李 健綜述，曾小平審校

(1、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西南昌330006；2、宜春市人民醫(yī)院檢驗科，江西宜春336000)

HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因耐藥變異的研究現(xiàn)狀

李 健1，2綜述，曾小平1審校

(1、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西南昌330006；2、宜春市人民醫(yī)院檢驗科，江西宜春336000)

乙型肝炎病毒是最容易產(chǎn)生基因變異的病毒之一，不僅自然變異率較高，而且抗病毒藥物和免疫因素可誘導(dǎo)其產(chǎn)生適應(yīng)性變異。乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的基因變異可導(dǎo)致其對核苷（酸）類似物產(chǎn)生耐藥性。檢測乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因變異不但可以發(fā)現(xiàn)和研究新的耐藥變異位點，還可為臨床治療乙肝患者時選擇合適抗病毒藥物、耐藥監(jiān)測、預(yù)后提供參考。但不同的檢測方法有各自的特點，可根據(jù)實際情況選擇合適的方法運用于臨床實踐或科學(xué)研究。

乙型肝炎病毒；HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)；核苷（酸）類似物；耐藥變異

我國是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染高流行區(qū)域[1]，一般人群HBV表面抗原（HB-sAg）的攜帶率為7.18%；慢性HBV感染者約9300萬人，慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年死于HBV感染所致疾病50余萬人[2，3]。目前抗HBV藥物除干擾素外，另一類為核苷（酸）類似物（nucleoside analogues，NAs），主要包括：拉米夫定（Lamivudine，LAM）、阿德福韋酯（Adefovirdipivoxil，ADV）、恩替卡韋（Entecavir，ENV）、替比夫定（Telbivudine，LdT）等。NAs其進(jìn)入機(jī)體后，形成三磷酸活性成分與機(jī)體天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競爭結(jié)合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA鏈合成終止，這是核苷（酸）類似物抑制HBV復(fù)制的機(jī)制[4]。NAs抗病毒療效顯著、副作用少、價格經(jīng)濟(jì)，因而廣泛應(yīng)用于臨床乙型病毒性肝炎抗病毒治療，但隨著用藥人群基數(shù)增大和用藥時間延長其耐藥問題逐漸凸顯。本文就HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因變異與NAs耐藥的耐藥機(jī)制、變異位點、變異模式、耐藥變異的檢測等做一綜述。

1 HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因變異導(dǎo)致核苷（酸）類似物耐藥的機(jī)制

乙型肝炎病毒發(fā)生基因變異特別是HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（也可稱P區(qū)、聚合酶區(qū)）的基因變異，導(dǎo)致產(chǎn)生的HBV聚合酶與核苷（酸）類似物結(jié)合力降低，那么變異的HBV即不受核苷（酸）類似物的抑制或抑制能力下降，因此，在繼續(xù)應(yīng)用核苷（酸）類似物治療的情況下，野生株病毒因?qū)塑眨ㄋ幔╊愃莆锩舾卸^續(xù)被抑制，變異株病毒因具備一定的復(fù)制能力，而且對核苷（酸）類似物不敏感而逐漸代替野生株，成為體內(nèi)的優(yōu)勢株，從而導(dǎo)致患者對于核苷（酸）類似物的耐藥[4]。耐藥變異的產(chǎn)生一方面是在分子結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生了影響HBV聚合酶表達(dá)的基因變異；另一方面耐藥變異株和野生株的共生生態(tài)的變化，耐藥變異株要能夠持續(xù)的復(fù)制增殖達(dá)到一定的數(shù)量水平成為所謂的優(yōu)勢株，并表現(xiàn)出耐藥的臨床表現(xiàn)。然而目前并沒有足夠的研究明確優(yōu)勢株在準(zhǔn)種池的比例，再者不同的HBV基因變異檢測方法能檢出的變異株的敏感性也存在明顯的差異[5，6]，需要進(jìn)一步研究HBV基因變異的未知位點和變異模式、變異株的拷貝數(shù)、變異株在準(zhǔn)種池內(nèi)的比例與耐藥的關(guān)系[7]。

1.1 HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因變異的類型

1.1.1 自然變異乙肝病毒基因組（HBV-DNA）含有3200個核苷酸，其中HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)有344個核苷酸，據(jù)統(tǒng)計HBV核苷酸錯配率約為10-5左右，HBV每天約可產(chǎn)生至少1012個病毒[8]，那么HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)就可產(chǎn)生109的堿基錯配，如此高的自然變異是耐藥變異的基礎(chǔ)[9]。

1.1.2 選擇壓力下的適應(yīng)變異HBV有很高的自然變異，變異隨著病毒不斷增殖而積累，在免疫因素和抗病毒藥物施加的選擇壓力下，不能適應(yīng)選擇壓力的變異被抑制，能適應(yīng)這些選擇壓力的變異株就有可能成為優(yōu)勢株而導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。

1.2 抗病毒藥物的效果影響耐藥變異株的產(chǎn)生HBV變異的積累依賴于乙肝病毒超強(qiáng)的復(fù)制和增殖，如果抗HBV藥物有很強(qiáng)的抗病毒能力而迅速抑制了病毒的復(fù)制，耐藥變異就很難產(chǎn)生。如果抗HBV藥物抗病毒能力很弱，就無法對病毒形成選擇壓力，那么適應(yīng)藥物的耐藥變異也很難被篩選出來。中等抗病毒效果的藥物治療下既能形成選擇壓力又不能完全抑制病毒復(fù)制，最有利于耐藥變異株的產(chǎn)生。

1.3 影響HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因耐藥變異的其它因素基因屏障是控制出現(xiàn)表型耐藥的耐藥基因變異的位點數(shù)目。高基因屏障藥物需要病毒出現(xiàn)多個位點的基因變異才可能出現(xiàn)耐藥，因而高基因屏障的耐藥率低，抗病毒藥物聯(lián)合用藥可以提高基因屏障[10]。HBV的復(fù)制空間是指肝臟中更新的肝細(xì)胞為cccDNA或新的復(fù)制模板提供的空間。正常肝細(xì)胞更新較慢，但肝臟在嚴(yán)重的炎癥損傷下肝細(xì)胞更新很快，耐藥變異株可以利用這些變異空間進(jìn)行大量復(fù)制。另外影響乙肝患者臨床抗病毒藥物治療效果相關(guān)的因素如用藥史、依從性、遺傳、年齡等也間接與耐藥變異相關(guān)[11，12]。

2 HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)常見NAs耐藥變異位點和變異模式

2.1 耐藥變異位點HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)長度為344個氨基酸殘基，N端第1個氨基酸E(谷氨酸)為起點，以rt1－rt344來命名。目前已發(fā)現(xiàn)的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥變異位點有：L80V/I、V84M、S85A、L108M、L164V、I169T、V173L/M/I、L180M、A181T/V /S、T184G/A/I/S/M、L187I、I190V、A194N/T、V198L、A200V、S202I/G、M204V/L/S、L/M/V207I、S213T、Q214 A/E、Q215s、L217R、S219A、F221Y、rtA222T、A223S、L229V/W、I233V、1、N234T、N236T、N238H、M250V、S256C/G、T259A、D263E、L267Q、L269I、Q271E、P28 lL[13，14]。不同種類NAs耐藥與HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)相關(guān)變異位點不盡相同。拉米夫定耐藥相關(guān)變異位點主要有rtM204I/V/S、rtL180M、rtV173L/M/I、rtL180M、rtA181T/V/S、rtI169T、rtQ215S等，以rtM204I/V最常見；阿德福韋酯耐藥相關(guān)變異位點主要有：rtN236T、rtA181S/T/V；恩替卡韋耐藥相關(guān)變異位點為rtI169T、rtL180M、rtT184S/A/I/L/F/G、rtS202I/G、rtM 204V、rtM250V，以rtTl84G/S/A/C位點變異常見；替比夫定耐藥變異有rtM204I、rtAl94T等[13－21]。

2.2 耐藥變異模式與拉米夫定耐藥相關(guān)常見的耐藥模式有rtM204I/V、rtM204V＋rtL180M、rtM204V＋rtL180M＋rtV173L[17，18]，拉米夫定耐藥相關(guān)突變中，rtM204V通常伴隨rtL180M，rtM204I多單獨出現(xiàn)[17]；阿德福韋酯耐藥相關(guān)常見的耐藥模式有rtA181T/V、rtN236T、rtA181T/V+rtN236T。NAs序貫治療容易發(fā)生基因耐藥變異且易發(fā)生多位點變異。檢測出多位點組合變異模式，往往提示可能出現(xiàn)多種NAs耐藥，如出現(xiàn)rtAl8lT/V+rtM204V/I變異模式，可導(dǎo)致對拉米夫定和阿德福韋酯均耐藥；當(dāng)恩替卡韋與拉米夫定、阿德福韋酯存在交叉耐藥，變異模式有rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+rtM204V/I，rtLl80M+rtS202G/I+rtM204V/I，rtLl80M+rtM204V/I+ rtM250V，rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+rtM204V/I+ rtM250V，rtVl73L+rtM204V/I+rtM250V，rtVl73L+ rtLl80M+rtTl84G/S/A/C，rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+ rtS202G/I+rtM204V/I，rtAl8lT/V+rtTl84G/S/A/C等[13－21]。

3 HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥基因變異的檢測方法

3.1 運用DNA測序原理的檢測方法

3.1.1 直接測序法該方法對HBV全基因組測序，既可對已知的耐藥變異位點進(jìn)行檢測，也可對未知的耐藥變異進(jìn)行檢測研究。臨床上以檢測常見耐藥變異位點為主。本方法缺點是敏感性低，要求樣本的病毒載量＞104拷貝/ml且占總準(zhǔn)種池≥20%的病毒變異株，因而不適用于早期檢測出耐藥變異的發(fā)生。有研究在直接測序基礎(chǔ)上發(fā)展克隆測序法，即通過克隆后再測序以克服直接測序法敏感性低的缺點，但分析大量的克隆樣本耗時費力且對技術(shù)要求高，不適合臨床篩查。有報道利用巢式PCR技術(shù)，提高直接測序法檢測的敏感性，在病毒載量只有500拷貝/ml的樣本檢測到了耐藥變異并且可以檢測到占準(zhǔn)種池10%的耐藥株[22]。

3.1.2 焦磷酸測序法該方法的檢測通量比直接測序法高約100倍，可以對HBV基因組上的任意片段進(jìn)行測序，在同時檢測多個已知的耐藥變異同時也可以檢測未知的耐藥變異。焦磷酸測序法不需要標(biāo)記引物、核苷酸和凝膠電泳，具有高靈敏、高特異性和準(zhǔn)確性等特點，能早期檢測核苷(酸)類似物治療患者的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因耐藥突變異，適用于慢性乙肝患者核苷(酸)類似物的治療監(jiān)測，是目前已知的檢測HBV耐藥相關(guān)變異敏感性較高的方法[23]。

3.2 運用雜交原理的檢測方法

3.2.1 線性探針技術(shù)將特異的寡核苷酸探針固定于硝酸纖維素膜條上對生物素化PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片段進(jìn)行反向雜交后顯色，使檢測結(jié)果肉眼可見。本法對檢測樣本病毒載量的要求與直接測序法相近但檢測敏感性更高[24]?？蓹z測病毒載量＞104拷貝/ml且占總準(zhǔn)種池≥5%的病毒變異株[25]，因而本方法適用于臨床上早期發(fā)現(xiàn)耐藥變異的出現(xiàn)。但本方法受探針的局限，只能檢測常見的幾種變異位點，不能用于檢測和研究未知的耐藥變異[26]。

3.2.2 熒光實時定量PCR該方法結(jié)合了PCR技術(shù)和FRET核酸定量檢測技術(shù)。在DNA擴(kuò)增的同時釋放可供檢測的熒光信號，實現(xiàn)對模板DNA的定量分析。該方法應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性分析，檢測的敏感性高，對血清樣本病毒載量要求較低。此法敏感性較高，可同時檢測多個耐藥變異位點。有報道表明本法可檢測當(dāng)病毒載量＞105拷貝/ml時占總準(zhǔn)種池≥1%的病毒變異株[27]，然而已知耐藥位點不斷增加，該法難已滿足臨床檢測的需要。

3.2.3 基因芯片法該方法在芯片表面有序地固定高密度的寡核苷酸或特定基因片段探針，再與生物素標(biāo)記的待檢基因片段反應(yīng)，然后通過顯色產(chǎn)生熒光信號，軟件處理信號獲得待測基因序列信息。該法具有高通量，操作簡單的特點，但價格高[28]。尚未廣泛運用于臨床，如能進(jìn)一步降低成本，該法有極大的臨床應(yīng)用前景。

3.3 表型耐藥檢測表型耐藥檢測是指在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中使HBV基因組中一個或多個位點突變，再檢測病毒對藥物的敏感性降低或喪失，可作為耐藥診斷的依據(jù)[29]。已發(fā)展多種技術(shù)如瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型（transient transfection）、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型（stable cell lines)、酶活性分析（enzymatic assay）等用于檢測表型耐藥。該技術(shù)在闡明耐藥機(jī)制、動態(tài)性耐藥監(jiān)測、發(fā)現(xiàn)耐藥變異、篩選新型抗病毒藥物等方面都具有廣闊的前景。目前該技術(shù)逐漸從科學(xué)研究應(yīng)用于臨床耐藥分析。

4 小結(jié)

目前，臨床已廣泛使用核苷（酸）類似物治療HBV感染，但具有極高變異能力的HBV的耐藥問題已逐漸凸顯[30]，甚至出現(xiàn)針對多種核苷（酸）類似物的耐藥性。耐藥的產(chǎn)生往往導(dǎo)致抗乙肝病毒治療的失敗，進(jìn)而引起乙肝患者病情的反跳。適應(yīng)藥物壓力的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥變異、核苷（酸）類似物抗病毒效果、基因屏障、HBV復(fù)制空間和一些宿主因素的共同作用導(dǎo)致了核苷（酸）類似物耐藥的產(chǎn)生。多種檢測方法可用于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥變異的變異位點、變異模式和表型耐藥檢測，并結(jié)合臨床以早期評估核苷（酸）類似物耐藥的產(chǎn)生、耐藥監(jiān)測，為指導(dǎo)臨床合理選擇藥物、用藥方案和耐藥產(chǎn)生后藥物調(diào)整提供依據(jù)[31]。臨床仍需要更多研究來發(fā)現(xiàn)新的變異位點和進(jìn)一步明確耐藥變異與臨床診斷、選擇抗病毒藥物、病情變化的關(guān)系。不同的檢測方法有各自的優(yōu)點及局限性，還需要進(jìn)一步研究高性價比、高通量、高敏感性特異性、操作簡單的篩檢HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥變異的檢測方法。

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2016-07-18；

2016-12-21)

李健，1983年生，學(xué)士學(xué)位，主管檢驗師，南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室同等學(xué)歷申請碩士學(xué)位研究生；研究方向：乙肝病毒基因耐藥變異。

曾小平，1973年生，副教授，碩士生導(dǎo)師。