余垚穎，劉金丹，郭應菊，楊 雪，王明富*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)技術推廣總站，四川 成都 610041)

SSR標記技術在水稻抗稻瘟病研究中的應用

余垚穎1，劉金丹2，郭應菊1，楊 雪1，王明富1*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)技術推廣總站，四川 成都 610041)

稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的世界三大病害之一。微衛(wèi)星 DNA分子標記為輔助選育抗稻瘟病水稻新品種和抗性鑒定提供了新的方法和手段。本文闡述SSR對稻瘟病研究的作用，介紹 SSR的機理和方法。

稻瘟病；SSR分子標記；微衛(wèi)星DNA序列；基因

水稻是我國最重要的糧食作物，我國水稻面積約占糧食作物總面積的30 % ，產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)的40%，我國50%以上的人口以稻米為主食。但是，隨著水稻高產(chǎn)栽培措施的推廣，稻瘟病已成為水稻生產(chǎn)的主要障礙，是水稻生產(chǎn)中最嚴重的病害。水稻稻瘟病的爆發(fā)嚴重影響我國的水稻產(chǎn)量，在流行年份重病地區(qū)每年都會造成水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴重的地區(qū)損失達40%～50%，局部田塊甚至顆粒無收[1]。SSR標記是近年來發(fā)展起來的建立在PCR基礎上的DNA分子標記，由于其具有多態(tài)性高、易于檢測及結果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，在水稻抗稻瘟病育種方面得到了廣泛的應用。本研究對SSR標記的原理和方法及其對水稻抗稻瘟病研究的作用進行了綜述，以期為選育出抗稻瘟病的水稻新品種提供科學依據(jù)。

1 SSR分子標記原理及特點

遺傳標記是指可以追蹤染色體的某一節(jié)段、某個基因或某一特定DNA序列在家系中傳遞軌跡的任何一種遺傳特性。微衛(wèi)星DNA序列[2,3]又稱簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)，也是DNA分子標記的一種，是一類由幾個(多為1～5個)堿基組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA串聯(lián)重復序列，其長度一般較短，大約在300bp以內(nèi)，且廣泛布于基因組的不同位置，如(CA)n，(AT)n，(GG C)n等重復。目前微衛(wèi)星已經(jīng)廣泛應用于植物圖譜構建、基因定位、物種進化與分類、品種遺傳多樣性、品種保護、親子分析與純度鑒定、雜種優(yōu)勢機理及預測、分子標記輔助育種等研究領域[4，5]?？偟膩碚f，SSR標記之所以為當前研究者青睞，主要在于它具備以下特點及優(yōu)點[6，7]：①數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組。對水稻基因組文庫的研究表明，水稻基因組中估計有5700～10000個微衛(wèi)星[8]。②多態(tài)性高，等位位點多，信息含量豐富。③通常為共顯性遺傳，可以很好的解決雜合體帶來的假陽性問題。④試驗操作簡單，對DNA數(shù)量和質(zhì)量要求不高。⑤重復性、穩(wěn)定性較好，微衛(wèi)星位點的突變率小于10-4，在多態(tài)性與穩(wěn)定性間有了一個很好的平衡。

近年來SSR標記已經(jīng)成為植物遺傳圖譜構建、基因定位、物種進化與分類、品種遺傳多樣性、品種保護、親子分析與純度鑒定、雜種優(yōu)勢機理及預測、分子標記輔助育種等研究領域中重要的分子標記[9，10]。目前，在大麥[11]、水稻[12]、玉米[13]、擬南芥[14]等植物中有較多應用。但是在病原菌中，尤其在稻瘟病菌中，SSR引物的開發(fā)相對較晚，有關SSR應用的報道也較少。

2 分子標記在水稻抗稻瘟病研究中的應用

2.1 抗稻瘟病基因SSR標記的方法

尋找與抗稻瘟病基因緊密連鎖的SSR標記主要有2種方法：分離群體分組分析法(Bulked Segregant Analysis , BSA)和利用近等基因系分析法(Near-isogenic Lines)。目前，已鑒定出40多個稻瘟病抗性主效基因位點[15,16]，并分別被定位到水稻除第3條染色體外的11條染色體上，而以SSR標記為基礎的水稻遺傳連鎖圖基本上已經(jīng)覆蓋了水稻基因組的所有區(qū)域。因此，利用SSR標記篩選和定位抗稻瘟病基因，具有其獨特的優(yōu)勢。福建農(nóng)林大學作物科學學院的陳志偉等[17]在廣譜的抗稻瘟病基因Pi-2(t)的附近篩選到了1個新的SSR標記SRM24，并利用該標記成功地將Pi-2(t)從供體材料“5173”導入到迄今為止廣泛使用的雄性不育保持系“珍汕97B”中，獲得了Pi-2(t)的“珍汕97B”近等基因系。

2.2 分子標記在抗稻瘟病研究中的作用

稻瘟病是植物-病原物相互作用的模式系統(tǒng)，其抗病性不單與水稻品種本身的基因型有關，亦與病原菌的基因型相關。稻瘟病菌的易變性和群體結構的復雜性是水稻品種稻瘟病抗性易喪失的根本原因之一，因此全面準確地掌握育種地區(qū)稻瘟病病原菌的結構及其演化變異規(guī)律，是開展水稻稻瘟病持久抗性育種必不可少的工作內(nèi)容。已有的初步研究結果表明，病原真菌中的SSR一般都有2～5個等位位點，不但可用于種群遺傳多樣性、近緣種的比較及系譜研究[17]，而且還可用于不同寄主分離物之間的比較[18]，或是菌株、小種之間的比較[19]。因此，利用稻瘟病菌基因組中數(shù)量豐富、分布廣泛的SSR標記，能夠為群體研究提供大量遺傳信息。

水稻品種的抗病性之所以容易喪失，關鍵在于品種或抗源的單一化。通過聚合雜交，累積多個抗病基因于同一材料，培育出多抗品種，是避免或減緩水稻品種抗性喪失的一種有效途徑。SSR標記對抗稻瘟病研究起到十分重要的作用，為抗病基因的聚合提供了一種有效的工具。陳志偉等[19]利用與抗病基因緊密連鎖的序標位STS及SSR標記OSR20、OSR32、RM213、RM207、RM262，跟蹤篩選了抗稻瘟病基因，將Pi-d(t)1、Pi-b、Pi-ta2聚合于G46中，在相對較短的時間內(nèi)，培育出了抗多個生理小種的相對持久的抗病品系，對利用分子標記進行多個抗病基因的輔助選擇提供了有實用價值的實證。

3 展望

分子生物學的發(fā)展，大大推進了水稻抗瘟性遺傳研究的進程。迄今已定位出了50多個主效抗瘟基因和一批抗性QTL位點，開發(fā)出大量與抗性基因緊密連鎖的分子標記，利用稻瘟病菌基因組中數(shù)量豐富、分布廣泛的SSR標記，能夠為群體研究提供大量遺傳信息。歷來稻瘟病病菌的變異機制、品種抗性“喪失”機理和品種抗性持久化問題一直是困繞抗瘟育種工作者的3大難題。水稻品種的抗病性之所以容易喪失，關鍵在于品種或抗源的單一化。通過聚合雜交，累積多個抗病基因于同一材料，培育出多抗品種，是避免或減緩水稻品種抗性喪失的一種有效途徑。SSR標記對抗稻瘟病研究起到十分重要的作用，為抗病基因的聚合提供了一種有效的工具。隨著人們對SSR標記技術的不斷完善，將會篩選出更多的與抗稻瘟病基因緊密連鎖的SSR標記。新的抗性基因標記的出現(xiàn)，可為水稻抗稻瘟病遺傳育種工作提供更有利的輔助工具，將大大加快抗稻瘟病水稻品種輔助選育的進程。

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2017-02-27

四川省科技支撐(2014NZ0097)

余垚穎(1985-)，女，四川米易人，助理研究員，碩士，主要從事植物病害與營養(yǎng)研究。E-mail：kellyyyzsj@163.com。*為通訊作者。