李賀水,曾 勇,欒 青

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺 264005)

注射白斑綜合征病毒對克氏原螯蝦酚氧化酶活力的影響

李賀水,曾 勇,欒 青

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺 264005)

將白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila, Ah)、大腸桿菌(Escherichiacoli)(DH5α)用注射法接種克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，在0～72 h之間定時檢測克氏原螯蝦血細胞和肝胰臟中酚氧化酶(Phenoloxidase, PO)活力變化。結(jié)果顯示：(1)0.1 mg/mL和1 mg/mL胰蛋白酶處理樣品后，樣品間差異不顯著。(2)加胰蛋白酶處理與未加胰蛋白酶相比，供試克氏原螯蝦PO活力均升高。(3)未加胰蛋白酶與加胰蛋白酶表現(xiàn)出相似的特征，WSSV和Ah注射組與對照組相比均表現(xiàn)為，12～48 h PO活力顯著高于對照組，并且在48 h達到最大值，72 h時基本恢復(fù)正常；注射DH5α組與對照組相比沒有顯著性變化。可見感染W(wǎng)SSV后，克氏原螯蝦體內(nèi)酚氧化酶活力發(fā)生了變化，由此推測，PO參與了螯蝦體內(nèi)抵御病毒的免疫反應(yīng)。

白斑綜合征病毒；嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)；大腸桿菌(Escherichiacoli)；克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)；酚氧化酶活力

克氏原螯蝦(簡稱螯蝦)，又稱小龍蝦，其養(yǎng)殖方式多樣，為人們帶來的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益日漸明顯，已成為我國的重要水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖品種。但是，近年來病毒、細菌、真菌等微生物引起的傳染性疾病，影響螯蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[1]。甲殼動物不具備特異性免疫的B細胞和T細胞，缺乏獲得性免疫，具有抵抗病原微生物的天然免疫系統(tǒng)，包括免疫器官細胞性防御系統(tǒng)和體液性防御系統(tǒng)，免疫機制包括表皮上抗菌肽的大量表達、吞噬作用、包囊作用、結(jié)節(jié)形成、外源凝集素的分泌及酚氧化酶原系統(tǒng)產(chǎn)生的黑化作用等[2]。其中酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase activating system, proPO-AS)是一個由酚氧化酶原(prophenoloxidase, proPO)、酚氧化酶(phenoloxidase, PO)、絲氨酸蛋白酶[3]、模式識別受體和蛋白酶抑制劑等構(gòu)成的一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，類似于脊椎動物補體激活系統(tǒng)，在甲殼動物的防御和識別功能中起重要作用。現(xiàn)有研究表明，proPO系統(tǒng)中的免疫因子以非活化的狀態(tài)存在于血細胞中，當受到病原刺激后被釋放到血淋巴中，在酚氧化酶原激活酶(prophenoloxidase activating enzyme, ppA)作用下成為能產(chǎn)生黑化作用的PO，通過血細胞吞噬作用、包裹作用和結(jié)節(jié)形成等多種方式參與抵御病原的反應(yīng)中[4-6]。因此，PO活力的變化可作為衡量甲殼動物機體免疫功能強弱的常用指標[7]。

proPO系統(tǒng)在抵抗細菌性疾病中的作用已有直接報道[8]。然而，白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)對甲殼動物PO活力的影響有不同的報道[9-12]。Seajeng等[9]研究印度谷螟(Plodiainterpunctella)感染印度谷螟顆粒體病毒(Plodiainterpunctellagranulosis virus, PiGV)后，通過實時監(jiān)測血細胞中PO的活力，發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組均無明顯差異。Sarathia等[10]用WSSV感染印度明對蝦(Penaeusindicus)，發(fā)現(xiàn)實驗組血細胞中的PO活力明顯高于對照組。何建國的研究團隊和Lai等在基因水平上詮釋了WSSV感染南美白對蝦(Penaeusvannamei)后，抑制了酚氧化酶原基因的表達[11,12]。同時，著名甲殼動物免疫學(xué)家S?derh?ll 的團隊多次撰文闡述proPO系統(tǒng)在無脊椎動物免疫防御中的功能[13, 14]，指出該系統(tǒng)在無脊椎動物防御細菌及真菌的感染中具有重要功能。但是，該團隊在綜述甲殼動物的抗病毒免疫機制中并未提及proPO系統(tǒng)的作用[15]。因此，甲殼動物感染W(wǎng)SSV后，其體內(nèi)PO活力的變化以及proPO系統(tǒng)的作用仍需進一步研究。

螯蝦的ppA以非活力形式(酚氧化酶原激活酶原，proppA)存在于血細胞中，Ca2+和其他誘導(dǎo)物能激活proppA使之成為有活力的ppA，隨后可以通過蛋白水解作用將76 ku的proPO裂解為60與62 ku的兩個PO，實驗中商品化的胰蛋白酶裂解proPO生成60 ku具有PO活力的酶分子[5]。因此，本實驗選用胰蛋白酶誘導(dǎo)激活proPO。

本文以螯蝦為實驗材料，選用WSSV為研究對象，以嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila, Ah)和大腸桿菌(DH5α)為參照物，對螯蝦進行免疫注射。初步研究螯蝦在注射以上微生物0～72 h之間PO活力的變化規(guī)律，PO活力測定時分別用兩種方法，第一種方法，不加胰蛋白酶，檢測樣品中原有PO活力；第二種方法，加胰蛋白酶處理，激活酚氧化酶原，檢測樣品中總的酚氧化酶活力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗螯蝦(17.3±1.8)g采購于煙臺市九佃水產(chǎn)市場，無傷殘且有活力。在24 ℃的水族箱里暫養(yǎng)7 d后，選取健康存活的螯蝦用于本實驗。實驗用致病性嗜水氣單胞菌是本實驗室于螯蝦中分離鑒定并保存的菌株，菌株號AH-3。WSSV是本實驗室從螯蝦中分離鑒定并保存的毒株08HB[12]。大腸桿菌DH5α購于上海生工生物工程有限公司，該菌株是非致病菌株。

1.2 實驗方法

WSSV的感染：分別取經(jīng)檢測不攜帶毒株的螯蝦和實驗室保存的攜帶WSSV的螯蝦腮部0.2 g，研磨后用PBS緩沖液稀釋到1 mL，離心(6 000 r/min, 4 ℃, 5 min)，保留上清。取60只健康存活的螯蝦，平均分成兩組，對照組腹部注射0.1 mL健康螯蝦的腮組織研磨后制取的上清；實驗組腹部注射0.1 mL含WSSV的上清。水族箱飼養(yǎng)，定時采樣。

細菌感染：取90只健康存活的螯蝦，平均分成三組，一個對照組，兩個實驗組。對照組注射0.1 mL PBS緩沖液，實驗組注射0.1 mL含細菌(嗜水氣單胞菌或大腸桿菌)2.8×106CFU的PBS緩沖液。水族箱飼養(yǎng)，定時采樣。

自注射攻毒液的0、6、12、24、48、72 h，每個時間點取5尾蝦，用含有500 μL抗凝劑(抗凝劑組成0.14 mol/L NaCl； 0.1 mol/L 葡萄糖；30 mmol/L 檸檬酸；20 mmol/L 檸檬酸鈉；10 mmol/L EDTA；pH 4.6)的5 mL無菌注射器自蝦頭胸甲后插入圍心腔吸取血淋巴至1 mL，置于1.5 mL的Eppendorf中，搖勻，離心(6 000 r/min, 4 ℃, 10 min)，上清液即為血漿，底部即為血細胞，沉淀中加200 μL PBS緩沖液，清洗血細胞表面余留的抗凝劑和血漿，離心(6 000 r/min, 4 ℃, 5 min)，去除上清液，加入40 μL超純水(4 ℃)，冰上操作，用研磨棒破碎細胞，離心(6 000 r/min, 4 ℃, 2 min)，上清液即為血細胞內(nèi)容物，-80 ℃保存用于PO活力的測定。同時取近尾端的肝胰臟，用滅過菌的研磨棒充分研磨后，加入500 μL PBS，離心(8 000 r/min, 4 ℃, 10 min)，中間層即為肝胰臟提取液，-80 ℃保存用于PO活力的測定。

1.3 蛋白濃度的標定

用改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒，稀釋樣品后，Bradford試劑和BSA標準蛋白結(jié)合使用，用酶標儀(680, Bio-Rad)測定在570 nm處的吸光度值，根據(jù)標準蛋白曲線計算血細胞和肝胰臟中蛋白質(zhì)濃度。用超純水稀釋蛋白質(zhì)濃度到同一水平，即1 mg/mL，-80 ℃保存用于PO活力的測定。

1.4 酚氧化酶(PO)活力測定

以L-多巴為底物，采用改進的Ashida等的方法，在96孔酶標板中進行PO活力測定，溫度為20 ℃，pH為7.0。實驗中PO的測定有三個處理，胰蛋白酶濃度分別為0 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL。不加胰蛋白酶時，在96孔酶標板中加100 μL樣品，100 μL PBS緩沖液和100 μL 0.01 mol/L的L-多巴溶液。加0.1 mg/mL的胰蛋白酶和加1 mg/mL的胰蛋白酶時，在96孔酶標板中加入10 μL樣品，90 μL胰蛋白酶(0.1 mg/mL或1 mg/mL)，100 μL PBS緩沖液，100 μL 0.01 mol/L的L-多巴溶液。在酶標儀(680, Bio-Rad)中震蕩4次，20 ℃孵育，每隔2 min讀取490 nm處的吸光值。酶的活力以實驗條件下，D490 nm每分鐘增加0.001為1個酶活力單位。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行分析，采用One-Way ANOVA方法，組間差異都用LSD’s多重比較，最終以柱形圖的形式表示，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果

2.1 不同的胰蛋白酶濃度對螯蝦PO活力的影響

如圖1所示，隨機抽取同一時間段(每個時間段都含有5個平行實驗)的實驗組和對照組，提取肝胰臟和血細胞PO樣品，在相同實驗條件下，用胰蛋白酶濃度分別為0 mg/mL、0.1 mg/mL和1 mg/mL處理肝胰臟和血細胞。結(jié)果顯示，與未加胰蛋白酶相比，加入胰蛋白酶后，肝胰臟和血細胞的PO活力均顯著升高。胰蛋白酶濃度分別為0.1 mg/mL和1 mg/mL處理的PO活力變化不顯著(P>0.05)。因此，本實驗選用的胰蛋白酶濃度為0.1 mg/mL。

圖1 胰蛋白酶對酚氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of trypsin on the phenoloxidase activity

2.2 嗜水氣單胞菌(Ah)和大腸桿菌(DH5α)注射對螯蝦肝胰臟和血細胞中酚氧化酶(PO)活力的影響

如圖2、圖3所示，分別表示Ah和DH5ɑ注射時螯蝦肝胰臟和血細胞中PO活力的變化。未加胰蛋白酶時，大腸桿菌(DH5α)注射組與對照組相比變化不顯著(P>0.05)；Ah實驗組和對照組在0～6 h PO活力變化不顯著(P>0.05)，實驗組在12～24 h PO活力顯著(P<0.05)高于對照組，并在48 h極顯著(P<0.01)高于對照組，72 h基本恢復(fù)對照組水平。胰蛋白酶(0.1 mg/mL)處理后，上述兩組實驗的對照組和實驗組PO活力均升高，PO活力的變化趨勢與未加胰蛋白酶處理時的相同。

圖2 Ah、DH5α 對肝胰臟酚氧化酶的影響Fig.2 Effects of Ah、DH5α on phenoloxidase activity of hepatopancreas*表示P<0.05即顯著水平，**表示P<0.01即極顯著水平，以下圖中的表示方法與此相同。

圖3 Ah、DH5α對血細胞酚氧化酶的影響Fig.3 Effects of Ah、DH5α on phenoloxidase activity of hemocyte

2.3 WSSV注射對螯蝦PO活力的影響

如圖4、圖5所示，分別表示W(wǎng)SSV攻毒實驗中螯蝦肝胰臟和血細胞的PO活力的變化。WSSV實驗組與Ah實驗組PO活力的變化有類似的特征，未加胰蛋白酶時，對照組和實驗組在0～6 h PO活力變化不顯著(P>0.05)，實驗組在12～24 h PO活力顯著(P<0.05)高于對照組，并在48 h極顯著(P<0.01)高于對照組，72 h基本恢復(fù)對照組水平。胰蛋白酶(0.1 mg/mL)處理后，對照組和實驗組PO活力均升高，PO活力的變化規(guī)律與未加胰蛋白酶處理時的相同。

圖4 WSSV對肝胰臟酚氧化酶的影響Fig.4 Effects of WSSV on phenoloxidase activity of hepatopancreas

圖5 WSSV對血細胞酚氧化酶的影響Fig.5 Effects of WSSV on phenoloxidase activity of hemocyte

3 討論

朱毅菲等[16]研究了螯蝦體內(nèi)PO活力的最適溫度和pH，提出PO活力的最適溫度為20 ℃，最適pH 7.0，該酶在20～40 ℃，pH 6.0～7.0時有較強的穩(wěn)定性。參照以上實驗結(jié)論，本實驗測定PO活力時，溫度為20 ℃，pH為7.0。

近年來，已有文章報道胰蛋白酶作為誘導(dǎo)劑，激活proPO發(fā)揮PO活力。Hopkins[17]的報道中用0.1 mg/mL的胰蛋白酶可以顯著提高斑節(jié)對蝦血細胞溶解產(chǎn)物的PO活力。李義[18]在研究中華絨螯蟹PO的性質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)1 mg/mL胰蛋白酶可將中華絨螯蟹血細胞的proPO全部轉(zhuǎn)變成PO?？赡懿煌奈锓N中proPO的含量不同，胰蛋白酶作為誘導(dǎo)劑時所需要的濃度不同。本實驗分別用0.1 mg/mL和1 mg/mL胰蛋白酶處理實驗樣品，肝胰臟PO活力均由7.2 U/mL左右升高到22.2 U/mL左右；血細胞均由0.60 U/mL左右升高到3.35 U/mL左右。兩種濃度處理組之間對PO活力變化不顯著(P>0.05)，本實驗最終選擇濃度為0.1 mg/mL的胰蛋白酶作為誘導(dǎo)劑，充分激活proPO，檢測樣品中總的PO活力。

大腸桿菌注射實驗中，無論是否加胰蛋白酶處理，實驗組與對照組的肝胰臟和血細胞的PO活力均無明顯差異；Ah注射實驗中，無論是否加胰蛋白酶處理，實驗組的肝胰臟和血細胞的PO活力在12 h、24 h、48 h明顯高于對照組，可見螯蝦針對致病菌與非致病菌的免疫應(yīng)答機制可能存在差異。Roos等[19]在研究淡水小龍蝦(P.leniusculus)感染致病菌嗜水氣單胞菌和非致病菌大腸桿菌時與本實驗有相似的結(jié)論，文章顯示實驗蝦針對兩種外源細菌的免疫作用機制有差別。其感染非致病菌大腸桿菌后，許多扁平的血細胞組成結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)，結(jié)節(jié)內(nèi)部含有大量死細胞。在一些組織如蝦腮、心臟、肝胰臟以及血竇中有類似的反應(yīng)，從而能阻擋病原侵入機體；當感染致病菌嗜水氣單胞菌后，實驗蝦體內(nèi)并不產(chǎn)生以上免疫反應(yīng)，致病菌在宿主體內(nèi)產(chǎn)生細胞毒素并侵入宿主其他組織內(nèi)，最終導(dǎo)致其死亡率增加。劉振興等[20]在研究嗜水氣單胞菌對螯蝦免疫相關(guān)因子活力的影響時，不加胰蛋白酶處理，檢測血細胞中PO活力，結(jié)果顯示0 h樣品的PO活力為0.27 U/mL左右，實驗組樣品在48 h達到最高值0.37 U/mL左右。本實驗血細胞樣品在不加胰蛋白酶時，0 h PO活力0.30 U/mL左右，最高值在48 h的實驗組達到4.2 U/mL左右，數(shù)據(jù)上有差別，最高點的時間點是一致的，且表現(xiàn)出的變化趨勢與本實驗的結(jié)果相符。

在螯蝦注射WSSV實驗中，無論是否加胰蛋白酶處理，實驗組的肝胰臟和血細胞的PO活力在12、24、48 h明顯高于對照組，可見螯蝦感染W(wǎng)SSV后，在一定時間內(nèi)既能提高現(xiàn)有PO活力，又能提高proPO基因的表達，增加proPO的含量。在淡水小龍蝦(P.leniusculus)中，通過注射dsRNA誘導(dǎo)RNAi抑制proPO的表達，實驗蝦明顯易感染嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，死亡率上升[8]?？梢婒r感染Ah后，PO參與了螯蝦抵抗病菌的免疫反應(yīng)。本實驗WSSV感染螯蝦和Ah感染螯蝦后，其體內(nèi)PO活力的變化規(guī)律相同。由此推測螯蝦感染W(wǎng)SSV后，其體內(nèi)PO也參與了抗病毒的免疫反應(yīng)。至今，甲殼動物感染W(wǎng)SSV后，PO活力測定的實驗結(jié)果不同，可能與物種差異等因素有關(guān)。WSSV感染甲殼動物后，具體的免疫作用方式仍需進一步探索。

總之，本實驗結(jié)果顯示，嗜水氣單胞菌和大腸桿菌感染螯蝦后，PO變化規(guī)律不同，可見螯蝦抵御致病菌和非致病菌的免疫機制不同。螯蝦感染W(wǎng)SSV后，無論是否加胰蛋白酶處理，在一定時間內(nèi)肝胰臟和血細胞的PO活力均顯著高于對照組，且變化規(guī)律與感染Ah的相同，由此推測WSSV感染螯蝦后，其體內(nèi)PO活力發(fā)生變化，參與了抗病毒免疫防御過程。

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(責(zé)任編輯：張紅林)

Phenoloxidase activity ofProcambarusclarkiiinfected by white spot syndrome virus

LI He-shui, ZENG Yong, LUAN Qing

(CollegeofLifeScience,YantaiUniversity,Yantai264005,Shandong,China)

Healthy red swamp crayfish,Procambarusclarkiiwere infected by white spot syndrome virus(WSSV),Aeromonashydrophila, andEscherichiacoli(DH5ɑ) respectively. Phenoloxidase activity in crayfish hemocytes and hepatopancreas were examined from 0～72 h post infection at regular time. The results showed as follows: (1) The difference of PO activity was not significant after treated with trypsin at 0.1 mg/mL and 1 mg/mL. (2) Compared with none trypsin, PO activity ofP.clarkiiwas increased via the trypsin pathway. (3) Whether added trypsin or not, it had the similar characteristics, that the PO activity in WSSV and Ah injection groups were significantly higher than that of the control group after 12～48 h and reached to the top level at 48 h respectively. It finally returned to original level after 72 h; The changes of PO activity were not significant between DH5ɑ experimental and control groups. PO activity ofP.clarkiiwas changed after WSSV infection. We can speculated that PO involved in antiviral immune response ofP.clarkiiin vivo.

White spot syndrome virus;Aeromonashydrophila;Escherichiacoli;Procambarusclarkii; phenoloxidase activity

2016-11-29；

2017-01-18

山東省自然科學(xué)基金(ZR2009DM005)

李賀水(1989- )，女，碩士研究生，專業(yè)方向為水產(chǎn)微生物學(xué)。E-mail: shl2014yd@163.com 通訊作者：曾 勇。E-mail:zy110cn@aliyun.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)02-0030-06