林彥萍++張美萍++王康宇++孫春玉++王義

[摘要]人參為五加科多年生草本植物，馳名中外的名貴藥材，人參的主要活性成分為人參皂苷，大體上可以分為3種：齊墩果烷型、原人參二醇（PPD）和原人參三醇（PPT）。人參皂苷具有抗血栓、抗疲勞、抗衰老、控制腫瘤、增強免疫力等諸多作用。關(guān)于人參皂苷的研究已深入到藥理、藥效和生物合成等各個方面，并有很大的提升，該研究對近年來發(fā)表的關(guān)于人參皂苷生物合成的相關(guān)文章進(jìn)行總結(jié)與綜述，為人參皂苷的研究提供一定的指導(dǎo)和參考。

[關(guān)鍵詞]人參； 人參皂苷； 生物合成

Research achievements on ginsenosides biosynthesis from Panax ginseng

LIN Yanping， ZHANG Meiping， WANG Kangyu， SUN Chunyu， WANG Yi*

（College of Life Science， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

[Abstract]Panax ginseng is one of the famous rare medicinal herbs， and ginsenosides are the main active ingredient of ginseng is ginsenosideThey can be divided into three chemotypes： oleanane type， protopanaxadiol （PPD） type and the protopanaxatriol （PPT）type Ginsenosides possess antithrombotic， antifatigue， antiaging， cancer control， strengthening the immune system and many other effects Rrogress has remarkably been made in pharmacology， efficacy and blosynthesis of ginsenosidesThis review covers the recent research achievements of ginsenasides， which would be helpful for the relevant researchers to get useful information

[Key words]Panax ginseng； ginsenosides； biosynthesis

doi：10.4268/cjcmm20162302

人參為五加科Panax ginseng CA Meyer植物家族中最有價值的藥用植物之一，利用人參的歷史始于4 500年前，其首次紀(jì)錄是在2 000年前。目前分布在世界各地的35個國家，亞洲國家是其中要分部區(qū)，如中國，韓國等[1]。人參可應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品，食品，膳食補充劑，保健品和藥品等，人參的質(zhì)量鑒定是以亞洲人參的國際質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作為標(biāo)準(zhǔn)，并于2009年成立了相應(yīng)的食品法典委員會[2]。在亞洲國家中，中國作為人參的主產(chǎn)國，有著豐富的人參資源，吉林省人參產(chǎn)量占據(jù)了中國人參產(chǎn)量的絕大部分，約為85%以上，占據(jù)世界人參產(chǎn)量的70%左右。從而使人參成為人參藥物化學(xué)，遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究，許多其他藥用植物的模式種[3]。

隨著人參人工栽培規(guī)模的不斷擴大，生產(chǎn)管理技術(shù)不到位，農(nóng)藥使用不合理等情況，致使人參生長期病蟲害發(fā)生普遍，已嚴(yán)重的影響到了人參的產(chǎn)量和品質(zhì)。為了解決這些難題，需要采用調(diào)整栽培技術(shù)等一系列措施以改善植物生長環(huán)境條件，創(chuàng)造不適于有害生物生存繁衍的條件，以減少或防治病蟲害的發(fā)生。同時應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥或生物防治來防治病蟲害。通過努力近年來，在人參栽培技術(shù)，病害防治方面也都取得了一些成果[4]，但這些還不能全面改良人參的產(chǎn)量和品質(zhì)，還要對其有效成分進(jìn)行質(zhì)量的控制，以提高人參的藥用價值及商業(yè)價值。

人參有效成分中人參皂苷是含量最高的之一，人參皂苷用作藥物的傳統(tǒng)已經(jīng)超過2 000年[57]。人參皂苷的生物合成發(fā)生在人參大部分的組織器官中，包括根，莖，葉和果，迄今為止，150多個天然人參皂苷已從人參屬植物中分離，包括Ro， Rb1， Rb2， Rb3， Rc， Rd， Re， Rf， Rg1， Rg2， Rg3， Rh1等，基于它們的糖苷配基的骨架可分成2組，即達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型。達(dá)瑪烷型皂苷根據(jù)苷元可分為3個類型：20S原人參二醇（PPD），20S原人參三醇（PPT）和擬人參皂苷[8]。人參皂苷具有抗血栓、抗疲勞、抗衰老、鎮(zhèn)痛、抑制中樞神經(jīng)、增強記憶力、改善心腦缺血、阻止腫瘤血管新生、控制腫瘤移動、增強免疫力等作用[9]。

人參中其他有效成分的研究也日趨增多，人參多糖的研究，可以追溯到20世紀(jì)60年代中期，最初的研究表明，人參根中含有 78%～100%堿溶性多糖和 387%的水溶性多糖。大量資料顯示[10]，人參多糖具有良好的生理和藥理活性，主要有抗補體活性，降血糖，免疫調(diào)節(jié)活性、抗腫瘤、保護(hù)細(xì)胞活性等作用。此外，人參中還有一些其他的活性成分，例如低聚糖，多肽，氨基酸和脂溶性成分，研究表明[11]，人參中含有氨基酸的種類達(dá) 17種以上，含量最高的是精氨酸，谷氨酸、天門氨酸和脯氨酸次之，含量最低的是脯氨酸和蛋氨酸。脂溶性成分為棕色粘稠狀液體，包括脂肪油類和有機酸、聚乙炔醇化合物、甾醇類、揮發(fā)油等。

1人參皂苷生物合成研究進(jìn)展

盡管人參皂苷藥理學(xué)研究已經(jīng)非常成熟，其合成酶及合成的機制在很大程度上仍然有待探索，目前有很多關(guān)于人參皂苷的生物合成及生產(chǎn)等方面的研究。

通常，三萜皂苷的形成是由1個線性C30分子角鯊烯開始，角鯊烯是由頭對頭的2個法尼基二磷酸（FPP）分子組成，并且每個FPP是從二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）與異戊烯二磷酸（IPP）衍生而來[12]。角鯊烯形成可通過環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶（OSC）家族的達(dá)瑪烷烯合成酶轉(zhuǎn)化成（S）2，3環(huán)氧角鯊烯[13]，隨后進(jìn)行環(huán)化[14]。最終人參皂苷是通過氧化（例如，通過細(xì)胞色素P450依賴性單加氧酶介導(dǎo)的）[1517]和糖基化形成的[1820]，但這些步驟仍有待鑒定。

三萜皂苷的生物合成主要是利用前體IPP通過細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（MVA）途徑和質(zhì)體中的甲基赤磷酸（MEP）途徑。MVA途徑可能是所有組織器官中代謝通路的祖先，真核生物中從MVA到IPP合成都是一些保守的酶，除了在部分古生菌中通路有所分化[2123]。MEP途徑的啟動是由3磷酸甘油醛（GAP）和丙酮酸的C2單元的縮合形成1脫氧D木酮糖5磷酸（DXP）。接著，DXP可以重新排列并縮合成2C甲基D赤蘚醇4磷酸（MEP），最終形成（E）4羥基3甲基丁2烯基二磷酸（HMBPP）。最后，由HMBPP生成IPP和DMAPP[2426]。抑制測定法表明，無論是MVA和MEP途徑都存在于人參發(fā)根中，以保證人參生長的代謝物相互補償[26]。然而，Schramek等[27]采用6年生人參進(jìn)行了13CO2脈沖追蹤實驗，得出結(jié)論認(rèn)為在人參中，人參皂苷合成主要是通過MVA途徑，但在MVA途徑供應(yīng)的產(chǎn)物受到限制時，通過MEP途徑進(jìn)行補償。

11甲羥戊酸途徑中的酶

雖然在人參MVA途徑中大部分基因都沒有進(jìn)行功能鑒定，但其相應(yīng)的同源序列已在人參等人參屬植物中鑒定。在動物和植物中，MVA途徑用3個拷貝的乙酰CoA縮合形成3羥基3甲基戊二酰基CoA（HMGCOA），分別由乙酰CoA乙?；D(zhuǎn)移酶和HMGCoA合酶（HMGS）開始。然后通過2個限速反應(yīng)SHMGCoA被轉(zhuǎn)換成RMVA，緊接著由關(guān)鍵酶3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）[28]進(jìn)一步形成MVA。在植物[29]和動物[30]的MVA途徑中已證實HMGR充當(dāng)?shù)谝粋€限速酶。動物中只有HMGR的單個成員，而植物有多個HMGR成員，不同的亞型體現(xiàn)了基因在空間和時間上的表達(dá)模式的多樣性。

人參含有HMGRs的2個拷貝（稱為PgHMGR1和PgHMGR2），這與雙子葉植物擬南芥類似。 PgHMGR1轉(zhuǎn)錄高水平一般發(fā)生在2周齡幼苗葉柄，而在該組織中，觀察PgHMGR2的表達(dá)相對較弱。在3年生的人參和6年生的人參中，PgHMGR1在根中表達(dá)豐富，而PgHMGR2隨著人參的生長發(fā)育表達(dá)量逐漸增加。啟動子活性的分析表明，PgHMGR1和PgHMGR2在根的脈管系統(tǒng)中活性較高。此外，持續(xù)的黑暗暴露可促進(jìn)PgHMGR1的表達(dá)，可提高3年生人參中人參總皂苷含量。這些發(fā)現(xiàn)表明，PgHMGR1在次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的普遍作用，而PgHMGR2的表達(dá)量與人參根的年齡有關(guān)[31]。

MVA可通過2個連續(xù)的ATP依賴的磷酸化步驟轉(zhuǎn)變成IPP[23，32]，分別通過甲羥戊酸激酶和磷酸甲激酶催化，然后通過甲羥戊酸磷酸脫羧酶（MVD）脫羧。這3種酶在植物中參與三萜的生物合成的機理還不清楚，人參MVD過表達(dá)可以增加菜油，豆甾醇和β谷甾醇的含量，而且還可以使環(huán)阿屯醇環(huán)化酶（CAS）的表達(dá)上調(diào)，但是人參皂苷的含量沒有顯著增加，β香樹脂醇含量降低。這一結(jié)果表明，MVD是甲羥戊酸途徑中生產(chǎn)IPP的最后一步反應(yīng)的酶，在人參中對甾醇的生物合成起著關(guān)鍵作用，而不是人參皂苷的生物合成[33]。

異戊烯二磷酸異構(gòu)酶能夠催化五碳的IPP及其同分異構(gòu)體DMAPP進(jìn)行可逆轉(zhuǎn)換。此外，親核IPP和親電DMAPP容易結(jié)合在一起形成C10牻?；沽姿?，它可以與其他的IPP進(jìn)一步組合成為法呢基二磷酸合酶（FPS），得到FPP，而牻?；姿岷厦冈谌~綠體單萜合成產(chǎn)生C10。FPS有助于積雪草中植物甾醇積累和人參皂苷的生物合成[34]。PgFPS的過表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因人參發(fā)根皂苷含量提高近24倍，還引起人參皂苷合成相關(guān)基因的上調(diào)，表明了PgFPS在人參皂苷合成中的重要作用 [33]。

角鯊烯合酶（SS）是一種膜結(jié)合酶，結(jié)合2分子的 FPP（C15）產(chǎn)生C30角鯊烯，作為合成三萜類化合物和植物甾醇的共同前體[18]。在酵母[35]和人[36]中SS只有單拷貝，而植物中含有1～3個拷貝。擬南芥中有2個已注釋的SS基因，但只有SS1有功能，SS2卻沒有SS的活性[37]。人參有3個SS基因都有具SS的生化功能。PgSS1可以在人參組織中普遍表達(dá)，但PgSS2和PgSS3的mRNAs只在特定的組織中表達(dá)[38]。原位雜交分析表明，PgSS1和PgSS3在葉柄維管束組織和樹脂導(dǎo)管中優(yōu)先表達(dá)。PgSS1的過表達(dá)引起人參皂苷生物合成途徑下游基因的上調(diào)表達(dá)，包括角鯊烯環(huán)氧酶（SE），β香樹素合酶（βAS），CAS，最終使植物甾醇和人參皂苷的含量在人參不定根中顯著增加[12]。這些研究表明了SS在人參中具有保守性和多樣性，對生產(chǎn)人參三萜和植物甾醇十分必要。

SE催化角鯊烯雙鍵的氧化，以產(chǎn)生2，3環(huán)氧角鯊烯，是植物甾醇和三萜皂苷的生物合成途徑中的1個限速酶[39]。酵母和小鼠中只有SE的1個拷貝，植物含有2個以上拷貝的SE基因。在擬南芥中，有6個拷貝的SE，其中，SE1，SE2和SE3都具有功能，僅SE1對植物正常生長發(fā)育至關(guān)重要[40]。原位雜交分析表明，PgSE1和PgSE2的表達(dá)在葉柄維管束組織和樹脂導(dǎo)管優(yōu)先表達(dá)。

人參皂苷的生物合成主要是通過3個反應(yīng)步驟來實現(xiàn)，即2，3環(huán)氧角鯊烯環(huán)化通過OSC的催化，以及隨后的羥基化和糖基化[4142]。在真菌，動物和植物中2，3環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶在產(chǎn)生甾醇或三萜類化合物的產(chǎn)物過程中發(fā)生了復(fù)雜的酶促反應(yīng)。在動物和真菌中羊毛甾醇合酶（LAS ）只有1個單拷貝用于甾醇生物合成，而在酵母菌株中有80多個OSC已被鑒定[20]。OSC控制次生代謝的特定分支。在人參和其他植物中，LAS和CAS負(fù)責(zé)植物甾醇生產(chǎn)[4344]。此外，β香樹素合成酶（βAS）和達(dá)瑪烯二醇合酶（DDS）一直是人參三萜類皂苷生物合成關(guān)鍵酶[44]。大多數(shù)三萜類是五環(huán)三萜，由β香樹脂醇，α香樹脂醇和羽扇豆醇衍生而來。含DDS的重組酵母菌株中可檢測到達(dá)瑪烷二醇和羥基達(dá)瑪烯酮[8，45]。DDS的RNAi人參不定根導(dǎo)致人參皂苷產(chǎn)量減少845%。此外，實驗表明在人參發(fā)狀根中，DDS抑制其他途徑分支中CAS的表達(dá)；這些發(fā)狀根中DDS酶活性增加，并與對照根部相比人參皂苷量高出50%～100%[46]。DDS在煙草細(xì)胞中成功表達(dá)生產(chǎn)達(dá)瑪烷二醇[4748]，這對在酵母細(xì)胞中利用其他下游基因生產(chǎn)人參皂苷提供了1種新的方法[4951]。DDS在人參屬中十分保守[52]，包含6個QW基序和基體結(jié)合DCTAE保守域編碼769個氨基酸。

由OSC產(chǎn)生1個基本的三萜烯骨架后，再由細(xì)胞色素P450（CYP）和尿苷二磷酸UDP依賴性糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）通過羥基化和糖基化將三萜骨架轉(zhuǎn)化為各種人參皂苷。在植物中OSC具有有限的基因數(shù)目，與此相反，UGTs 和CYPs是比較龐大的基因家族，具有顯著的功能多樣性[5354]。

在人參屬植物中，已報道的人參CYP基因中[5556]有3個CYP基因參與人參皂苷的生物合成，CYP716A47充當(dāng)原人參二醇合酶（PPDS）羥基化達(dá)瑪烷二醇的C12位置，產(chǎn)生PPD型人參皂苷[15]，2個CYP716A亞家族成員：CYP716A53v2作為原人參二醇6羥化酶（或稱為三醇合酶，PPTS），在人參中將PPD催化為PPT，生成達(dá)瑪烷型人參皂苷[16]。CYP716A52v2（齊墩果酸合成酶，OAS）作為1個β香樹脂醇28氧化酶修飾β香樹脂醇生成齊墩果酸，合成齊墩果烷型人參皂苷[17]。PPDS和PPTS在所有人參器官中均有表達(dá)，PPDS的表達(dá)在茉莉酸甲酸（MJ）誘導(dǎo)的不定根中表達(dá)量升高，但PPTS和OAS卻沒有[16]。此外，PPDS在西洋參中對應(yīng)的PqD12H已在體外酵母表達(dá)，其RNAi轉(zhuǎn)基因植物中具有合成PPD型人參皂苷的作用；PgPPDS和PqD12H的人參和西洋參發(fā)狀根RNAi均引起了發(fā)狀根的生長緩慢[57]，意味著植物生長和人參皂苷的合成之間的正相關(guān)性。

三萜類化合物的糖基化增加了其水溶性并改變了其生物活性。UGTs作為受體分子廣泛分布于生物體中能夠識別廣泛的天然產(chǎn)物。UGTs屬于多基因家族，涉及的植物天然產(chǎn)物非常多樣。在人參屬植物中，認(rèn)為UGTs在生產(chǎn)不同的人參皂苷中起重要作用，通過加入單糖在C3和/或C20的三萜苷元成為PPD型人參皂苷，在C6和/或C20加入單糖為PPT型的人參皂苷。盡管一些糖基化三萜苷元的UGT酶已鑒定[5051， 5861]，但UGTs在人參中的生化功能仍是未知的。三七中的UGRdGT和人參中的UGRh2GT已被純化出來，并且證明了其是負(fù)責(zé)人參皂苷從Rd到Rb1的合成，人參皂苷從Rh2到Rg3的合成[6162]。最近Yan等[50]在幾個糖基化的中間體中鑒定了UGTPg1，包括達(dá)瑪烷二醇，PPD，Rh2和Rg3，用于生產(chǎn)C20位置的新化合物20SOβ（D葡萄糖）d達(dá)瑪烷二醇（DMG）CK，CK是在人參植物中檢測不到的一種人參皂苷，但在人的血液中可以檢測到，F(xiàn)2和Rd可以轉(zhuǎn)化成人參皂苷CK。這一發(fā)現(xiàn)表明，人參具有合成CK的能力，但是不能積累，這是由于CK在植物中的不穩(wěn)定性。Jung等 [50]鑒定了PgUGT74AE2是催化UDP葡萄糖上的部分葡萄糖轉(zhuǎn)移到PPD和CK的C3羥基上，最終得到皂苷Rh2和F2，PgUGT94Q2可以將UDP葡萄糖上的葡萄糖部分轉(zhuǎn)移到皂苷Rh2和F2來產(chǎn)生人參皂苷Rg3和Rd。Khorolragchaa等[58]從人參中發(fā)現(xiàn)了12個假定UGTs，如果對其進(jìn)行功能鑒定，可能會揭示其控制人參皂苷生物合成的機制，為改變?nèi)藚⒃碥盏漠a(chǎn)量提供新的方法。

迄今為止，對于植物三萜類生物合成基因/酶的調(diào)控機制知之甚少。在動物中，HMGR為膽固醇合成的限速酶，HMGR在轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后通過MVA途徑的固醇和非固醇終產(chǎn)物介導(dǎo)多種反饋調(diào)節(jié)[63]。在植物中，HMGR活性也被限制在轉(zhuǎn)錄和翻譯后的水平上，包括可逆的激酶介導(dǎo)的磷酸化SNF1（蔗糖非發(fā)酵）相關(guān)的蛋白激酶1（SnRK1）的抑制，多效調(diào)控位點1（PRL1）[23]，光調(diào)節(jié)蛋白酶降解[64]和蛋白磷酸酶2A（PP2A）[65] 負(fù)調(diào)控調(diào)節(jié)。由于PP2A參與脫落酸和生長素信號傳導(dǎo)，PRL1具有調(diào)節(jié)糖，壓力和激素應(yīng)答的功能，所以可以推測HMGR活性是受植物激素和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。此外，已經(jīng)證實無論是MVA和MEP途徑都是通過PRL1分子由糖和激素進(jìn)行協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)[66]。

代謝基因簇提供轉(zhuǎn)錄共調(diào)控的策略。目前已在二倍體燕麥中發(fā)現(xiàn)了三萜化合物燕麥素的合成所需的類操縱子基因簇[6768]。同時還在擬南芥中鑒定出了負(fù)責(zé)制造和修飾新的三萜化合物thalianol 和marneral的新途徑的基因簇。Thalianol此前沒有在植物中發(fā)現(xiàn)過[6970]。還在模式豆科植物百脈根發(fā)現(xiàn)新型的三萜化合物dihydroluepol的生物合成基因簇[71]。研究表明，在單子葉植物和雙子葉植物中大多數(shù)集群與萜類合酶和CYP的集群協(xié)同表達(dá)[72]。這對于挖掘人參基因組中是否也含有人參皂苷生物合成類操縱子基因簇或者控制人參皂苷合成的基因簇有著很有意義的啟發(fā)。

12人參皂苷的積累和生理功能

植物中的人參皂苷的含量和質(zhì)量是受生物和環(huán)境因素所影響，如品種，年齡，不同的植物組織，收獲的季節(jié)，栽培方法的差異和保存方法等[2]。研究表明，大部分的人參植物組織器官，如根，莖，葉，花和果實可以合成人參皂苷，但不同的器官有不同的含量和不同類型的人參皂苷[5]。在人參和西洋參1至6年生長過程中，多年生人參的根或發(fā)狀根中積累的人參皂苷含量較高，如人參皂苷Rb1，而葉中積累的人參皂苷在早期生長階段時含量達(dá)到最多（主要是第1年和第2年）[7375]。此外，從上一年根長出的發(fā)葉期間，葉片的人參皂苷含量顯著增加，而在根部積累減少[76]，這表明在人參每年生長過程中人參皂苷是動態(tài)合成的。盡管研究表明了人參皂苷的合成和分配的機制，但人參皂苷的長距離分配在很大程度上仍然未知。最近，13C標(biāo)記實驗表明，人參皂苷生物合成的前體可以從人參葉運輸?shù)礁?。Schramek等[27]提出，光合代謝產(chǎn)物，如葡萄糖和果糖的代謝產(chǎn)物對人參皂苷的合成和運輸有一定的貢獻(xiàn)。

此外，不同基因型的人參對人參皂苷含量也有影響。雖然西洋參，人參和三七在形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育上十分相似，但每個人參物種都具有特異的人參皂苷的類型和含量[7780]，而且在組織培養(yǎng)中人參皂苷的含量和組成也不同。各種人參品種間的這些差異不僅可以反應(yīng)基因多樣性造成了不同的人參物種中人參皂苷的合成和積累的多樣性，也可以用于人參物種鑒定和產(chǎn)品質(zhì)量控制。在未來，研究控制人參皂苷生物合成在人參屬間的遺傳和生化機制是十分重要的。

雖然三萜皂苷已被視為抵抗致病微生物和植食性動物的防御化合物[53，81]，但人參皂苷的植物生理作用卻鮮為人知。目前，人參皂苷的最重要的生理作用是作為植物抗生素保護(hù)植物抵抗病原體。例如，主要在人參根際分泌的人參皂苷對土壤真菌群落具有化感作用。阻斷病原體襲擊的機制可能是人參皂苷與真菌膜上的固醇物質(zhì)相互作用，導(dǎo)致膜的完整性遭到破壞[8285]。另一方面，人參皂苷的殺真菌毒性可能會被病原體形成的糖苷酶降解而減弱[82]，降解后的人參皂苷隨后可作為化感作用生長刺激劑使更多的根部致病菌死亡，如鐮刀菌和人參銹腐病病原菌[84，86]，這意味著人參根際和土壤真菌之間的相互作用決定了防御和敏感性。此外，人參皂苷也具有抗昆蟲活性[87]，可能對昆蟲激素的蛻皮激素的受體進(jìn)行干擾，并影響植食性昆蟲的生命周期[88]。此外，人參皂苷的中間結(jié)構(gòu)達(dá)瑪烷二醇在轉(zhuǎn)基因煙草中具有抗病毒活性[48]。但是，人參皂苷是如何識別和防御病原體的機制仍有待解決。

雖然人參皂苷的主要作用是植物防御，但三萜類化合物也可對植物的生長和發(fā)育有一定的影響。三萜皂苷羽扇豆醇在百脈根的根瘤中合成并調(diào)節(jié)根瘤發(fā)育[89]。在擬南芥中的新型三萜類化合物thalianol和marneral也影響植物生長，包括根的生長和胚胎的發(fā)生[69]。最新研究發(fā)現(xiàn)β香樹脂醇可以改變糙伏毛燕麥表皮細(xì)胞模式[90]。在人參中，人參皂苷化感作用對人參植物生長的影響已有報道[91]。較高濃度的PPD組人參皂苷可抑制西洋參的幼苗生長。與此相反，不同濃度PPT組人參皂苷對西洋參幼苗生長具有刺激生長作用。PPD和PPT組人參皂苷對植物生長產(chǎn)生的不同影響可能與植物對人參皂苷信號傳導(dǎo)的響應(yīng)有關(guān)，但這些機制仍然尚未明確，需要進(jìn)一步闡明。

13利用生物技術(shù)生產(chǎn)人參皂苷

131組織培養(yǎng)人參的大田栽培通常需要4～6年，由于人參生長是容易受環(huán)境因素的影響（如土壤，氣候，遮陽，病原體和害蟲），所以需要對其進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。為了解決這些問題，細(xì)胞和組織培養(yǎng)的方法已廣泛地應(yīng)用于迅速大量生產(chǎn)人參皂苷中[9296]。其中人參主要品種通過細(xì)胞株和化學(xué)方法生產(chǎn)人參皂苷，研究多集中在人參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和人參不定根的培養(yǎng)。

人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是有效的生產(chǎn)人參皂苷的方法，研究顯示，在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的成分如糖分子對人參皂苷產(chǎn)量有顯著的效果。例如，在三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中蔗糖質(zhì)量濃度為20～40 g·L-1時可以促進(jìn)人參總皂苷含量增加23倍，這可能是由于高滲透壓降低了養(yǎng)分?jǐn)z入的緣故[97]。在人參中，60 g·L-1蔗糖與30 g·L-1蔗糖濃度的培養(yǎng)基可以使人參總皂苷含量增加35倍[95，98]，添加山梨醇與水解酪蛋白和30 g·L-1蔗糖的對照相比，人參總皂苷收率增加35倍[99]。在三七的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時向培養(yǎng)基中分別添加磷酸鹽濃度為0～125 mmol·L-1，可提高人參皂苷產(chǎn)量在7倍以上[100]。同時，在人參細(xì)胞培養(yǎng)時添加042 mmol·L-1的磷酸鹽可以優(yōu)化細(xì)胞的生長[101]，較高的硝酸銨比例可提高3個主要人參屬懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中人參皂苷的產(chǎn)量[94， 102103]，這表明硝酸鹽的比例對人參皂苷的產(chǎn)量和細(xì)胞生長十分重要。此外，在200 μmol·L-1的MJ處理的人參和三七的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中的人參皂苷尤其PPD組的人參皂苷產(chǎn)量增加[104106]。在人參細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物中添加N， N′二環(huán)己基碳10 μmol·L-1可使人參總皂苷含量與未處理的對照相比增加3倍，其中 Rg1和Re的含量要高于Rb1的含量，這是由于在人參細(xì)胞中PPT生物合成酶的活性增加并調(diào)節(jié)一氧化氮信號傳導(dǎo)[107]。

不定根培養(yǎng)具有較高的人參皂苷生產(chǎn)量，大規(guī)模培養(yǎng)過程中物理和化學(xué)條件有較高的穩(wěn)定性（高達(dá)10 t的組織培養(yǎng)是對人參生物反應(yīng)器生產(chǎn)的改進(jìn)）[94]。從人參和三七的葉柄、側(cè)根和花蕾幼芽愈傷組織中誘導(dǎo)的不定根用于生產(chǎn)人參皂苷已有15年[9293， 96，108]，最近在西洋參中也建立了這種體系[109]。人參不定根的培養(yǎng)物可以充當(dāng)補充策略來改善大規(guī)模生產(chǎn)中人參皂苷含量的積累[110111]。MJ和水楊酸（SA）也可以提高人參不定根中人參皂苷的積累，可能是因為MJ和SA可誘導(dǎo)人參不定根懸浮培養(yǎng)中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致人參皂苷含量增加[112]。此外，植物激素的組合，吲哚3丁酸和MJ可以協(xié)同地引起不定根根生長并使人參皂苷含量與MJ單獨處理相比增加7倍[12，113]。而且，在人參不定根培養(yǎng)物中添加乙烯利和MJ的組合可以使人參皂苷產(chǎn)量增加[114]。此外，滲透劑如吐溫80在不定根的培養(yǎng)中可以增強人參皂苷分泌，使人參總皂苷收率增加3倍[115]。最近，Kim等 [116]報導(dǎo)了由γ射線誘變?nèi)藚⒉欢ǜ梢蕴岣呷藚⒃碥蘸颗c對照組相比提高了16倍。

發(fā)根農(nóng)桿菌感染人參根形成的人參發(fā)狀根已在生物反應(yīng)器中利用，生物反應(yīng)器可以更大規(guī)模地生產(chǎn)人參皂苷，使人參皂苷快速生長，具有穩(wěn)定性和靈活性[117122]。

此外，人參的水培是1個受控環(huán)境下的短期內(nèi)生產(chǎn)人參皂苷1個例子[80，123]。水培系統(tǒng)還可以在較短的時間內(nèi)生產(chǎn)無農(nóng)藥人參根和葉以提高人參皂苷的產(chǎn)量。人參水培含有更高水平的PPT型人參皂苷，特別是人參皂苷Re和特殊類型的人參皂苷Rh1含量提高60%以上，Rh1不能在土壤栽培的人參中檢測到[47，123124]。人參植物的葉子在高光條件下可以增加PPT型人參皂苷的含量[80]，連續(xù)對葉片和根黑暗處理2～3 d可以增加人參根、葉[31]和不定根[125]中人參皂苷的含量。已有研究提出，整個MEP途徑中是在光的刺激反應(yīng)下，最有可能通過光敏色素信號傳導(dǎo)途徑，但在MVA途徑中主要是光的抑制反應(yīng)[21]。

132化學(xué)誘導(dǎo)生物和非生物誘導(dǎo)子的刺激可以使植物細(xì)胞積累人參皂苷。有研究表明，通過誘導(dǎo)子分子處理可提高人參皂苷含量[126]。各種生物和非生物誘導(dǎo)子，如硫酸銅[127]，釩[107]，硫酸鎳，氯化鈉，一氧化氮，乙烯利[128129]，超聲[130]，半乳糖醛酸[128]，滲透壓[99]，殼聚糖[131]，多不飽和脂肪酸[132133]，天竺葵化合物[134]，SA[117]，茉莉酸（JA）及其衍生物[104，112，114， 135136]，這些誘導(dǎo)子可增加人參細(xì)胞或不定根中人參皂苷的含量，通過苯丙氨酸氨裂解酶刺激人參皂苷的生物合成，苯丙氨酸氨裂解酶是防御化合物生物合成所需的關(guān)鍵酶[135]或者是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一氧化氮和活性氧，例如過氧化氫[107，127128]。

在這些誘導(dǎo)子中，MJ是刺激體人參內(nèi)所有細(xì)胞系中人參皂苷生物合成最有效的誘導(dǎo)子[9394， 106，113，118， 137]。在人參發(fā)狀根中添加100 μmol·L-1的 MJ 合成人參皂苷可以誘導(dǎo)一些基因的表達(dá)，如HMGR，SS，SE，DDS以及CAS[12，113，118， 138]。在MJ處理的第7天PPD型人參皂苷增加了55～97倍，而PPT型皂苷增加19～38倍。在三七中，加入200 μmol·L-1的MJ也會使單體皂苷類型及含量分布不均勻，PPD型人參皂苷增加9倍，PPT型人參皂苷增加2倍[137]。JA可以增加人參皂苷Rb1組的含量，這說明其可能引起PPD型人參皂苷的積累[136]。在人參整個根部加入MJ可以刺激人參皂苷的積累，尤其是PPD型的人參皂苷，在根的內(nèi)部積累水平最高，而不是在表皮，這再次表明人參皂苷的生物合成的反應(yīng)發(fā)生在脈管系統(tǒng)[124]。

SA和JA是在植物防御機制[139]中發(fā)揮重要作用的信號分子。在人參植物和細(xì)胞中添加MJ可以提高人參皂苷的產(chǎn)量這一現(xiàn)象可以說明人參皂苷在植物防御機制中扮演重要的角色。外源性的MJ可誘導(dǎo)脂氧合酶的合成，經(jīng)由α亞油酸通路合成內(nèi)源性JA [140]。JA也可以在PPD型人參皂苷的積聚中起重要作用[104]。另外，通過環(huán)狀oxylipins將信號激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，包括WRKY和MYB，它們可能與人參皂苷的生物合成的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[141142]。重金屬處理可以積累人參皂苷，可能是通過誘導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)源合成JA信號分子[107]。

此外，PPD組人參皂苷的生物合成可能比PPT組人參皂苷更容易受到MJ的刺激，而低溫處理所引起的PPT型人參皂苷要比PPD型人參皂苷的含量更多[124]。生物和非生物條件的不同誘導(dǎo)作用下會產(chǎn)生不同的單體皂苷，這可能與他們的不同的生物活性和不同的防御策略相關(guān)。不同的單體皂苷的生物合成途徑還尚未確定，需要進(jìn)一步研究來確定關(guān)鍵酶及其他基因是如何參與不同單體人參皂苷的生物合成，這將有助于闡明人參皂苷的生物合成響應(yīng)生物和非生物壓力的機制。

133轉(zhuǎn)基因植物雖然已經(jīng)有很多關(guān)于人參組織和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷的研究，但是人參皂苷的生產(chǎn)力還比較差。因此，通過代謝工程生產(chǎn)人參皂苷一直是提高人參皂苷產(chǎn)量一個有效策略。利用參與人參皂苷生物合成上調(diào)或下調(diào)的基因?qū)崿F(xiàn)人參皂苷大量生產(chǎn)已在轉(zhuǎn)基因植物中報道。

最近，研究發(fā)現(xiàn)，PgHMGR1是提高人參皂苷生產(chǎn)的關(guān)鍵指標(biāo)，在轉(zhuǎn)基因不定根中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花椰菜花葉病毒（CMV）35S啟動子啟動的PgHMGR1過表達(dá)引起了三萜類化合物和甾醇的積累量增加了15～2倍，但單體皂苷的比率沒有改變[31]。PgFPS的過表達(dá)可以增加2個下游基因PgCAS和PgDDS的表達(dá)量，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因發(fā)根中總皂苷和植物甾醇（菜油甾醇，豆甾醇，β谷甾醇）的含量與對照組相比增加24倍，而β香樹素含量卻下降[33]。SS也是生產(chǎn)植物甾醇和三萜類化合物的代謝過程中關(guān)鍵酶之一。人參PgSS1的過表達(dá)引起人參轉(zhuǎn)基因不定根中總皂苷增加16～3倍，植物甾醇增加2倍，同時，下游酶基因如SE，βAS，和CAS上調(diào)表達(dá)[12，143]。通過RNAi在人參中沉默PgSE1，發(fā)現(xiàn)PgSE2和CAS的表達(dá)顯著上調(diào)，并使植物甾醇積累增加，這表明PgSE1和PgSE2的表達(dá)以不同的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，人參皂苷的生物合成可能是由PgSE1調(diào)節(jié)，而不是由PgSE2。因此，使用不同的同功酶可能有助于不同的人參皂苷的生物合成。在MJ處理下3個PGSS基因都會上調(diào)。但是，MJ會使PgSE1表達(dá)量升高，卻抑制PgSE2的表達(dá)，這一結(jié)論支持在三萜和植物甾醇的生物合成中PgSE1和PgSE2的具有不同調(diào)節(jié)作用這一觀點[13]。目前，關(guān)于生產(chǎn)人參皂苷的轉(zhuǎn)基因植物只在人參中有報道，在其他受體及異源植物中尚未見研究。

134工程酵母細(xì)胞目前，野生人參根資源十分稀缺，大多數(shù)市售的人參根都是來源于田間栽培的人參。因為在栽培人參時比較費時，費力，因此，一些研究者試圖利用酵母細(xì)胞（釀酒酵母）生產(chǎn)人參皂苷，酵母細(xì)胞已是公認(rèn)的高效生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品的理想受體。因此，與傳統(tǒng)的提取方法相比，酵母細(xì)胞生產(chǎn)人參皂苷是一個特別值得關(guān)注的方法。

已在酵母中共表達(dá)PgDDS和CYP716A47并成功生產(chǎn)了PPD型人參皂苷[15]。Dai等[49]將甘草中的β香樹脂醇合酶，苜蓿中的齊墩果酸合成酶，人參中的DDS，PPDS和PPTS以及擬南芥中的NADPH細(xì)胞色素CYP還原酶轉(zhuǎn)入代謝工程菌釀酒酵母中，高效大量生產(chǎn)人參皂苷的糖苷配基。此外，HMGR，SS和2，3環(huán)氧角鯊烯合成酶基因的過表達(dá)可以形成多種前體來生產(chǎn)苷元。使用這種策略，Dai等[49]對酵母菌株進(jìn)行重組，改造后的菌株能夠生產(chǎn)172 mg·L-1 PPD型人參皂苷、159 mg·L-1的PPT型人參皂苷和214 mg·L-1的齊墩果酸。

干燥人參根含有約4%的人參皂苷，口服人參或人參皂苷時，在哺乳動物的血液中觀察到CK的消耗，CK具有抗炎，保肝，降糖和抗癌等生物活性[51]。最近，國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)CK進(jìn)行治療關(guān)節(jié)炎的臨床試驗。在人參屬植物中并沒有CK的存在，目前，CK主要是由PPD型的人參皂苷，如Rb1，Rb2， Rd和Rc去糖基化產(chǎn)生的[2]。大量研究已經(jīng)表明，人參皂苷大部分可以通過消化道酸類，酶和腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化為稀有皂苷，特別是人體腸道內(nèi)的β葡糖苷酶[2]。因此，酶法轉(zhuǎn)化已被用來獲得稀有皂苷。最近，使用重組酶的生物轉(zhuǎn)化研究十分多，特別是用于人參皂苷Rg3的生產(chǎn)[144148]。然而，由于人參皂苷用于大規(guī)模CK生產(chǎn)有限的可用性以及化學(xué)合成所造成的人參皂苷的糖基化選擇性差異帶來的挑戰(zhàn)，研究人員也探索了一些新的方法。Yan等[51]采用UGTPg1與截短的HMGR和UPC21一起過表達(dá)（UPC21是UPC2的1個半顯性突變體，在甾醇的合成中充當(dāng)全局的轉(zhuǎn)錄因子），最終得到的酵母菌株中CK產(chǎn)量高達(dá)14 mg·L-1。這一工作提供了一種廉價的制造CK方式，對滿足臨床應(yīng)用具有里程碑式的價值。此外Jung等[50]表達(dá)了2個新鑒定的PgUGTs基因：PgUGT74AE2和PgUGT94Q2，與PgDDS和PgPPDS在一起在酵母細(xì)胞中產(chǎn)生人參皂苷Rg3。Wei等[149]發(fā)現(xiàn)UGTPg1特異性糖基化PPT的C20OH產(chǎn)生人參皂苷F1，并從人參中分離了4種新型UGT基因，其中UGTPg100特異性地糖基化PPT的C6OH以產(chǎn)生人參皂苷Rh1，UGTPg101催化PPT產(chǎn)生F1，隨后從F1產(chǎn)生人參皂苷Rg1，利用UGTPg1和UGTPg100構(gòu)建酵母重組體生物合成F1和Rh1。這些工作為利用酵母發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)特定人參皂苷提供了新方法。

2總結(jié)與展望

迄今為止，已分離得到150多種人參皂苷，其中大部分是達(dá)瑪烷型或齊墩果烷型。然而，人參皂苷生物合成的機制，以及在人參皂苷在不同人參物種中的多樣性還沒有被闡明。需要進(jìn)一步研究各種人參皂苷的合成中特定組織中潛在的機制及如何將其運到目標(biāo)組織中。

人參皂苷可能充當(dāng)植物抗逆及病原體相互作用的防御分子。人參的藥理藥效主要依賴于他們的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，尤其是他們的羥基基團(tuán)和糖基團(tuán)部分，其與膜脂相互作用。在未來，應(yīng)該更深入的了解人參皂苷與激素信號傳導(dǎo)途徑的相互影響及其他影響人參皂苷合成的途徑等方面，以提高人參皂苷的藥效藥理作用。

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