鄭海玲/廣東省汕頭市潮南區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

影響禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)的因素及對策

鄭海玲/廣東省汕頭市潮南區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

HA-HI作為全球流感監(jiān)測的常用試驗(yàn)方法可以用于鑒定流感病毒分離株HA亞型，也可以對禽血清中是否存在抗原亞型相同的免疫抗體進(jìn)行檢測。這種方法操作簡單、方便、靈敏度高，在基層動(dòng)物防疫部門得到廣泛應(yīng)用。但是很多因素會導(dǎo)致HA-HI試驗(yàn)結(jié)果失真，難以取得預(yù)期檢測效果，下面將對相關(guān)影響因素與對策具體探究。

一、處理與保存血清

1.溶血。很多因素影響下會使溶血形成，比如，注射器清潔不當(dāng)，容器不干燥或者受到污染；穿刺方法不正確，損傷了組織；長時(shí)間的淤血；過快的抽血速度；將血液向容器中注入，未能將針頭取下或者過快的注入速度使大量泡沫產(chǎn)生，久而久之會形成溶血；過于劇烈的震蕩，這些都需要在操作中格外注意?？梢栽诓裳獣r(shí)應(yīng)用一次性注射器，讓血清在注射器中自然析出，可以降低溶血發(fā)生率。

2.血清分離。采集完的血液呈45～60o角于室溫（20℃～25℃）下放置約2～3h即可分離出血清，條件允許時(shí)可先將采好的血液呈45～60o角于4℃冰箱放置約1h，然后用低速離心機(jī)離心3～5min，轉(zhuǎn)速為3000～5000轉(zhuǎn)。

3.膠凍樣血清。在采集血樣中，因?yàn)檠褐写嬗羞^多脂肪會出現(xiàn)膠凍樣血清，處理這種血清的方法是應(yīng)用干凈的玻璃棒或者塑料棒挑起膠凍樣的血清，在管壁上擠壓，直到膠凍樣消除為止，然后快速離心，這樣可以快速獲得檢測用的血清樣。

4.保存血清。血清通常在冰箱中冷藏，5℃為適宜溫度。如果檢測用的樣品需要保存1周，需要放置冷凍箱中。保存好的血清一定要做好標(biāo)記與封閉處理，避免弄混。有的血清樣品需要反復(fù)檢測，就需要多次凍融，這樣將難以確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確。有研究人員將30份抗體水平較高的血清作為試驗(yàn)樣本，分為①組、②組和③組，①組為被檢測血清反復(fù)凍融，②組為檢測抗原，也反復(fù)凍融，③組為對照組。3組均做血凝抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示：①組抗體水平較對照組低1個(gè)滴度，②組抗體水平較對照組低2個(gè)滴度。由此，反復(fù)凍融會影響到檢測結(jié)果，盡量確保樣品反復(fù)凍融次數(shù)低于5次，必要時(shí)可分裝血清樣品。

二、選用器材

1.微量血凝板?？梢灾貜?fù)使用微量血凝板，也可以使用一次性的塑料反應(yīng)板，有機(jī)反應(yīng)板如果清理不當(dāng)或者出現(xiàn)破損會使試驗(yàn)精度降低，由此，在使用反應(yīng)板過程中按照規(guī)定步驟與清洗程序清理，一旦發(fā)現(xiàn)有機(jī)反應(yīng)板磨損或者破損需停止使用。而應(yīng)用一次性塑料反應(yīng)板則可以不用反復(fù)清洗，也不會出現(xiàn)磨損問題。

2.微量移液器。多道與單道微量移液器是兩種類型，在使用微量移液器之前需要鑒定或者校正，按照標(biāo)準(zhǔn)方法使用微量移液器，一定要牢固安裝吸頭，避免安裝后出現(xiàn)脫落、漏氣等情況，用手按壓時(shí)力度需要恰當(dāng)、均勻，液體吸取時(shí)需要緩慢進(jìn)行，然后再緩慢的松開；吸頭管嘴浸入到液面的深度也要控制好，這樣可以將誤差盡量減少。

3.吸頭。非一次性吸頭需要徹底清洗干凈，可使用高溫滅菌法或者超聲波清洗法，使吸頭保持無菌狀態(tài)，當(dāng)前，一次性吸頭使用較多，但是也要檢查好質(zhì)量，在使用微量移液器時(shí)，確保安裝的吸頭管嘴是齊平的。

三、試驗(yàn)操作

1.緩沖液?？梢詫?pH=7．2、0．01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為稀釋液，現(xiàn)用現(xiàn)配，盡量不使用生理鹽水替代緩沖液。

2. 1%紅細(xì)胞懸液。紅細(xì)胞懸液的配制應(yīng)用公雞2只或2只以上，通常選擇的公雞無禽流感與其他疫病，如果選用免疫公雞，需要適當(dāng)將洗滌次數(shù)與時(shí)間增加，且在紅細(xì)胞洗滌時(shí)將表面白細(xì)胞膜去除，不然將對紅細(xì)胞敏感度造成影響。血清來源相同的禽種紅細(xì)胞作為試驗(yàn)血清的來源較為合適，可以將非特異情況消除。

3. 4個(gè)血凝單位抗原。血凝試驗(yàn)先將抗原作為試驗(yàn)對象，抗原效價(jià)則為抗原與紅細(xì)胞完全凝集的孔，再按照抗原效價(jià)，將4個(gè)血凝單位抗原配比成，現(xiàn)用現(xiàn)配，可減少浪費(fèi)與污染，不能反復(fù)凍融，也不能放置在常溫下超過5 h。為了確保4個(gè)血凝單位抗原配制準(zhǔn)確，可開展回歸試驗(yàn)在HI試驗(yàn)前。

4.加樣。試驗(yàn)過程中將需要檢測的血清、4個(gè)血凝單位抗原以及PBS加入，還要加入1%紅細(xì)胞懸液。在加樣過程中，需要在使用抗原與紅細(xì)胞前搖晃均勻，這樣才能使每個(gè)孔中的濃度是相同的，提高試驗(yàn)精度。不能讓吸頭碰觸到U型或者V型板孔，這是預(yù)防交叉污染的重要一步。可以在U型或者V型板底部加樣加物，不能在孔壁上方加樣，還要防止?jié)B出；血清倍比稀釋時(shí)，不能將移液器的吸頭隨意調(diào)整，始終保持在液面中，避免產(chǎn)生氣泡，保證移液量的準(zhǔn)確。

四、結(jié)果判定

20℃～28℃的溫度下經(jīng)過10～25 min就可以將抗原效價(jià)與血清抗體滴度讀出，在對結(jié)果判讀時(shí)，可以適當(dāng)傾斜微量反應(yīng)板，傾斜角度為45°左右，凝集完全抑制的表現(xiàn)為：孔底沉淀紅細(xì)胞流淌呈淚珠狀，邊緣沒有凝集顆粒聚集。

綜上所述，禽流感血凝與血凝抑制試驗(yàn)，需要充分考慮以上諸多影響因素，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范進(jìn)行，才能為科學(xué)防控禽流感提供準(zhǔn)確依據(jù)。

（略）