邱麗珍++陳璐+李春曉+耿瀟+尤星宇

[摘要]內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，組織缺血缺氧所產(chǎn)生的信號(hào)分子可促使骨髓EPCs動(dòng)員至外周循環(huán)，并歸巢于損傷組織參與新生血管的形成。腦心通膠囊（Naoxintong capsule，NXT）具有活血化瘀、行氣止痛之功效，其多成分具有血管保護(hù)作用，可以有效改善組織缺血癥狀，但其對(duì)EPCs動(dòng)員和歸巢的作用尚不明確。該研究采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）聯(lián)合后下肢缺血損傷模型（unilateral hind limb ischemia，UHLI）研究腦心通膠囊對(duì)EPCs動(dòng)員和歸巢的作用。受體小鼠經(jīng)CS137全身照射后，從目?jī)?nèi)眥靜脈叢輸注GFP標(biāo)記的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，建立BMT模型，經(jīng)過(guò)4 周骨髓重建后取外周血檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例。取BMT模型成功的小鼠，采用股動(dòng)脈結(jié)扎復(fù)制UHLI模型，術(shù)后隨機(jī)分為3組：模型組、NXT組（模型+NXT）和陽(yáng)性對(duì)照組（模型+辛伐他?。?。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓重建4周后GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例，術(shù)前及術(shù)后第1，3，7，14 天外周血中EPCs細(xì)胞數(shù)；采用免疫熒光組織化學(xué)染色檢測(cè)給藥3，7 d缺血腓腸肌組織EPCs細(xì)胞歸巢數(shù)目。BMT小鼠與 GFP 基因鼠相比， GFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異；術(shù)后1，3 d，NXT組和辛伐他汀組外周血EPCs數(shù)量顯著性上調(diào)；術(shù)后 3，7 d，NXT組和辛伐他汀組EPCs歸巢數(shù)量顯著高于模型組（P<0001），因此腦心通膠囊能顯著促進(jìn)EPCs的動(dòng)員與歸巢。

[關(guān)鍵詞]腦心通膠囊； 骨髓移植； 后下肢缺血損傷模型； 內(nèi)皮祖細(xì)胞； 動(dòng)員； 歸巢

Effect of Naoxintong capsule on endothelial progenitor cell mobilization

and homing following bone marrow transplantation in a mouse

hind limb ischemia model

QIU Lizhen， CHEN Lu， LI Chunxiao， GENG Xiao， YOU Xingyu， ZHANG Lusha， WANG Hong*

（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin State Key Laboratory of Modern

Chinese Medicinethe Ministry of Education to Build National Key Experimental Cultivation

Base， Tianjin StateKey Laboratory of Chinese Pharmacology， Tianjin State Key Laboratory of

Prescription Medicine of Ministry of Education， Tianjin 300193， China）

[Abstract]Endothelial progenitor cells （EPCs） are precursor cells of endothelial cells Signal molecules produced by ischemia and hypoxia can promote mobilization of bone marrow EPCs to peripheral circulation and formation of novel blood vessels in tissues that are damaged during heart attack Naoxintong capsule （NXT） has the functions of promoting blood circulation， removing blood stasis， promoting the circulation of qi and relieving pain The various components in NXT have protective effects on blood vessels and can effectively improve the symptoms of ischemia However， its effect on EPCs is not clear To study the intervention effect of NXT on mobilization and homing of peripheral blood EPCs， green fluorescent protein （GFP） transgenic mice were used for bone marrow transplantation （BMT） and then unilateral hind limb ischemia model （UHLI） were constructed For BMT， wildtype ICR mice were irradiated by CS137 and then injected with 4×106 bone marrow cells isolated from GFP mice The bone marrow reconstitution of recipients was assessed by quantification of GFP bone marrowderived cells （BMDC） from transplanted mice 4 weeks after BMT The UHLI model was duplicated by ligating femoral artery and divided into three groups： the model group， the NXT group （model+NXT） and the positive control group （model+simvastatin） Flow cytometry was used to detect the proportion of GFP positive cells and the peripheral blood EPCs levels at 1， 3， 7， 14 days before and after surgery Ischemic tissue of gastrocnemius muscle was excised at 3 and 7 days after operation for immunofluorescence staining to detect the number of GFP+ cells The bone marrow chimerism was achieved at day 28 after BMT There was no significant difference in the percentage of GFP positive cells between BMT mice and GFP transgenic mice NXT and simvastatin could significantly increase the number of peripheral blood EPCs 1，3 days after surgery Three and seven days after operation， the number of homing EPCs was significantly higher in NXT group and positive control group than that in model group （P<0001） In conclusion， NXT can obviously promote the mobilization and homing of EPCs

[Key words]Naoxintong capsule； bone marrow transplantation； hind limb ischemia model； endothelial progenitor cells； mobilization； homing

doi：10.4268/cjcmm20162320

缺血性血管疾病是目前威脅人類(lèi)健康的重要疾病之一，其中下肢血管缺血性疾病以高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率成為僅次于缺血性腦卒中、冠心病之外危害人類(lèi)健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。由于損傷組織缺血缺氧，下肢缺血性疾病常表現(xiàn)為傷口愈合較慢、間歇性跛行，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)潰瘍和壞疽[2]，因此恢復(fù)缺血組織血流灌注，促進(jìn)血管新生成為亟待解決的問(wèn)題。其中內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管新生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。組織缺血缺氧所產(chǎn)生的信號(hào)分子可動(dòng)員骨髓EPCs至外周循環(huán)，并歸巢于損傷組織參與新生血管的形成[34]。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，下肢缺血性疾病具有“瘀血、缺血、血管狹窄或閉塞”等“血瘀證”特點(diǎn)[5]。腦心通膠囊（Naoxintong capsule，NXT）屬于復(fù)方中藥制劑，是結(jié)合“供血不足乃萬(wàn)病之源”中醫(yī)學(xué)理論與現(xiàn)代人的病理特點(diǎn)，挑選黃芪、丹參、水蛭、地龍等16味植物藥和蟲(chóng)類(lèi)藥精制而成。腦心通膠囊具有益氣活血，化瘀通脈等功效，可用于氣虛無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行而導(dǎo)致的血瘀證，現(xiàn)代臨床上廣泛應(yīng)用于心肌梗死和缺血性腦血管等缺血性疾病的預(yù)防和治療[6]，其多種成分具有血管保護(hù)作用，可以有效改善組織缺血癥狀，但其對(duì)EPCs的動(dòng)員和歸巢作用尚不明確。小鼠后下肢缺血損傷模型是研究缺血性疾病血管再生的經(jīng)典模型，與臨床上下肢動(dòng)脈疾病癥狀類(lèi)似。因此本實(shí)驗(yàn)采用小鼠單側(cè)后肢股動(dòng)脈缺血模型（unilateral hind limb ischemia，UHLI）聯(lián)合GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓移植（bone marrow transplant，BMT）模型，研究NXT對(duì)后肢缺血損傷小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員和歸巢的作用。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠能全身性穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，在本實(shí)驗(yàn)中用作骨髓源性EPCs的示蹤工具。

1材料

11動(dòng)物60只SPF級(jí)健康雄性ICR小鼠，12只SPF級(jí)GFP（ICR）基因鼠，雌雄各半，體重28～32 g，8周齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）20120001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于天津市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)放射工程研究所動(dòng)物房中分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%。

12藥物與試劑腦心通超微粉（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司）；辛伐他汀（Sim）（杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)L0233822）。avertin （美國(guó)Sigma公司）；流式抗體PEFlk1，APCCy7Sca1（Becton，Dickinson and Company，貨號(hào)分別為555308，560654）；09%氯化鈉注射液（山東科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)13151203062）；肝素鈉 （江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)5150211）；檸檬酸鈉粉末，檸檬酸粉末 （天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；5% BSA封閉液 （SW3015100），DAPI溶液（即用型）（C0065），PBS粉末（P1010，2 L/袋），PBS緩沖液 （P1020500），抗熒光淬滅封片劑 （S210025），4%多聚甲醛 （p1100500），紅細(xì)胞裂解液 （R1020500）均購(gòu)于北京Solarbio科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

13儀器體式顯微鏡LEICA S8APO（德國(guó)Leica）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Nikon倒置熒光顯微鏡（日本Nikon）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN，64R型）；生物組織包埋機(jī)BMJ1（上海珂淮儀器有限公司）；小動(dòng)物手術(shù)器械包 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；小動(dòng)物多功能麻醉機(jī) （美國(guó)VETEQUIP，COMPAC5）。

2方法

21骨髓移植模型的建立參考文獻(xiàn)方法建立骨髓移植模型[78]。

GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的提取與分離：頸椎脫臼法處死GFP轉(zhuǎn)基因供體小鼠，浸泡75%乙醇中消毒，超凈臺(tái)中無(wú)菌分離雙側(cè)股骨和脛骨，剪掉股骨和脛骨兩端。將處理過(guò)的股骨和脛骨浸泡在PBS緩沖溶液中，用PBS緩沖溶液反復(fù)沖洗骨髓腔，直到?jīng)_洗液澄清為止，通過(guò)70 μm細(xì)胞過(guò)濾器將骨髓細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至50 mL無(wú)菌離心管中。以小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞。移入另一無(wú)菌離心管中，加入3～5 倍的PBS緩沖溶液洗滌2次，以1 400 r·min-1離心5 min，制備骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。加入PBS緩沖溶液調(diào)整細(xì)胞濃度約為2×107個(gè)/mL，暫時(shí)放于冰盒備用。

野生型受體小鼠骨髓移植模型的建立：采用放射源CS137對(duì)野生型ICR小鼠全身照射，照射劑量為90 Gy，劑量率采用1 Gy·min-1。照射后2 h內(nèi)，用乙醚對(duì)小鼠行淺表麻醉，通過(guò)目?jī)?nèi)眥迅速注入200 μL供體鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液。經(jīng)過(guò)移植后小鼠在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)4周，進(jìn)行骨髓重建，期間飼料及墊料均經(jīng)高壓高溫消毒處理。

骨髓重建后外周血GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)：骨髓重建4 周后，取小鼠外周血制備流式細(xì)胞樣本，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算其比例。取ICR野生型小鼠（WT mice）作為陰性對(duì)照組，GFP基因鼠（GFP mice）作為陽(yáng)性對(duì)照組。檢測(cè)小鼠外周血中GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，據(jù)此判斷骨髓移植造模是否成功。

22單側(cè)后肢缺血損傷模型的建立根據(jù)文獻(xiàn)方法建立小鼠單側(cè)后肢缺血損傷模型[9]。以15 g·L-1 avertin（165 mL·kg-1）經(jīng)腹腔注射對(duì)小鼠行全身麻醉后備皮，取仰臥位固定。自右后肢腹股溝處橫向切口，鈍性分離肌肉，暴露起源于髂外動(dòng)脈，終止于隱靜脈和腘動(dòng)脈的股動(dòng)脈，以7/0號(hào)絲線(xiàn)結(jié)扎血管，離斷并剪掉股動(dòng)靜脈及其分支，縫合皮膚。采用激光多普勒掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠結(jié)扎并離斷股動(dòng)脈前后結(jié)扎部位的血流速度，術(shù)后血流速度降低到術(shù)前的10%以下，且血流的頻譜發(fā)生明顯的改變，以此作為后肢缺血模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)，然后將小鼠置于37 ℃電熱毯上直至蘇醒。

23實(shí)驗(yàn)分組與給藥將腦心通超微粉末加入生理鹽水中配成70 g· L-1溶液，分裝備用。辛伐他汀加入生理鹽水中配成1 g·L-1溶液，分裝備用。UHLI成功的54只小鼠，隨機(jī)分成3 組，每組18 只。本研究中依據(jù)體表面積計(jì)算法以及腦心通膠囊臨床應(yīng)用劑量換算成小鼠給藥劑量。腦心通膠囊臨床劑量為成人（口服）：一日3 次，一次2～4 粒，04 g/粒，以此確定本研究中小鼠腦心通組等效劑量為700 mg·kg-1·d-1。陽(yáng)性藥組（辛伐他?。﹦┝?0 mg·kg-1·d-1，模型組給予同體積生理鹽水。造模1 h后經(jīng)灌胃給藥，連續(xù)給藥3，7 d分別進(jìn)行取材。

24流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血EPCs動(dòng)員參考文獻(xiàn)方法[10]，分別于小鼠HLI術(shù)前、術(shù)后1，3，7，14 d，采集經(jīng)肝素鈉抗凝的外周血，分別加入5 μL的PEFlk1和25 μL的APCCy7Sca1，2種小鼠EPC表面標(biāo)記抗體或同型對(duì)照，4 ℃避光孵育30 min，加1 mL紅細(xì)胞裂解液，孵育2 min，加入適量緩沖液洗去未結(jié)合的抗體和紅細(xì)胞碎片，用FACS 流式細(xì)胞儀檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞懸液，每份標(biāo)本檢測(cè)10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，以GFP，F(xiàn)lk1，Sca1三陽(yáng)性細(xì)胞占單核細(xì)胞的比例表示外周血EPCs數(shù)量，用Cell Quest軟件分析并記錄外周血單個(gè)核細(xì)胞中GFP+/Flk1+/Sca1+三陽(yáng)性EPCs的比例。

25免疫熒光法檢測(cè)EPCs歸巢給藥3，7 d后，分別取小鼠缺血側(cè)腓腸肌，4%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)橫向切片。石蠟組織切片，脫水脫蠟后行DAPI染色，DAPI非特異性與細(xì)胞核結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。Nikon倒置熒光顯微鏡下拍照觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分布和數(shù)量，以綠色熒光蛋白數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)EPCs歸巢數(shù)量。熒光計(jì)數(shù)：每張切片隨機(jī)取5個(gè)不同視野，非肌肉橫切面視野排除在外，以PS軟件（Photo Shop 5）計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)GFP數(shù)量或毛細(xì)血管數(shù)量，EPCs歸巢以EPCs數(shù)/HPF （× 200）表示。

26統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 160統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用LSDt法檢驗(yàn)，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31骨髓移植小鼠后下肢缺血損傷模型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第0 周對(duì)小鼠進(jìn)行骨髓移植術(shù)，術(shù)后將受體鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境下，進(jìn)行4 周的骨髓造血重建。骨髓重建4 周后，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行GFP骨髓嵌合率的檢測(cè)。對(duì)骨髓移植成功的小鼠繼續(xù)構(gòu)建單側(cè)后下肢缺血損傷模型，術(shù)后第1，3，7，14 天采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中EPCs的數(shù)量，術(shù)前、術(shù)后3，7 d對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉后取材，獲取損傷側(cè)腓腸肌，放于4%多聚甲醛中固定，進(jìn)行石蠟包埋切片，以便用于后期EPCs歸巢的檢測(cè)（圖1）。

32小鼠骨髓移植后造血重建4周后外周血GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)GFP小鼠的GFP表達(dá)，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，曝光時(shí)間為1 s，IPP軟件定量分析熒光面積。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠能全身性穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，裸露于毛發(fā)之外的皮膚在小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)下可見(jiàn)綠色熒光，骨髓移植小鼠與GFP小鼠GFP的熒光表達(dá)無(wú)顯著差異，初步證明骨髓移植模型建立成功（圖2 A）。

用Cell Quest軟件建立獲取模板FSC/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖，設(shè)P1門(mén)選定外周血中除細(xì)胞碎片外的所有細(xì)胞為目的細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，其中單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為單個(gè)核細(xì)胞，黑色信號(hào)為細(xì)胞碎片。再用該軟件建立分析模板SSC/GFP熒光雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)代表GFP熒光強(qiáng)度，分析外周血中GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例。P2門(mén)內(nèi)為外周血中GFP陽(yáng)性細(xì)胞，是綠色信號(hào)（中性粒細(xì)胞）和藍(lán)色信號(hào)（單個(gè)核細(xì)胞）總和，紅色信號(hào)為GFP陰性細(xì)胞。骨髓移植后第28天，結(jié)果顯示 BMT小鼠（BMT mice）GFP 陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到（9029±60）%，GFP基因鼠的GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例達(dá)到（9111±672）%，而野生型小鼠未檢測(cè)到GFP陽(yáng)

A BMT 和GFP小鼠活體成像照片；B BMT 和GFP小鼠外周血GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例流式細(xì)胞分析圖，獲取圖中P1門(mén)內(nèi)為外周血中所有細(xì)胞，黑色信號(hào)為細(xì)胞碎片，分析圖中P2門(mén)內(nèi)為外周血中GFP陽(yáng)性細(xì)胞，是綠色信號(hào)（中性粒細(xì)胞）和藍(lán)色信號(hào)（單個(gè)核細(xì)胞）的總和，紅色信號(hào)為GFP陰性細(xì)胞；C 對(duì)B的熒光強(qiáng)度定量分析。

性細(xì)胞?？傻贸鲈诠撬柚亟ǖ?8天小鼠外周血GFP嵌合率與正常GFP基因鼠相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。據(jù)此可以確認(rèn)本研究成功建立了GFP骨髓移植的動(dòng)物模型（圖2 B，C）。

33腦心通對(duì)BMT小鼠HLI后外周血EPCs動(dòng)員作用本研究運(yùn)用的是成功建立的 GFP骨髓移植模型小鼠，EPCs為同時(shí)表達(dá)GFP，F(xiàn)lk1，Sca1的三陽(yáng)性細(xì)胞。術(shù)后1，3 d，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組外周血中EPCs數(shù)量均上調(diào)，隨時(shí)間延長(zhǎng)術(shù)后7 d EPCs含量逐漸降低，術(shù)后14 d幾乎均降低到術(shù)前EPCs的水平。術(shù)后1 d，與模型組（073±021）相比，腦心通組（123±021）和辛伐他汀組（103±014）GFP+/ Sca1+/ Flk1+三陽(yáng)性細(xì)胞含量顯著性上調(diào)（P< 001）。術(shù)后3 d，腦心通組（129±021）和辛伐他汀組（087±017）EPCs含量比模型組（069±012）同樣顯著性上調(diào)（P<001，P<005），可知腦心通對(duì)EPCs動(dòng)員的上調(diào)作用在術(shù)后1 d更顯著，腦心通組上調(diào)作用比辛伐他汀組更顯著（圖3）。

34腦心通對(duì)EPCs在BMT小鼠缺血腓腸肌的歸巢數(shù)目的影響倒置顯微鏡下可見(jiàn)均勻分布的中間散布著GFP綠色熒光，尤其腦心通組和辛伐他汀組熒光表達(dá)更強(qiáng)、數(shù)量更多；結(jié)合取材時(shí)，對(duì)缺血側(cè)腓腸肌形態(tài)和色澤觀察比較，可知腦心通組和辛伐他汀組損傷修復(fù)較好。術(shù)后3 d腦心通組（14550±550）和辛伐他汀組（15133±1451）GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比模型組（3917±564）明顯增多（P<0001），并且GFP陽(yáng)性細(xì)胞分布更均勻（圖4）。術(shù)后7 d腦心通組（11325±743）和辛伐他汀組（11450±1184）GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比模型組（3900±542）明顯增多（P<0001），并且GFP陽(yáng)性細(xì)胞分布更均勻（圖5）。

4討論

EPCs是一類(lèi)循環(huán)存在于骨髓和外周血中可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。Asahara等[11]在1997年首次用免疫磁珠法從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離出來(lái)一種CD34+和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2+ ） 雙陽(yáng)性的單核細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)進(jìn)一步證實(shí)其能特異性表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞抗原，故命名為EPCs。近代研究發(fā)現(xiàn)，EPCs不僅參與胚胎早期血管形成，還是與成年個(gè)體中血管新生密切相連的一類(lèi)成熟干細(xì)胞，主要定位于骨髓中，在內(nèi)源性組織缺血、生長(zhǎng)因子和藥物的刺激下，能夠被動(dòng)員出骨髓，進(jìn)入外周血循環(huán)，進(jìn)而遷移、歸巢到損傷組織處，并增殖、分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與損傷組織修復(fù)，起到促進(jìn)血管新生、修復(fù)受損血管、維持損傷血管修復(fù)動(dòng)態(tài)平衡等作用[1214]。目前研究表明，骨髓、臍血和外周血三者含量之比約為15∶10∶1，在骨髓和外周血中EPCs的比例也只有001%，機(jī)體內(nèi)EPCs數(shù)目有限[15]，機(jī)體這種自我修復(fù)作用十分有限。因此，尋找副作用小的、能增加骨髓中EPCs數(shù)量并且促進(jìn)其向血液循環(huán)中動(dòng)員的藥物具有重要意義。

缺血性疾病屬中醫(yī)血瘀證范疇，《素問(wèn)·瘺論》云：心主一身之血脈。心氣虛則無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行，致瘀血阻滯心腦之絡(luò)，引起中風(fēng)、胸痹等諸多病理變化；下肢動(dòng)脈疾病具有“瘀血、缺血、瘀斑、腫脹、粥樣斑塊、血栓形成、血管狹窄或閉塞”等“血瘀證”特點(diǎn)，能引起肢體血液循環(huán)障礙和微循環(huán)障礙，甚至發(fā)生潰瘍或壞疽[16]。在中醫(yī)學(xué)“異病同治、同證同治”的治療原則指導(dǎo)下，心腦血管缺血性疾病、下肢缺血性疾病雖然病位不同，但均具有“血瘀證”共同特點(diǎn)。腦心通膠囊是在“補(bǔ)陽(yáng)還五湯”的基礎(chǔ)上加上蟲(chóng)類(lèi)藥將植物類(lèi)藥物和蟲(chóng)類(lèi)藥巧妙合用，具有益氣活血，化瘀通脈等功效，具有改善心腦血管功能，增加血流量，改善微循環(huán)，改善血液流變學(xué)，降低血黏度，抑制血小板聚集，改變血液的高凝狀態(tài)，增加纖溶活性，抑制血栓形成等作用，緩解心腦缺血癥狀，改善心腦功能[1718]。腦心通膠囊可有效改善和恢復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的功能，從而改善內(nèi)皮舒張功能，改善血管收縮功能，顯著減輕缺血引起的心肌細(xì)胞變性和壞死[19]?；钛觯謴?fù)缺血區(qū)域供血，維持血管形態(tài)，促進(jìn)血管新生是治療缺血性疾病的關(guān)鍵因素。組織缺血缺氧所產(chǎn)生的信號(hào)分子可動(dòng)員骨髓EPCs至外周循環(huán)，并歸巢于損傷內(nèi)皮參與新生血管的形成[20]。腦心通膠囊對(duì)EPCs動(dòng)員和歸巢的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

作為他汀類(lèi)藥物辛伐他汀廣泛應(yīng)用于高脂血癥的治療，同時(shí)大量研究表明辛伐他汀可以通過(guò)調(diào)節(jié)血脂、抑制血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定粥樣斑塊、改善血管內(nèi)皮功能、能通過(guò)激活A(yù)kt/eNOS 途徑改善急性期心功能等作用，降低患者發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，顯著改善預(yù)后，在心血管疾病的防治中具有重要臨床價(jià)值[2124]。腦心通膠囊是在經(jīng)方補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上結(jié)合大量臨床實(shí)踐創(chuàng)制的復(fù)方中藥，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的一、二級(jí)預(yù)防，是治療缺血性疾病藥物的大品種，與辛伐他汀有相似的臨床應(yīng)用。研究證實(shí)，辛伐他汀能促進(jìn)EPCs的動(dòng)員、增殖、遷移及分化，增加外周循環(huán)中EPCs數(shù)量，有利于EPCs歸巢到缺血損傷部位參與新血管形成[2526]。因此本實(shí)驗(yàn)選用辛伐他汀作為觀察EPCs動(dòng)員的陽(yáng)性對(duì)照藥。

小鼠后下肢缺血模型是研究缺血性疾病血管再生和EPCs功能的經(jīng)典模型。與結(jié)扎冠狀動(dòng)脈所引起的組織缺血模型相比較，結(jié)扎股動(dòng)脈所引起的缺血模型不僅具有操作簡(jiǎn)單、死亡率低的優(yōu)點(diǎn)，而且具備既有明顯缺血性組織損傷，又有血管和實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生修復(fù)條件的特征。因此本研究采用骨髓移植聯(lián)合后下肢缺血損傷小鼠模型，觀察腦心通膠囊對(duì)EPCs動(dòng)員和歸巢的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明腦心通膠囊可以增加HLI術(shù)后1，3 d外周血中EPCs數(shù)量，證實(shí)腦心通膠囊可以促進(jìn)EPCs動(dòng)員。近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)單味藥如黃芪、葛根素、丹參素等對(duì)于EPCs具有動(dòng)員作用，都可通過(guò)增加EPCs數(shù)量并伴隨其功能的改善，促進(jìn)局部血管新生，改善缺血組織供血[27]。黃芪作為腦心通膠囊的君藥其有效成分有可能是發(fā)揮該作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究采用GFP蛋白示蹤方法發(fā)現(xiàn)腦心通膠囊可以增加HLI術(shù)后3，7 d EPCs在BMT小鼠缺血腓腸肌的數(shù)目，進(jìn)一步證實(shí)了其促進(jìn)EPCs歸巢的作用。EPCs歸巢于缺血組織主要通過(guò)以下3個(gè)方面參與新生血管的形成：可直接參與血管形成，修復(fù)損傷血管[28]；可分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生；可分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1等多種細(xì)胞因子，募集成熟內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)其增殖，共同參與血管修復(fù)及新生血管形成[29]。提示腦心通膠囊可通過(guò)增強(qiáng)EPCs功能促進(jìn)缺血組織損傷修復(fù)。

綜上所述，本研究采用骨髓移植后HLI模型，證實(shí)NXT可以通過(guò)促進(jìn)EPCs的動(dòng)員與歸巢，發(fā)揮促缺血組織損傷修復(fù)作用，為其作為活血化瘀復(fù)方中藥用于臨床治療缺血性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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