陳奕鵬　李超萍　樊春俊　時濤　李博勛　黃貴修

摘 要 根據(jù)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類（STK）結構域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列設計了1對簡并引物，以細菌性萎蔫病抗/感木薯種質E1340和GR911基因組DNA為模板，通過PCR擴增，均獲得大小約0.5 kb的擴增片段。兩個片段純化、克隆、測序后獲得完全一致的505 nt序列，比對發(fā)現(xiàn)，木薯種質AM560帶有和該序列高度同源的核苷酸片段。對包括同源片段上下游各約2.0 kb的大片段序列進行基因預測，獲得1個有4個外顯子、ORF全長1866 nt的預測基因，命名SSK1。序列分析表明，該基因編碼621 aa，有細胞壁受體激酶結合、偶聯(lián)位點和8個跨膜結構域，具有典型的STK類抗病基因的保守結構，是一個候選的抗病基因，可能在木薯抗病反應中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞 木薯 ；候選抗病基因 ；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.006

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot Mill.）灌木狀多年生作物，是世界三大薯類（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一，也是全球僅次于小麥、玉米、水稻、馬鈴薯、高粱的第6大糧食作物。木薯塊根富含淀粉，是主要的收獲物，是全球10億人口日常生活中所需熱能的主要來源。目前，木薯在我國華南地區(qū)廣泛種植，以之為基礎的食品和生物能源等產(chǎn)業(yè)是當?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟的重要部分[1]。木薯種植中，各類嚴重發(fā)生的病害是相關產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制性因素之一。國外報道為害木薯的病害多達30余種[2]。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所的調(diào)查結果表明，危害中國木薯的病害有8種，其中細菌性萎蔫病最為嚴重[3]。種植抗病品種是作物病害防治中最為有效的措施之一，相關抗病基因資源是開展抗病育種工作的前提。目前木薯抗病機理方面的研究還很少，也缺少可供利用的基因資源，嚴重制約了相關研究工作的開展。

基因對基因假說[4]認為，寄主植物帶有多個抗病基因，病原菌帶有對應的無毒基因，二者的蛋白產(chǎn)物互作后通過一系列的級聯(lián)反應調(diào)控植物表現(xiàn)出抗病性[5]。目前模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和番茄（Lypoersicum esculentum）抗病基因方面的研究最多[6-8]。已克隆的抗病基因蛋白產(chǎn)物通常具有1種或多種保守結構，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（STK）結構域是抗病基因蛋白產(chǎn)物常見的結構之一。該類激酶作用方式包括蛋白質間相互作用，轉錄水平和翻譯水平調(diào)控和DNA復制的調(diào)節(jié)等方式[9]。以抗病基因的保守結構域設計簡并或特異引物通過PCR擴增或使用RGA探針從基因組DNA或cDNA文庫中獲得抗病基因類似序列，再從中篩選潛在的抗病基因，是作物抗性機理研究中的重要方法。本研究根據(jù)STK的保守區(qū)序列設計簡并引物，通過PCR擴增獲得木薯抗病基因類似序列并進行候選基因的分離和生物信息學分析，為進一步開展相關研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試木薯品種

木薯細菌性萎蔫病抗病種質E1340和感病種質GR911[10]，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所木薯種質資源圃提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

DNA 片段膠回收試劑盒、pMD18-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司。Taq酶、dNTPs和大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。大腸桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基（參照方中達[11]的方法制備），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 木薯基因組DNA的提取及目的序列擴增

田間采集健康木薯種質葉片，按閆慶祥等[12]的方法提取基因組DNA。根據(jù)小麥中與Lr10緊密連鎖的一個STK激酶和水稻抗白葉枯病基因Xa21的STK激酶區(qū)保守氨基酸序列設計1對簡并引物Ps-F（5′-GGNCARGGNGGDTTYGGDWSDG-3′）和Ps-R（5′-YTCNGGNGCDATRTADCCCATTG-3′）進行PCR擴增。

PCR反應體系：10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、10 μmol/L各引物溶液1 μL、DNA模板50 ng、Taq DNA 聚合酶1.0 U、補充無菌水至25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預變性3 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 2 min，35 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按試劑盒說明書進行擴增產(chǎn)物的純化、回收和克隆，隨機挑選3個陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定。

1.2.2 目的基因的預測和功能分析

在NCBI上進行預測基因同源性比對。采用本地Blast的方法，將獲得的序列在木薯基因組數(shù)據(jù)庫（木薯種質：AM560）中進行比對，獲得其上下游序列后，在Softberry和GENSCAN上進行目的基因預測。利用SMART、NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫和Sanger中Pfam數(shù)據(jù)庫對獲得的編碼蛋白氨基酸序列進行結構分析。用ProtParam進行氨基酸一級結構分析。用TMpred進行跨膜結構預測。將推導出的氨基酸序列與已克隆的該類基因小麥LRK10（登錄號U51330.1）、LRK33（登錄號AAK20740），番茄Pto（登錄號U59316）和水稻Xa21（登錄號U37133.1）進行氨基酸特有結構域分析。下載近源基因后，用MEGA version 4.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap 對系統(tǒng)樹進行檢驗，1 000次重復。

2 結果和分析

2.1 木薯基因組DNA的提取及目的序列擴增

分別提取木薯抗病種質E1340和感病種質GR911基因組DNA后，用引物對Ps-F和Ps-R進行PCR擴增，均獲得大小約0.5 kb的擴增產(chǎn)物。兩個擴增片段回收、克隆后發(fā)現(xiàn)其序列完全一致，長度為505 nt。

2.2 目的基因的預測和功能分析

將獲得的序列在NCBI上進行Blastx分析，發(fā)現(xiàn)該序列與來自大麥、蓖麻、玉米等作物的STK類蛋白的同源性在50%以上（表1）。

所獲序列和木薯基因組（種質為AM560）比對結果表明，該種質帶有同源性為98%的同源片段。提取包括該片段上下游各約2.0 kb的大片段序列，采用Softberry的Hevea（橡膠樹）、Nicotiana tabacum（煙草）和Arabidopsis（擬南芥）3種模式和GENSCAN的Maize（玉米）模式進行基因預測，結果均表明該位點位于一個預測基因內(nèi)部，該基因命名為SSK1（圖1）。參照同屬大戟科作物的Hevea模式分析結果，分析SSK1位于提取序列的負鏈上，有4個外顯子CDSf、CDSi1、CDSi2和CDSl，TSS（轉錄起始位點）位于第一個外顯子前0.6 kb處，PolyA位于最后一個外顯子后的0.5 kb處，ORF全長1866 nt，編碼621 aa。

利用SMART軟件、NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫和Sanger中Pfam數(shù)據(jù)庫對SSK1的基因結構預測的結果均表明，SSK1蛋白產(chǎn)物具有跨膜的細胞壁受體激酶結合、偶聯(lián)位點（WAK bind和WAK assoc），具有典型的類PKC家族結構特征（圖2），進一步分析得出，SSK1具有典型的STK類抗病基因特異結構域。

利用ProtParam分析表明該蛋白質分子量為69 643.7 ku，等電點為5.74，平均疏水性（GRAVY）為-0.018。各氨基酸中，絲氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量最高，分別為66個（10.6%）、64個（10.3%）和48個（7.7%），色氨酸含量最低，為6個（1%）。由TMpred程序預測表明，SSK1所編碼蛋白在第17～35，174～199，260～285，377～403個氨基酸殘基間存在4個由內(nèi)到外的跨膜螺旋區(qū)域，在第18～35，170～188，267～290，383～400個氨基酸殘基間存在4個由外到內(nèi)的跨膜螺旋區(qū)域（圖3）。

將SSK1基因蛋白產(chǎn)物與小麥LRK10（U51330.1）、LRK33（AAK20740）、LR10（U59316）和水稻Xa21（U37133.1）等STK類抗病基因進行氨基酸序列同源性分析，結果顯示SSK1編碼蛋白氨基酸序列均具有STK類抗病基因所特有的9個催化結構域，其中兩個特征區(qū)域分別為Ⅵb（DaKXXN）和Ⅷ（GTaGYxAP（N/E）（見圖4）。

氨基酸序列比對結果表明，SSK1基因氨基酸序列和木薯預測基因MANES_14G108500（OAY31390）同源性為95%，和大戟科蓖麻預測受體類激酶基因At1g67000（XP_002526303）、麻瘋樹預測受體類激酶At1g67000（XP_012075707）的同源性分別為73%和72%，分析其為候選的STK類抗病基因。下載了部分近源序列后進行聚類分析，結果表明SSK1、MANES_14G108500、At1g67000、At1g67000等親緣關系最近，和胡楊的預測受體類激酶（XP_011038730）、柑橘的預測受體類激酶（XP_006468771）為一個分枝，可可的預測激酶（EOY01270）和樹棉的預測抗病受體類激酶（XP_017638523）聚類為親緣關系較近的另一個分枝。SSK1和小麥預測的受體類激酶（AAK40358）、絲氨酸/蘇氨酸受體激酶（NP_001105659）親緣關系較遠，和大麥的預測受體類激酶（AAD44032）、小麥的預測受體類激酶（AAK20741）、粳稻的預測絲氨酸/蘇氨酸受體激酶（AAF43405）和預測受體類激酶（AAM09950）、玉米的預測受體類激酶（AAD46418）和柑橘的預測受體類蛋白激酶（XP_006468771）的親緣關系最遠（圖5）。

3 討論

本研究根據(jù)STK類抗病基因蛋白產(chǎn)物的保守結構域設計簡并引物，采用PCR擴增分別從抗、感細菌性萎蔫病的木薯種質E1340、GR911基因組中分離到序列一致、和STK類蛋白具有較高同源性的1個核酸片段，比對發(fā)現(xiàn)木薯種質AM560同樣帶有該同源片段?；蝾A測發(fā)現(xiàn)該片段位于一個有4個外顯子、編碼621 aa的預測基因中。該基因蛋白產(chǎn)物典型的STK類蛋白的結構特征，聚類分析表明，該基因蛋白產(chǎn)物與預測的受體類激酶具有較高的同源性，可能在木薯抗病反應中發(fā)揮重要作用。

自1996年首次利用抗病基因產(chǎn)物的保守結構域擴增獲得抗病基因類似序列RGAs（Resistance gene analogs）以來，利用RGAs方法來克隆、定位抗病基因已得到廣泛應用，顯示出廣闊的應用前景[13]。利用該方法在馬鈴薯[14]、小麥[15]、大麥[16]、番茄[17]、黃瓜[18]、水稻[19]、香蕉[20]等作物上均已獲得了大量的RGAs。這些RGAs與抗病基因R基因的關系可以分為3種：第一，RGA是R基因或其假基因的一部分，例如擬南芥中的一類RGA與RPP5緊密連鎖，被證明是RPP5的一部分[21]；第二，RGAs與R基因緊密連鎖，例如水稻[22]、大麥[23-24]中都找到了與不同的R基因緊密連鎖的RGA。安海山等[25]發(fā)現(xiàn)，僅有抗病核桃品種基因組中能分離到NBS類RGAs，表明這些序列是和抗性相關的；第三，有些非抗病基因同樣具有NBS、LRR和絲氨酸/蘇氨酸酸激酶等保守域，因此，克隆出的RGA有可能和目的抗病基因無關。

Lopez等[26]根據(jù)抗病基因的NBS（核苷酸結合位點）和TIR（白細胞介素-1受體）保守域設計特異引物，從木薯中分離到12類RGA，文庫篩選和雜交分析發(fā)現(xiàn)其中11類RGA在基因組中為單拷貝。本研究采用類似方法獲得預測基因SSK1，同時發(fā)現(xiàn)，木薯對細菌性萎蔫病抗感種質中均帶有SSK1的同源基因，該基因是否參與木薯對細菌性萎蔫病或其它病害的抗性反應，還需要開展進一步的研究。

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