李 健，魏洪濤*，張國利，岳玉環(huán)，吳廣謀，田 園，邱麗娜，馬洪圓，王冬冬，吉元剛

(1.吉林大學中日聯誼醫(yī)院 口腔科，吉林 長春130033；2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所；3.吉林農業(yè)大學生命科學學院)

舌癌CAL-27細胞GnRHR的檢測及曲普瑞林對細胞增殖抑制作用研究

李 健1，魏洪濤1*，張國利2，岳玉環(huán)2，吳廣謀2，田 園2，邱麗娜1，馬洪圓3，王冬冬2，吉元剛3

(1.吉林大學中日聯誼醫(yī)院 口腔科，吉林 長春130033；2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所；3.吉林農業(yè)大學生命科學學院)

目的 研究I型促性腺激素釋放激素(GnRH-I)類似物(GnRHa)曲普瑞林(Triptorelin)對人舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞株的體外增殖抑制作用。方法 利用RT-PCR方法檢測CAL-27細胞株GnRHR mRNA。Western Blot法檢測CAL-27細胞表面GnRHR蛋白表達。通過CCK-8法檢測曲普瑞林對CAL-27細胞的生長抑制作用。結果 經RT-PCR法檢測顯示CAL-27細胞存在GnRHR mRNA。Western Blot結果顯示， CAL-27細胞蛋白在60 kDa處存在GnRHR特異性反應條帶。CCK-8檢測結果顯示，曲普瑞林對CAL-27細胞抑制率呈現濃度依賴性，且差異顯著(P<0.01)。結論 舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞株中GnRHR基因及蛋白呈陽性，曲普瑞林對CAL-27細胞增殖具有抑制作用。

曲普瑞林；促性腺激素釋放激素受體；舌癌

(ChinJLabDiagn,2017,21:0475)

40%的頭頸部惡性腫瘤發(fā)生于口腔[1]，目前手術治療仍是主要的治療方式[2]。盡管聯用包括放化療在內的多種治療方法，但預后仍然較差，5年生存率不到50%[3]。有學者研究發(fā)現口腔癌根治性治療對患者生活質量有顯著的影響[4]。促性腺激素釋放激素(GnRH)是一種由下丘腦分泌的十肽激素，其調控垂體分泌促性腺激素的作用眾所周知。然而在過去的三十年中，逐漸發(fā)現GnRH及其受體除在垂體以及生殖系統(tǒng)存在，還存在于多種腫瘤組織中[5]。GnRH及合成的GnRH類似物已被證實對多種惡性腫瘤有抑制增殖的作用，包括卵巢癌、乳腺癌，子宮內膜癌、前列腺癌、胃癌、鼻咽癌等[6-11]。近年來，Cheung LW的研究顯示腫瘤細胞表面GnRHR與腫瘤的轉移及血管生成有關[12]。Lu等發(fā)現，胃癌組織中GnRHR的表達量與預后顯著相關[13]。 這些均提示我們GnRH及GnRHR在腫瘤組織中的表達具有重要意義。迄今，尚未發(fā)現國內外關于人口腔癌細胞或組織表達GnRHR的報道，本課題組檢測了人舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞株GnRHR的基因及蛋白表達情況，并利用曲普瑞林針對GnRHR進行了細胞增殖抑制試驗，以期為提高口腔癌預后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞株購自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑、材料及儀器 曲普瑞林(Triptorelin，pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)委托蘇州強耀生物科技有限公司合成。DMEM培養(yǎng)基以及新生牛血清購自GIBCO公司?？俁NA提取試劑盒購自Promega公司。反轉錄試劑盒、PCR相關試劑均購自TaKaRa公司。GnRHR引物(F:5’-GCTCTCTGCGACCTTTA-3’;R:5’-TGTT CCACATCCCATCC-3’)及內參基因β2-M引物(F:5’-GGGTTTCATCCATCCG ACATT-3’;R:5’-CACGGCAGGCATACTCATCTT-3’)委托長春庫美生物科技有限公司合成。CCK-8試劑盒購自DOJINDO公司。RIPA裂解液(強)、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。鼠抗人單克隆抗體(ab22168)購自abcam公司，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。PCR儀購自Bioer公司。核酸定量分析儀購自Thermo Fisher公司。凝膠圖像分析儀購自上海天能公司。多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司。高速低溫離心機購自 Hettich公司。電泳槽、電泳儀電源、半干轉印儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞株使用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、飽和濕度、含5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 RT-PCR方法檢測CAL-27細胞株中GnRHR的mRNA 根據NCBI數據庫GnRHR及β2-M基因序列使用Primer5.0軟件設計引物。取生長至80%匯合時的對數生長期細胞，收集細胞提取細胞總RNA，核酸定量分析儀分析并定量顯示A260/A280值為1.9，濃度為253 ng/μl。使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit進行反轉錄合成cDNA。先去除基因組DNA，反應體系為5×g DNA Eraser Buffer 2 μl、gDNA Eraser 1 μl、RNA 4 μl 、RNase Free dH2O 3 μl，共10μl 體系42℃加熱2分鐘后，與PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl、RT Primer Mix 1 μl、5×PrimeScript Buffer 2 4 μl、RNase Free dH2O 4 μl，組成20 μl 體系。37℃ 15 min、85℃5 s，4℃保存。取5 μl cDNA模板與1×Ex Taq buffer(含Mg2+)2 μl、Ex Taq 0.2 μl、上下游引物(10 μM)各0.5 μl、dNTP 1 μl、H2O 10.8 μl構成20 μl擴增體系。反應條件為94℃預變性5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s，40個循環(huán)，72℃5 min。擴增產物進行1.6%瓊脂糖凝膠電泳。切膠回收后委托長春庫美生物科技有限公司進行PCR產物測序。

1.2.3 Western Blot檢測CAL-27細胞GnRHR蛋白表達 取生長至80%匯合時的對數生長期細胞，吸去細胞瓶內舊培養(yǎng)基后使用無菌冰PBS清洗兩次。細胞刮刀收集細胞至2 ml EP管內2000 rpm離心5分鐘，棄上清。再用冷PBS清洗細胞2次，每次洗后離心。300 μl RIPA裂解液與3 μl PMSF(100 mM)混勻后加入至EP管，冰上裂解30分鐘后12 000 rpm離心10 分鐘，收集上清至新的預冷離心管。取適量蛋白溶液利用BCA法進行濃度測定。

取40 μg蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，然后將蛋白半干轉移至NC膜上。含5%脫脂奶粉的TBST溶液37℃溫箱中封閉150分鐘。TBST洗膜3次每次5分鐘后，加入TBST稀釋(1∶1000)的鼠抗GnRHR單克隆抗體4℃孵育過夜。洗膜后，HRP標記山羊抗鼠IgG(1∶2000稀釋)室溫孵育2小時。洗膜后進行DAB顯色。

1.2.4 利用CCK-8進行細胞增殖分析 取生長至80%匯合時的對數生長期細胞，無菌PBS清洗兩遍，加入0.1%胰蛋白酶1.5 ml，37℃孵育4分鐘后去除胰蛋白酶。加入DMEM培養(yǎng)基吹打制成單細胞懸液，細胞計數板計數后調整細胞濃度至1×105個/ml，將細胞種植在96孔板中，每孔100 μl即10 000 個細胞。96孔板貼壁培養(yǎng)6小時后去除原培養(yǎng)基并加入用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的Triptorelin(10、20、40、80μg/ml)以及不含藥物的溶劑對照組培養(yǎng)48小時，每個濃度5個復孔。48小時后去除舊培養(yǎng)基，統(tǒng)一更換新培養(yǎng)基，并設置不含細胞的培養(yǎng)基空白對照組，每孔加入10 μl CCK-8溶液37℃培養(yǎng)90分鐘后，利用酶標儀檢測OD450，記錄檢測結果。實驗重復三次。

1.2.5 數據處理 每個濃度5個復孔的OD450數值去掉一個最大值、一個最小值后取平均值，根據公式：細胞存活率=[(OD實驗孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)]×100%計算細胞存活率，應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行單因素方差分析，數據以x—±s表示。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測結果

以CAL-27細胞cDNA為模板，擴增GnRHR基因序列，對CAL-27細胞的GnRHR基因表達進行初步檢測。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示GnRHR (167 bp)和內參β2-M(160 bp)基因PCR擴增結果無雜帶，經膠回收后進行測序，測序結果序列正確，證實CAL-27細胞存在GnRHR mRNA表達。見圖1。

M;TaKaRa DL2000 Marker;1:陰性對照 2:β2-M(160 bp);3:GnRHR(167 bp).

圖1 CAL-27細胞GnRHR與內參基因PCR電泳圖

2.2 Western Blot檢測結果

結果顯示在60kDa處出現特異性反應條帶，與其他文獻所報道的GnRHR蛋白大小一致，表明舌癌CAL-27細胞株存在GnRHR。見圖2。

M:Protein Marker;1:CAL-27細胞蛋白

2.3 細胞增殖-毒性檢測結果

實驗中使用不同濃度的曲普瑞林(10、20、40、80μg/ml)處理CAL-27細胞48小時后使用CCK-8試劑盒檢測細胞存活率來觀察曲普瑞林對CAL-27細胞的增殖抑制作用，結果顯示隨曲普瑞林濃度增加，細胞存活率顯著降低 (F=11.535，P<0.001)，分別為(96.92±2.15)%、(93.03±2.35)%、(91.77±2.76)%、(88.62±2.39)%。10 μg/ml組與對照組相比較存活率差異無顯著性(P=0.128)，20、40、80 μg/ml組與對照組比較差異均具有極顯著性(P<0.01)。見圖3。

圖3 曲普瑞林處理CAL-27細胞48小時后的存活率

3 討論

近二三十年，得益于癌癥基因組學的發(fā)展，使癌癥靶向性治療成為可能。例如伊馬替尼可以特異性作用于BCR-ABL酪氨酸激酶，使其對慢性粒細胞白血病有較好的療效[14]。再如曲妥珠單抗特異性作用于HER2高表達的乳腺癌細胞，阻斷HER2相關信號通路，使其成為目前HER2陽性乳腺癌患者主要靶向治療藥物[15]。GnRH激動劑亦是一種靶向性藥物，目前已有曲普瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林應用于臨床治療前列腺癌、乳腺癌、子宮肌瘤、子宮內膜異位以及多種性激素相關疾病。曲普瑞林的氨基酸序列與I型促性腺激素釋放激素相比較，其第六位由色氨酸代替了天然序列中的甘氨酸。在人體內，由于血清蛋白酶的裂解作用，GnRH-I的半衰期只有2-5分鐘，而包括曲普瑞林在內的一系列的GnRH激動劑都延長了半衰期并提高了與受體的結合力[16]。在對于前列腺癌的治療中，曲普瑞林是一線激素治療藥物，在臨床應用中，對于晚期前列腺癌患者具有較好的療效和安全性[17]。本研究結果顯示人舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞表面存在GnRHR，在人口腔癌細胞或組織中發(fā)現GnRHR的存在在國內外尚屬首次。研究顯示，GnRHR在腫瘤組織中表達量很少[18]，本研究發(fā)現曲普瑞林對CAL-27細胞的抑制作用呈劑量依賴性關系，這可能與GnRH與其受體的高親和力有關。在垂體外腫瘤組織中，GnRH及其受體構成了自分泌、負調控系統(tǒng)，使得其具有抗癌活性[19]。這一發(fā)現使得學者們對GnRH所介導的細胞內信號轉導通路產生濃厚興趣。Patrizia Limonta等人的研究發(fā)現，與垂體內GnRH的信號通路不同，GnRH-I激動劑不會影響PLC介導的磷脂酰肌醇代謝或細胞內Ca2+水平。GnRH及其類似物與受體結合后，激活酪氨酸磷酸酶使癌細胞表皮生長因子受體去磷酸化[20]。目前我們尚不清楚GnRH及其類似物對口腔癌的抑制作用是否與此相關，未來我們將對此問題進行深入探討。本研究對解釋體內激素水平影響腫瘤組織的生長狀態(tài)有重要意義，這將有助于提升口腔癌的預后維護以及臨床新藥開發(fā)。

[1]Nemoto RP,Victorino AA,Pessoa GB,et al.Oral cancer preventive campaigns:are we reaching the real target? [J].Braz J Otorhinolaryngol,2015,81(1):44.

[2]Kamangar F,Dores GM,Anderson WF.Patterns of cancer incidence,mortality,and prevalence across five continents:defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world[J].J Clin Oncol,2006,24(14):2137.

[3]Leemans CR,Braakhuis BJ,Brakenhoff RH.The molecular biology of head and neck cancer[J].Nature Reviews Cancer,2011,11(1):9.

[4]肖 燕,張沛沛,李文鹿,等.口腔癌患者健康相關生活質量及其影響因素調查[J].口腔醫(yī)學研究,2016,32 (5):478.

[5]Bliss SP,Navratil AM,Xie JJ,et al.GnRH signaling,the gonadotrope and endocrine control of fertility[J].Front Neuroendocrinol,2010,31(3):322.

[6]Cheng JC,Klausen C,Leung PC.Overexpression of wild-type but not C134W mutant FOXL2 enhances GnRH-induced cell apoptosis by increasing GnRH receptor expression in human granulosa cell tumors[J].PLoS One,2013;8(1):e55099.

[7]Feng Z,Wen H,Bi R,et al.A clinically applicable molecular classification for high-grade serous ovarian cancer based on hormone receptor expression[J].Scientific Reports,2016,6:25408.

[8]Pazaitou-Panayiotou K,Chemonidou C,Poupi A,et al.Gonadotropin-releasing hormone neuropeptides and receptor in human breast cancer:correlation to poor prognosis parameters[J].Peptides,2013,42:15.

[9]Jeon YT,Kim YB,Park SY,et al.Gonadotropin-releasing hormone receptor expression in endometrial cancer[J].International Journal of Gynecological Pathology,2009,28(1):19.

[10]Limonta P,Manea M.Gonadotropin-releasing hormone receptors as molecular therapeutic targets in prostate cancer:Current options and emerging strategies[J].Cancer Treatment Reviews,2013,39(6):647.

[11]Teng LH,Ahmad M.Gonadotropin-releasing hormone inhibits the proliferation and motility of nasopharyngeal carcinoma cells[J].Molecular Medicine Reports,2015,12(4):4909.

[12]Cheung LW,Wong AS.Gonadotropin-releasing hormone:GnRH receptor signaling in extrapituitary tissues[J].The FEBS Journal,2008,275(22):5479.

[13]Mingzhu Lu,Jing Zhu,Yang Ling,et al.The lower expression of gonadotropin-releasing hormone receptor associated with poor prognosis in gastric cancer[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(8):13365.

[14]Afghahi A,Sledge GW Jr.Targeted Therapy for Cancer in the Genomic Era[J].Cancer J,2015,21(4):294.

[15]李 偉,潘 燕,李學軍.HER 2 陽性乳腺癌治療藥物曲妥珠單抗耐藥機制及新一代靶向藥物研究進展[J].中國臨床藥理學雜志,2014,(171):48.

[16]Weckermann D,Harzmann R.Hormone Therapy in Prostate Cancer:LHRH Antagonists versus LHRH Analogues[J].European Urology,2004(46):279.

[17]Merseburger AS,Hupe MC.Update on Triptorelin:Current Thinking on Androgen Deprivation Therapy for Prostate Cancer[J].Adv Ther,2016,(33):1072.

[18]Aguilar-Rojas A,Huerta-Reyes M.Human gonadotropin-releasing hormone receptor-activated cellular functions and signaling pathways in extra-pituitary tissues and cancer cells[J].Oncol Rep,2009,(22):981.

[19]Saleh-Abady MM,Naderi-Manesh H,Alizadeh A,et al.Anticancer activity of a new gonadotropin releasing hormone analogue[J].Biopolymers,2010,94(3):292.

[20]Limonta P,Moretti RM,Montagnani Marelli M,et al.The biology of gonadotropin hormone-releasing hormone:role in the control of tumor growth and progression in humans[J].Front Neuroendocrinol,2003,24(4):279.

The expression of GnRHR on CAL-27 cells and the inhibitory effect of Triptorelin on the proliferation of CAL-27 cells in vitro

LIJian,WEIHong-tao,ZHANGGuo-li,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To investigate the antiproliferation effect of GnRH-I analogue Triptorelin on human tongue squamous cell carcinoma cell line CAL-27 in vitro.Methods RT-PCR method was used for detection of gonadotropin releasing hormone receptor (GnRHR) mRNA in CAL-27 cell line.Western blot was employed to detect the expression of GnRH receptor on CAL-27 cells.CAL-27 cells were treated with different concentrations of Triptorelin for 48 hours and then OD450 was detected using CCK-8 assay to calculate the cell viability.Results The result of RT-PCR showed that CAL-27 cells have GnRHR mRNA.Western Blotting has showed that the protein samples of CAL-27 cells have specific reaction at approximately 60 kDa.CCK-8 detection showed a significant decrease in cell viability rate with the increase of concentration of Triptorelin (P<0.01).Conclusion CAL-27 cell line has the gene and protein expression of GnRH receptor .Our results demonstrate that Triptorelin has inhibitory effect on CAL-27 cells.

Triptorelin;Gonadotropin-releasing hormone receptor;Tongue cancer

吉林省自然科學基金(20160101095JC)

1007-4287(2017)03-0475-04

R739.86

A

2016-07-06)

*通訊作者