張昌泉++陳飛++洪燃++李錢峰++顧銘洪++劉巧泉

摘要：利用以粳稻日本晴為受體、秈稻9311為供體的經(jīng)全基因組重測序的染色體片段代換系為材料，以水稻耐熱指數(shù)[（常溫結(jié)實率-高溫結(jié)實率）/常溫結(jié)實率]為評價指標，通過比較江蘇揚州2013年大田極端高溫和2012年常溫條件下水稻耐熱性的差異來定位水稻耐熱性QTL （數(shù)量性狀基因座位）。共檢測到3個耐熱性QTL，分別位于第2、第4和第12號染色體上，LOD（logarithm of odds）值分別為2.56、4.02和2.79，貢獻率分別為4.95%、7.99%和544%。其中qHT12.1表現(xiàn)為正向效應，而qHT2.1和qHT4.1表現(xiàn)為負效應。相關(guān)研究為后續(xù)耐熱QTL的精細定位、克隆和高溫鈍感型優(yōu)異品種的培育提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水稻；染色體片段代換系；QTL；耐熱性

中圖分類號： S511.03文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0120-04

收稿日期：2016-09-18

基金項目：國家自然科學基金（編號：31561143008、31401354）；江蘇省自然科學基金（編號：BK20140484）；教育部博士點基金（編號：20133250120001）。

作者簡介：張昌泉（1981—），男，山東即墨人，博士，講師，研究方向為水稻品質(zhì)遺傳改良。Tel：（0514）87937537；E-mail：cqzhang@yzu.edu.cn。

通信作者：劉巧泉，博士，教授，研究方向為水稻品質(zhì)遺傳改良。Tel：（0514）87979242；E-mail：qqliu@yzu.edu.cn。

隨著全球氣候變暖，溫室效應加劇，近幾年全球范圍內(nèi)極端高溫事件發(fā)生頻繁[1]，農(nóng)作物尤其是水稻產(chǎn)量和品質(zhì)受到了嚴重影響[2-3]。研究表明超過水稻最適生長溫度后，溫度平均每上升1 ℃可造成10%的減產(chǎn)[4]。與此同時，溫度的升高也會間接影響氣候變化，從而造成高溫與干旱同時發(fā)生的頻率增加，加重了高溫以及干旱對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)造成的危害。高溫所造成的水稻減產(chǎn)效應主要是通過影響開花期花粉的發(fā)育和授粉行為障礙而造成結(jié)實率顯著下降引起的水稻大幅減產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，水稻穎殼溫度在超過35 ℃的溫度下持續(xù)1 h就能造成花粉活力喪失而不育[5]。因此，鑒定和篩選耐熱性水稻品種資源，定位和克隆耐熱相關(guān)基因或QTL （quantitative trait loci），深入了解水稻耐熱性的分子遺傳調(diào)控機制是解決水稻高溫熱害、應對全球氣候變暖的根本途徑[6]。

近年來在水稻耐熱性方面已有較多的報道，研究表明水稻耐熱性的遺傳基礎(chǔ)復雜，是由多基因控制的數(shù)量性狀。在基因克隆方面，目前只有2個耐熱基因被克隆，如OgTT1所編碼的蛋白酶體α2亞基能夠保護細胞免受熱害[7]。此外，Wang等最近克隆的熱耐生長調(diào)控因子TOGR1能通過調(diào)控rRNA的穩(wěn)定性來忍受熱損傷[8]。水稻抽穗開花期育性相關(guān)的耐熱基因目前尚未有克隆，但已經(jīng)鑒定出一批與抽穗開花期耐熱性相關(guān)的重要QTL位點，盡管理論上通過聚合這些QTL可以提高水稻的耐熱性，但由于定位QTL所用群體的差異以及QTL重現(xiàn)性的原因，這些QTL很難被有效利用。染色體片段代換系是通過多次回交和自交并結(jié)合分子標記輔助選擇技術(shù)建立起來的一套染色體片段導入系，由于遺傳背景單一，在復雜QTL精細定位和克隆方面具有非常強的優(yōu)勢。本研究以1套由粳稻品種日本晴為受體、秈稻品種9311為供體構(gòu)建的經(jīng)過全基因組重測序鑒定基因型的染色體片段代換系（chromosome segment substitution lines，CSSLs）為材料[9]，通過比較該CSSLs群體在2013年揚州大田極端高溫和2012年常溫條件下結(jié)實率的差異來定位水稻耐熱性QTL。相關(guān)研究結(jié)果對于后續(xù)耐熱QTL的精細定位和克隆以及高溫鈍感水稻新品種的培育提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與種植環(huán)境

用于本試驗的材料包括粳稻品種日本晴和秈稻品種9311和以日本晴為受體、9311為供體構(gòu)建的1套包括138個系的染色體片段代換系。該套材料是在實驗室已經(jīng)進行全基因組重測序基礎(chǔ)上繼續(xù)擴建并再次進行全基因組重測序基因分型而得到的遺傳背景清晰的染色體片段代換系，其中，導入片段覆蓋率為95.58%。上述材料分別于2012年和2013年種植于揚州大學試驗農(nóng)場同一試驗田，通過隨機區(qū)組法，每個系種植3個重復，每系40苗。其中9311分2批播種，后續(xù)分析所用9311數(shù)據(jù)為提前批次播種材料（開花期在8月中旬）。

2012年種植的上述試驗材料在水稻抽穗開花期大田氣候相對2013年較為正常。由圖1-A可見，從8月初到8月底，2013年的日最高溫度明顯高于2012年，且都超過30 ℃。與之對應的試驗材料的抽穗開花期大部分位于這一階段（圖1-B、圖1-C）。因此，可以通過2年間大田氣溫的差異來比較分析CSSLs群體對高溫的響應。

1.2試驗方法

1.2.1水稻田間農(nóng)藝性狀調(diào)查與耐熱指數(shù)

CSSLs群體以及雙親的農(nóng)藝性狀調(diào)查包括5項。生育期：通過隨機調(diào)查每個系5株水稻始穗期到播種期的天數(shù)來定義該系的抽穗期；總粒數(shù)：通過隨機選取每個系的6個主穗，計算每穗總粒數(shù)并取平均數(shù)；實粒數(shù)：在調(diào)查總粒數(shù)的同時，統(tǒng)計單個穗上所有充實籽粒之和，取其平均數(shù)；結(jié)實率：單個水稻穗上實粒數(shù)與總粒數(shù)之比，每個系隨機取6個穗，取其平均值。水稻耐熱指數(shù)定義為每個系2012年（常溫）結(jié)實率與2013年（高溫）結(jié)實率的差值除以2012年結(jié)實率，該指數(shù)越小，說明該系耐熱性越好，指數(shù)越大，說明該系耐熱性越差。

1.2.2Bin-map繪制

基于全基因組重測序數(shù)據(jù)，參照 Paran 等[10]的方法，根據(jù)每個系中包含代換片段的差異和在群體中代換片段的區(qū)域重疊，將供體片段人工切割成為一個獨立的重組斷點（Bin），共構(gòu)建了138個代換系的重組斷點圖譜（Bin-Map）圖。通過分析，共得到了367個Bin，Bin的大小范圍在0.01～8.92 Mb之間。

1.2.3數(shù)據(jù)處理和QTL定位

農(nóng)藝性狀的輸入采用Excel軟件完成，基本統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件完成。利用Windows QTL IciMapping 3.3軟件，采用逐步回歸似然比的方法來檢測秈粳稻染色體片段代換系的遺傳效應。將每個Bin計作1個分子標記用于軟件分析。LOD值設(shè)為2.5，Permutation test為1 000，P<0.05，當LOD值>Permutation test值時，即說明該Bin存在1個QTL位點，并可以得到相應的LOD值、貢獻率和效應值。QTL命名遵循McCouch制定的原則[11]。

2結(jié)果與分析

2.1親本及CSSLs群體耐熱性的表現(xiàn)

首先分析了CSSLs群體的親本秈稻9311和粳稻日本晴的耐熱指數(shù)。由表1可見，9311的耐熱指數(shù)為0.048，日本晴的耐熱指數(shù)為0.350，即在高溫條件下，9311的平均結(jié)實率與正常年份相比下降了4.8%，而日本晴下降了35.0%。這說明2親本間耐熱指數(shù)具有極顯著差異，并且日本晴易受環(huán)境高溫影響從而導致結(jié)實率變化過大，耐熱指數(shù)較大，耐熱性不好。與之相反，9311受高溫影響較小，適應性較強，其基因組中可能攜帶有耐熱相關(guān)的QTL或基因。隨后分析了CSSLs群體中不同系的耐熱指數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)群體耐熱性變異幅度非常大，變異系數(shù)為0.550。耐熱指數(shù)從0.026到0.750都有分布，耐熱指數(shù)均值為0.224。從次數(shù)分布（圖2）上來看，耐熱指數(shù)呈現(xiàn)連續(xù)性分布特點，其中雙親位于分布柱狀圖主峰的兩側(cè)，說明耐熱指數(shù)性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，并且CSSLs群體的不同系間差異較大。

2.2耐熱性QTL定位

Map圖譜，并將每一個Bin計作1個分子標記，利用QTL Icimapping V 3.3軟件對耐熱性進行了QTL分析。由表2可見，共檢測到耐熱性QTL 3個，分別位于第2、第4和第12號染色體上。其中qHT2.1被定位在水稻2號染色體上物理位置為470～6.58 Mb之間1.88 Mb的區(qū)間內(nèi)，其表現(xiàn)為負效應，即耐熱性較差，但該位點LOD值偏低。而qHT4.1被定位在水稻第4染色體上1段0.57 Mb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)段較小且效應值相對最大，但同樣為負效應，表現(xiàn)為不耐熱。此外，qHT12.1被定位在第12號染色體上1段1.47 Mb的區(qū)間內(nèi)，其表現(xiàn)為正效應，LOD值為2.79，貢獻率為5.44%，該位點具有較好的耐熱性。

2.3耐熱性QTL穩(wěn)定性分析

盡管基于生育期分析，CSSLs群體抽穗開花期大部分都位于高溫天氣范圍內(nèi)，但也有個別系高溫年份抽穗開花期對應的日最高溫度并不高，因此，重點分析了包含有上述Bin株系的抽穗期和耐熱指數(shù)，發(fā)現(xiàn)這些系的抽穗期都在高溫天氣范圍內(nèi)且耐熱指數(shù)也表現(xiàn)出很好的趨勢，并無矛盾之處。此外，由圖3可見，通過重疊作圖法，qHT2.1在4個系中都有攜帶，且表現(xiàn)出與親本日本晴極顯著的差異。CSSLs群體中有2個系攜帶qHT4.1，與不含有該位點的系N92以及親本日本晴的耐熱指數(shù)同樣存在極顯著差異。耐熱性較強的qHT12.1存在于3個系中，其耐熱指數(shù)與親本日本晴相比也存在極顯著差異。上述結(jié)果表明，這3個檢出的QTL比較可靠且在不同的系中能夠重復檢出。

[FK（W22][TPZCQ3.tif]

3討論與結(jié)論

本研究利用1套經(jīng)全基因組重測序方式獲得的遺傳背景清晰的CSSLs群體為研究材料，利用不同年份間水稻抽穗開花期溫度的差異作為處理，以相對結(jié)實率為耐熱性指標，對CSSLs群體的耐熱性進行了分析。結(jié)果表明，水稻抽穗開花期的耐熱性表現(xiàn)為連續(xù)分布，屬于典型的數(shù)量遺傳性狀。本研究所用的CSSLs群體是在分子標記檢測基礎(chǔ)上構(gòu)建并經(jīng)全基因組重測序方式進行了基因型的鑒定，由于每個株系的遺傳背景和供體染色體片段的長度及位置均已準確獲知，因此，在QTL定位的精確性方面有了很大的提高[9]。利用該套材料，一共鑒定了3個QTL，其中只有qHT12.1具有較好的耐熱性，因此，可以在該區(qū)段內(nèi)開發(fā)分子標記以用于高溫鈍感水稻新品種的培育。另外2個QTL盡管來源于高溫鈍感的秈稻9311，但其表現(xiàn)為不耐熱。因此，在育種利用方面，可以選擇日本晴中對應位點的QTL作為耐熱QTL加以利用。

近年來關(guān)于水稻耐熱性QTL定位的報道已有很多，一般采用秈粳交構(gòu)建的重組自交系進行分析，少數(shù)利用秈秈交群體進行了研究。在耐熱性鑒定方面都是采用在人工氣候室高溫處理的策略，盡管有效控制了溫度和濕度，但只能模擬自然高溫氣候條件，而大田高溫氣候涉及各種因素，其對水稻的熱脅迫尚未有QTL定位研究。本研究利用2013年水稻抽穗開花期的自然極端高溫天氣作為高溫處理，與正常溫度年份作比較，所鑒定的QTL更能真實反映這些位點的耐熱效應。從鑒定結(jié)果來看，檢出的QTL較少，說明了大田環(huán)境的復雜性。從已有的耐熱QTL研究來看，趙志剛等利用低世代回交群體鑒定了3個QTL[12]；陳慶全等利用秈秈交構(gòu)建的重組自交系群體僅檢測到了1個穩(wěn)定耐熱QTL[13]；盤毅等利用重組自交系群體鑒定了2個QTL[14]；劉周等利用秈秈交群體構(gòu)建的BC2F3導入系群體定位到12個耐熱性QTL，其中在第12號染色體上檢測到的qHSI12.1[15]，與本研究中定位到的qHT12.1位置十分接近，且效應也類似，可能是同一個位點；Ye等利用多個群體檢測到3個能重復出現(xiàn)的QTL，并利用近等基因系精細定位了其中的qHTSF4.1[16]，經(jīng)比較，該QTL盡管位于4號染色體，但并不與本研究中的qHT4.1重合。本研究中另外鑒定到的2個位點都與已知的不重合，可能是新的位點。綜上所述，盡管目前幾乎在每一條染色體上都有QTL被檢測到，但多數(shù)耐熱性QTL的遺傳效應較小且在不同的品種中差異很大，暗示了抽穗期耐熱性的遺傳機制非常復雜，為相關(guān)基因的精細定位和克隆造成了很大困難。

隨著水稻耐熱性研究的不斷深入，耐熱水稻資源的挖掘和有利耐熱QTL的鑒定和利用是當下水稻耐熱性改良的重要研究方向[6]。盡管已有很多QTL被鑒定出來，但QTL定位的精度和穩(wěn)定性多數(shù)需要進一步驗證，只有少數(shù)QTL如qHTSF4.1可能比較有利用價值。當然，已經(jīng)克隆的耐熱基因如OgTT1和TOGR1更是后續(xù)育種利用的重要基因資源。本研究中定位到的3個QTL由于所在株系遺傳背景清晰，效應也比較明確，尤其是qHT4.1的定位區(qū)間非常小，為后續(xù)QTL精細定位和克隆奠定了很好的基礎(chǔ)。對于qHT12.1，由于其表現(xiàn)為耐熱性，因此可以以此為供體，用于耐熱粳稻新品種的改良。

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