著升高等癥狀[14]。大黃素在何首烏中含量較高，且其廣泛存在于常用中藥材（如大黃，蘆薈，首烏藤，虎杖）中，因此本試驗(yàn)選取大黃素為待測(cè)藥物，在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上[1516]，以表觀抑制常數(shù)Ki為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同肝微粒體體系（人重組UGT1A1酶，人肝微粒體，大鼠肝微粒體）中大黃素對(duì)UGT1A1酶活性的影響，旨在排除由于單一酶系所處環(huán)境不同，及不同種屬間UGT1A1酶的差異，從而更加真實(shí)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)大黃素肝毒性大小。

1材料

Waters AcquityTM Ultra Performance LC超高效液相色譜儀（美國(guó)，Waters公司）；Waters XevoTMQTOFMS質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)，Waters公司）；METTLER TOLEDO AE240型電子天平（瑞士，梅特勒托利多公司）；節(jié)能型職能恒溫槽SDC6（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Thermo 17R型高速低溫離心機(jī)（日本，Thermo公司）。

人肝微粒體（HLM，50人混合），大鼠肝微粒體（RLM，雌雄混合），重組人UGT1A1酶（rUGT1A1）均購(gòu)自美國(guó)BD Gentest公司；磷酸鉀（純度≥98%）、氯化鎂（純度≥98%）、抗壞血酸（純度≥98%）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥98%）均購(gòu)自百靈威科技；葡萄糖二酸單內(nèi)酯（純度≥98%）、丙甲菌素（純度≥98%）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA，純度≥98%）、二甲基亞砜（DMSO，純度≥98%）均購(gòu)自Sigma Aldrich公司；膽紅素（批號(hào)100077201206，純度993%），大黃素（批號(hào)110756201512，純度987%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲酸、鹽酸均為分析純（北京化學(xué)試劑廠），乙腈、甲醇均為色譜純（Fisher公司）。

2方法與結(jié)果

21UPLC條件

Acquity UPLC HSS C18色譜柱（21 mm×100 mm， 18 μm）；Acquity UPLC HSS C18VanGuard Precolumn預(yù)柱（21 mm×5 mm， 18 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）01%甲酸溶液（B），梯度洗脫，0～21 min，40%～75%A，21～42 min，75%～95%A，42～80 min，95%A，80～85 min，95%～40%A，85～125 min，40%A，流速04 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；進(jìn)樣量10 μL。

22UDPGA發(fā)生系統(tǒng)的制備

精密稱取氯化鎂、葡糖二酸單內(nèi)酯、丙甲菌素、UDPGA適量，用TrisHCl緩沖液（稱取Tris 1211 g，加入去離子水800 mL，加濃鹽酸調(diào)pH至74，以去離子水定容至1 000 mL）使溶解，使含氯化鎂5 mmol·L-1，葡糖二酸單內(nèi)酯5 mmol·L-1，丙甲菌素25 mg·L-1，UDPGA5 mmol·L-1，即得UDPGA發(fā)生系統(tǒng)。

23溶液的制備

231對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取膽紅素、大黃素對(duì)照品適量，加DMSO溶解制成不同濃度系列溶液：膽紅素036～335 μmol·L-1，大黃素036～1165 μmol·L-1（HLM體系），036～1165 μmol·L-1（RLM體系），039～316 μmol·L-1（rUGT1A1體系）。

232樣品溶液的制備取凍存HLM（RLM，rUGT1A1）融化，使酶蛋白質(zhì)量濃度均為05 g·L-1，加入底物膽紅素溶液及大黃素溶液，置37 ℃恒溫水浴預(yù)孵育3 min后加入新鮮配制的UDPGA發(fā)生系統(tǒng)溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。反應(yīng)10 min（RLM體系為15 min）后立即加入600 μL冰乙腈甲醇（2∶1，含抗壞血酸濃度為200 μmol·L-1） 終止反應(yīng)，沉淀蛋白，渦旋1 min，13 000 r·min-1（r=5 cm）離心25 min，取上清液即得。體系終體積為200 μL，DMSO總用量不超過(guò)1%。結(jié)果見(jiàn)圖1。

24方法學(xué)考察

241日內(nèi)、日間精密度考察按232項(xiàng)制備樣品溶液，僅加入底物膽紅素，使含膽紅素濃度為05，5，50 μmol·L-1，按上述液相色譜條件測(cè)定膽紅素高、中、低3個(gè)濃度下底物膽紅素及代謝產(chǎn)物，每個(gè)濃度平行5份，日內(nèi)及日間（連續(xù)5 d）進(jìn)樣測(cè)定。RSD均小于50%，結(jié)果符合規(guī)定。

242回收率考察按232項(xiàng)制備樣品溶液，僅加入底物膽紅素，使含膽紅素濃度為05，5，50 μmol·L-1，按上述液相色譜條件測(cè)定膽紅素高、中、低3個(gè)濃度下回收率，每個(gè)濃度平行5份，回收率870%～115%，結(jié)果符合規(guī)定。

243標(biāo)準(zhǔn)曲線按232項(xiàng)制備樣品溶液，僅加入底物膽紅素，按上述液相條件測(cè)定膽紅素HLM體系中標(biāo)準(zhǔn)曲線。膽紅素線性范圍分別為：HLM體系中315×10-7～106×10-6 mol，Y=259×105X-3 3471（R2=0994），RLM體系中在565×10-7～892×10-6mol，Y=259×105X-2 3161（R2=0984），rUGT1A1體系中在389×10-7～164×10-6 mol，Y=259×105X-4 0121（R2=0996）。

25大黃素對(duì)UGT1A1酶活性的影響

按23所述方法，分別以膽紅素的總代謝產(chǎn)物生成量對(duì)膽紅素底物濃度作圖，以米氏方程雙倒數(shù)法作圖測(cè)定，橫坐標(biāo)為底物膽紅素濃度的倒數(shù)（1/c），縱坐標(biāo)為加入大黃素后膽紅素代謝反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）；加入不同濃度大黃素對(duì)應(yīng)不同曲線，以不同曲線的斜率對(duì)膽紅素底物濃度繪制slop圖，求得抑制常數(shù)Ki；大黃素在HLM，RLM，rUGT1A1中對(duì)UGT1A1酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，及對(duì)UGT1A1酶的抑制情況見(jiàn)圖2。

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS Statistics 170統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（OneWay ANOVA），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素在3個(gè)體系中，對(duì)UGT1A1酶均有中強(qiáng)抑制作用，且抑制類型均為競(jìng)爭(zhēng)型抑制。HLM，RLM，rUGT1A1體系的Ki分別為（5400±0956），（10020±0611）（4850±0528），P均<005。同時(shí)不同體系間進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)Ki無(wú)明顯差異。分析試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)體系中，大黃素對(duì)于UGT1A1酶的Ki無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明大黃素對(duì)于UGT1A1酶的抑制在大鼠及人之間無(wú)明顯種屬差異。大黃素可通過(guò)抑制UGT1A1酶活性導(dǎo)致膽紅素代謝異常，從而存在引發(fā)肝毒性的潛在危險(xiǎn)。

3討論

大黃素為蒽醌類成分，廣泛存在于廖科植物中，如大黃，何首烏，虎杖等，具有重要的藥理活性，廣泛的生物活性，在中成藥中的應(yīng)用較為普遍[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道[18]，大黃素在體內(nèi)的主要代謝途徑為UGT代謝，無(wú)論在哪種（小鼠、大鼠、豚鼠、狗、人）肝微粒體酶作用下，大黃素都會(huì)迅速代謝并生成葡萄糖醛酸結(jié)合物，Ⅱ相代謝反應(yīng)明顯快于I相代謝反應(yīng)

并占主導(dǎo)地位。因此本課題以Ⅱ相代謝體系為研究對(duì)象，以膽紅素代謝過(guò)程中UGT1A1介導(dǎo)的膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合環(huán)節(jié)為切入點(diǎn)，從代謝酶角度考察大黃素肝毒性，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素對(duì)于不同種屬下UGT1A1酶有較強(qiáng)抑制作用，且在人及大鼠間無(wú)明顯種屬差異，提示大黃素具有潛在致肝毒性風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)為中藥肝毒性藥物的篩選提供了新思路和新方法，對(duì)中藥安全性評(píng)價(jià)具有借鑒意義。

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[責(zé)任編輯曹陽(yáng)陽(yáng)]