張玲， 阿衣古麗·哈熱， 霍東杰， 阿不力克木江·阿迪力，張瑾熔

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊 830011)

新輔助放化療前后局部中晚期直腸癌組織中Lgr5蛋白的表達(dá)變化及其意義

張玲， 阿衣古麗·哈熱， 霍東杰， 阿不力克木江·阿迪力，張瑾熔

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊 830011)

目的觀察新輔助放化療前后局部中晚期直腸癌組織中富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白耦聯(lián)受體(Lgr5)蛋白的表達(dá)變化，并探討其對(duì)新輔助化療療效的預(yù)測(cè)作用。方法初治Ⅱ、Ⅲ期直腸癌患者87例，先接受腸鏡活組織檢查，然后接受新輔助放化療，之后接受手術(shù)治療并于術(shù)中留取腫瘤組織；采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)活檢組織及術(shù)中留取的腫瘤組織中的Lgr5蛋白。結(jié)果新輔助放化療前Lgr5 蛋白在直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為78.16%,新輔助放化療后即術(shù)中留取腫瘤組織中Lgr5蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為29.89%，兩者相比，Plt;0.05；Lgr5 蛋白在直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)(r= 0.173，Plt;0.05)，與新輔助放化療后的腫瘤病理緩解程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.333，Plt;0.05)。結(jié)論Lgr5蛋白在中晚期直腸癌組織中有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，腫瘤浸潤(rùn)越深Lgr5蛋白表達(dá)越多，其可能與直腸癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)；新輔助放化療后Lgr5蛋白的陽(yáng)性表達(dá)減少，且其表達(dá)與新輔助放化療后的腫瘤病理緩解程度有關(guān)，可作為評(píng)價(jià)新輔助放化療療效的參考指標(biāo)。

富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白耦聯(lián)受體；新輔助放化療；直腸腫瘤；直腸癌

結(jié)直腸癌是全球第三大常見癌癥,僅次于肺癌和乳腺癌。在2012年全球確診的136萬(wàn)例結(jié)直腸癌患者中，中國(guó)新發(fā)病例25.3萬(wàn)例(占18.6%)[1～3]。從 2009 年起 NCCN 推薦，除非有治療禁忌，對(duì)于局部中晚期(Ⅱ～Ⅲ期，TNM分期為T3～T4期或N+M0期)直腸癌，均采取新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)的綜合治療方法進(jìn)行治療[4]。但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，不同患者對(duì)新輔助放化療的療效差異較大，部分患者甚至存在放療抵抗。若不能準(zhǔn)確區(qū)分何種患者可從術(shù)前新輔助放化療中獲益，直腸癌個(gè)體化治療就難以實(shí)現(xiàn)。因此，目前急需可預(yù)測(cè)新輔助放化療療效的指標(biāo)。富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白耦聯(lián)受體(Lgr5)是一種腸干細(xì)胞分子標(biāo)志物，其在卵巢癌[5]、惡性膠質(zhì)瘤[6]、胃癌[7]中高表達(dá)，可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化和惡性轉(zhuǎn)化，與腫瘤病情進(jìn)展有關(guān)[8]。本研究觀察了新輔助放化療前后局部中晚期直腸癌組織中Lgr5蛋白的表達(dá)變化，并探討其對(duì)新輔助化療療效的預(yù)測(cè)作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年1月～2016年2月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的初治直腸癌患者87例，男61例，女26例；年齡34～79歲。患者先接受腸鏡活組織檢查，然后接受新輔助放化療，之后接受手術(shù)治療并于術(shù)中留取腫瘤組織。所有患者術(shù)前及術(shù)后有明確病理診斷。接受新輔助放化療前，腫瘤浸潤(rùn)深度為T3者51例、T4者36例，組織學(xué)分級(jí)為高分化腺癌26例、中分化腺癌31例、低分化腺癌30例。接受新輔助放化療前，根據(jù)檢查結(jié)果，參照UICC 第7版的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期Ⅱ期58例、Ⅲ期29例。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其授權(quán)人知情簽字。

1.2 直腸癌組織中Lgr5蛋白的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。兔多克隆抗體Lgr5試劑盒、 SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。受檢標(biāo)本置10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。標(biāo)本切片免疫組織化學(xué)染色：①脫蠟脫水處理：標(biāo)本切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min， 而后放入階梯無(wú)水乙醇、95%乙醇、75%乙醇中各5 min，PBS浸泡10 min; ②去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性：將標(biāo)本切片放入3% H2O溶液10 min，PBS沖洗3次(每次5 min);③抗原修復(fù)：在Tris-EDTA(pH 9.0)溶液中進(jìn)行抗原熱修復(fù)(置92～98 ℃微波爐內(nèi)20 min)，冷卻至室溫后用PBS沖洗3次(每次3 min)；④加一抗：分別滴加Lgr5抗體，然后置4 ℃冰箱孵育24 h，37 ℃溫箱復(fù)溫15 min， PBS沖洗3次(每次3 min)；⑤加二抗 ：方法同上。 DAB顯色：采用1∶50的DAB顯色 ，于鏡下觀察染色程度，染色滿意后封片。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，鏡下觀察判斷。光鏡下觀察Lgr5蛋白呈黃色或棕褐色顆粒。高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇 10個(gè)視野，進(jìn)行視野內(nèi)腺體細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算Lgr5蛋白陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。結(jié)果判定采用雙盲法，由2位病理科醫(yī)師對(duì)染色結(jié)果復(fù)閱核定。根據(jù)顯色細(xì)胞的比例計(jì)分: 顯色細(xì)胞 lt;10%計(jì)0分， 顯色細(xì)胞10% ～20%計(jì)1分，顯色細(xì)胞21%～50%計(jì)2分，顯色細(xì)胞 gt;50%計(jì)3分。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分: 細(xì)胞無(wú)顯色計(jì)0分，細(xì)胞淺黃色計(jì)1分，細(xì)胞棕黃色計(jì)2分，細(xì)胞黃褐色計(jì)3分。上述兩種計(jì)分的乘積≤2為陰性、≥3～lt;6為弱陽(yáng)性、≥6為強(qiáng)陽(yáng)性；弱陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性均判為陽(yáng)性。

1.3 直腸癌新輔助放化療后腫瘤病理退縮分級(jí)的判斷 由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師根據(jù)Dworak'S腫瘤退縮分級(jí)(TRG)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)新輔助放化療后手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估，并分為5級(jí)：TRG0級(jí)(腫瘤無(wú)消退，腫瘤細(xì)胞無(wú)變化)，TRG1級(jí)(腫瘤輕微消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，但纖維化不超過(guò)腫瘤的25%)，TRG2級(jí)(腫瘤中度消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，纖維化占26%～50%)，TRG3級(jí)(腫瘤消退良好，纖維化細(xì)胞長(zhǎng)出腫瘤外并占50%以上)，TRG4級(jí)(腫瘤完全消退，已經(jīng)完全找不到腫瘤細(xì)胞，僅見纖維組織)。TRG0、TRG1、TRG2級(jí)為低度病理緩解組，TRG3、TRG4級(jí)為高度病理緩解組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)和 Fisher 精確概率法，相關(guān)性分析用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析法。Plt;0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

87例患者中，新輔助放化療前的直腸癌組織Lgr5蛋白陰性19例、陽(yáng)性68例(Lgr5蛋白陽(yáng)性者的胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒沉積，顏色較深)，陽(yáng)性表達(dá)率為78.16%。新輔助放化療后的直腸癌組織(即術(shù)中留取的腫瘤組織，下同)Lgr5蛋白陰性61例、陽(yáng)性26例(Lgr5蛋白陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒沉積，顏色較淺)，陽(yáng)性表達(dá)率為29.89%，其中44例由新輔助放化療前的陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性。新輔助放化療前后的Lgr5蛋白陽(yáng)性表達(dá)率相比，χ2=4.348，Plt;0.05。

新輔助放化療前直腸癌浸潤(rùn)深度為T3者51例、T4者36例，其Lgr5蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)者分別為33、35例(兩者相比，χ2=13.072，Plt;0.01)，新輔助放化療后其Lgr5蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)者分別為9、17例(兩者相比，χ2=8.809，Plt;0.05)；Lgr5 蛋白在直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)(r=0.173，Plt;0.05)。不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤病理分期的直腸癌患者腫瘤組織中Lgr5 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)相近(P均gt;0.05)。

87例患者中，經(jīng)新輔助放化療后進(jìn)入低度病理緩解組50例，其中新輔助放化療前直腸癌組織中Lgr5蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)者45例；經(jīng)新輔助放化療后進(jìn)入高度病理緩解組37例，其中新輔助放化療前直腸癌組織中Lgr5蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)者23例；新輔助放化療前直腸癌組織中Lgr5蛋白表達(dá)與新輔助放化療后腫瘤病理緩解程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.333，Plt;0.05)。

3 討論

腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要根源在于腫瘤干細(xì)胞無(wú)限制增殖并對(duì)放化療存在抵抗性，使干細(xì)胞逃脫一般治療對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤治療失敗[9，10]。因此，除了殺死已增殖成熟的腫瘤細(xì)胞外，通過(guò)特異性靶向治療徹底消滅腫瘤干細(xì)胞成為穩(wěn)定甚至是治愈惡性腫瘤的關(guān)鍵[11，12]。

Lgr5于1998年首次被發(fā)現(xiàn)[13]。最初發(fā)現(xiàn)Lgr5廣泛表達(dá)于肌肉、胎盤、腦和脊髓組織中，其與卵泡刺激激素、促黃體生成激素和促甲狀腺激素受體密切相關(guān)[14]。近期研究[15～19]結(jié)果顯示，Lgr5在肝癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、基底細(xì)胞癌和食管腺癌中均處于高水平表達(dá)。 本研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5蛋白在87例直腸癌中陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)78.16% (68/87) ，提示 Lgr5 與直腸癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，新輔助放化療后直腸癌癌組織中Lgr5蛋白染色由之前顏色較深轉(zhuǎn)為較淺甚至轉(zhuǎn)陰，表明直腸癌組織中Lgr5 蛋白的表達(dá)強(qiáng)度在新輔助放化療后顯著降低。這種變化結(jié)果可能與放化療降低了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，進(jìn)而抑制了下游靶基因Lgr5的表達(dá)有關(guān)。有學(xué)者[20,21]研究發(fā)現(xiàn)，治療前結(jié)直腸癌患者癌組織中 Lgr5 蛋白的表達(dá)與腫瘤的TRG分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，即新輔助放化療前直腸癌組織中Lgr5蛋白表達(dá)越強(qiáng)，放化療后腫瘤病理緩解程度越小，與本研究結(jié)果一致。

總之， 本研究發(fā)現(xiàn)Lgr5蛋白在中晚期直腸癌組織中有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，腫瘤浸潤(rùn)越深Lgr5蛋白表達(dá)越多，其可能與直腸癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)；新輔助放化療后Lgr5蛋白的陽(yáng)性表達(dá)減少，且其表達(dá)與新輔助放化療后的腫瘤病理緩解程度有關(guān)。通過(guò)對(duì)直腸癌患者新輔助放化療前瘤組織Lgr5蛋白檢測(cè)，可以預(yù)測(cè)新輔助放化療的效果或協(xié)助判斷是否需要實(shí)施新輔助放化療，避免無(wú)效、過(guò)度治療。由于本研病例數(shù)較少、觀察指標(biāo)單一，結(jié)果可能存在一定偏差，仍需要大樣本研究證實(shí)。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.025

R735.3

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1002-266X(2017)43-0080-03

新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳青年科技人才專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(2014Y24)。

張瑾熔(E-mail： zjr8043@163.com)

2017-06-30)