趙晨光，許 剛，琚 芬，孫 瑋，袁 華，牟 翔*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,西安 710032;2新疆軍區(qū)總醫(yī)院全軍骨科中心;*通訊作者,E-mail:Pro.mu@fmmu.edu.cn)

LINGO-1對脊髓神經(jīng)干細(xì)胞增殖及凋亡的作用

趙晨光1，許 剛2，琚 芬1，孫 瑋1，袁 華1，牟 翔1*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,西安 710032;2新疆軍區(qū)總醫(yī)院全軍骨科中心;*通訊作者,E-mail:Pro.mu@fmmu.edu.cn)

目的 觀察LINGO-1對脊髓神經(jīng)干細(xì)胞(spinal cord derived neural stem cells,SNSCs)增殖及凋亡作用。 方法 體外培養(yǎng)大鼠脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞并分為對照組及干擾組,干擾組通過LINGO-1 shRNA慢病毒感染SNSCs下調(diào)LINGO-1表達(dá),對照組表達(dá)空白載體,采用BrdU及TUNEL染色檢測下調(diào)LINGO-1表達(dá)對SNSCs增殖及凋亡的影響。 結(jié)果 下調(diào)LINGO-1表達(dá)后,干擾組克隆球直徑達(dá)到對照組克隆球直徑的1.18倍,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LINGO-1干擾組及對照組BrdU陽性細(xì)胞率分別為8.5%及3.8%,而TUNEL陽性細(xì)胞率分別為8.4%及11.2%,以上結(jié)果比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 下調(diào)LINGO-1表達(dá)可以促進脊髓神經(jīng)干細(xì)胞增殖并且抑制細(xì)胞凋亡。

LINGO-1； 脊髓神經(jīng)干細(xì)胞； 脊髓損傷； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

脊髓神經(jīng)干細(xì)胞(spinal cord derived neural stem cells,SNSCs)的發(fā)現(xiàn)為脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)與功能重建帶來一線希望,但是因為生物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜及損傷后髓鞘源性抑制因子(myelin-associated inhibitory factors,MAIFs)的釋放,使得修復(fù)過程困難重重[1]。MAIFs的主要結(jié)合受體是NgR,但因此受體缺少胞內(nèi)段,所以由LINGO-1(LRR and Ig domain containing,Nogo receptor interacting protein-1)及NgR、P75/Troy組成的共同復(fù)合受體便在MAIFs介導(dǎo)的多種生理作用中扮演了重要的角色。LINGO-1是由614個氨基酸構(gòu)成的跨膜生物蛋白,定位于15q24.3。研究表明,LINGO-1可以通過NgR1/P75/LINGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1調(diào)節(jié)調(diào)控軸突延伸和再生、調(diào)控神經(jīng)元存活以及調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟及再髓鞘化[2,3]。本研究旨在觀察LINGO-1基因?qū)顾柙葱陨窠?jīng)干細(xì)胞增殖及凋亡的作用,為進一步調(diào)控其促進脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)帶來新思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及實驗動物

實驗用10周齡雌性Fischer344大鼠(160-180 g)由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM/F12、B27添加劑、N2添加劑、GlutaMAX添加劑及胎牛血清等均為Gibco公司(美國)產(chǎn)品;bFGF和EGF購于Peprotech公司(美國),Accutase、Poly-L-Lysine及Laminin購于Sigma公司(美國);Nestin、β-TubulinIII、GFAP、O4一抗購于STEMCELL公司(美國);熒光二抗FITC-conjugated Goat anti-mouse,FITC-conjugated Goat anti-rabbit及Texas Red-conjugated Goat anti-mouse IgG購自STEMCELL公司(美國);BrdU購自Sigma公司(美國),TUNEL試劑盒購于Promega公司(美國)。

1.3 大鼠SNSCs的分離培養(yǎng)

10周齡Fischer344大鼠脊柱脫臼法處死,椎板減壓暴露脊髓,取C3至T12節(jié)段脊髓置于預(yù)冷的Hanks液中,小心用眼科剪剝離硬脊膜,將脊髓剪碎后加入Accutase中于37 ℃中消化30 min,加入NSCs培養(yǎng)基終止消化,離心后用NSCs培養(yǎng)基重懸,用火焰拋光的巴斯德吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液,用40 μm濾網(wǎng)過濾,胎盤藍(lán)計數(shù),按105/ml接種于NSCs培養(yǎng)基(DMEM/F12+2% B27+1% N2+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF)中,每3 d更換半量培養(yǎng)基1次。生長至第7天時機械吹打法傳代。每7 d傳代1次,傳代大于3代進行實驗。

1.4 LINGO-1 shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及包裝

由上海吉凱生物基因公司提供。shRNA插入序列為:Sense 5′-TGCTGTAGTCTAGCAGGAT GACGATCGTTTTGGCCACTGACTGACGATCGTCACTGCTAGACTA-3′,Antisense 5′-CCTGTAGTC TAGCAGTGACGATCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGATCGTCATCCGTCTAGACTAC-3′。

1.5 脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖實驗

待慢病毒感染SNSCs 72 h轉(zhuǎn)入多聚賴氨酸和Laminin包被的玻片上,貼壁培養(yǎng)24 h向培養(yǎng)液中加入BrdU,共孵育24 h,免疫熒光染色。熒光鏡計數(shù)陽性細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù),獲得BrdU陽性率(細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))。

1.6 脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞凋亡檢測

待慢病毒感染SNSCs 72 h,將SNSCs轉(zhuǎn)入多聚賴氨酸和Laminin包被的玻片上,貼壁培養(yǎng)24 h按照In Situ Cell Death Detection Kit(Promega)說明書標(biāo)記凋亡細(xì)胞。

1.7 免疫熒光染色

吸棄培養(yǎng)基用PBS清洗1次以徹底去除殘留的培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定30 min,用PBS清洗3次,每次5 min;加入0.3%Triton X-100通透5 min,PBS清洗2次。加入稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜,吸棄一抗,PBS洗3次,每次5 min。加入稀釋好的熒光二抗37 ℃避光孵育2 h,PBS洗3次,每次5 min,滴加DAPI封片劑,室溫孵育30 min。鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LINGO-1對脊髓神經(jīng)干細(xì)胞克隆球直徑的影響

神經(jīng)克隆球的直徑大小可以反映出分離原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞固有的增殖能力。實驗顯示對照組及LINGO-1干擾組克隆球大部分在含有EGF和bFGF的培養(yǎng)液中懸浮生長(見圖1),另有少量細(xì)胞貼壁生長。加入新鮮培養(yǎng)液及因子(EGF及bFGF)繼續(xù)培養(yǎng)1周可見中等大小的圓形細(xì)胞克隆團形成,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,折光性好,未見明顯突起(見圖1)。培養(yǎng)1周LINGO-1干擾組的克隆球直徑[(118±8.9)%]明顯大于對照組[(100±6.3)%],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

圖1 脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞克隆球生長情況(×40)Figure1 CultureofSNSCsincontrolgroupandsiNRAgroup(×40)

2.2 下調(diào)LINGO-1促進脊髓干細(xì)胞增殖

脊髓來源培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞干擾后經(jīng)BrdU標(biāo)記24 h觀察到對照組BrdU陽性細(xì)胞(紅色細(xì)胞)較LINGO-1干擾組BrdU陽性細(xì)胞(紅色細(xì)胞)明顯減少(見圖2)。進一步分析結(jié)果顯示對照組及LINGO-1干擾組BrdU陽性細(xì)胞率分別為3.8%及8.5%,兩組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2G)。

與對照組比較，?P<0．05G．統(tǒng)計分析圖2 LINGO?1干擾組及對照組SNSCs的Brdu染色及比較(×20)Figure2 BrdUstainingofSNSCsincontrolgroupandsiNRAgroup(×20)

2.3 下調(diào)LINGO-1抑制神經(jīng)干細(xì)胞凋亡

脊髓來源培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞干擾后經(jīng)TUNEL染色后觀察到對照組TUNEL陽性細(xì)胞(綠色細(xì)胞)較LINGO-1干擾組TUNEL陽性細(xì)胞(綠色細(xì)胞)明顯增多(見圖3)。進一步分析結(jié)果顯示對照組及LINGO-1干擾組綠色熒光陽性細(xì)胞率分別為11.2%及8.4%,兩組相比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,見圖3G)

與對照組比較，?P<0．05G．統(tǒng)計分析圖3 LINGO?1干擾組及對照組TUNEL染色結(jié)果及比較(×20)Figure3 TUNELstainingofSNSCsincontrolgroupandsiNRAgroup(×20)

3 討論

本實驗成功從成年大鼠脊髓中分離培養(yǎng)了原代神經(jīng)干細(xì)胞,并利用LINGO-1 shRNA對脊髓神經(jīng)干細(xì)胞進行干預(yù),觀察到干擾后的神經(jīng)克隆球形成能力高于對照組。進一步觀察提示下調(diào)LINGO-1基因的表達(dá)可以促進脊髓神經(jīng)干細(xì)胞增殖同時減少其凋亡,此結(jié)果為脊髓損傷后早期干預(yù)增加內(nèi)源性脊髓神經(jīng)干細(xì)胞提供體外實驗證據(jù),也為進一步促進脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)帶來希望。

脊髓損傷后出現(xiàn)以神經(jīng)元壞死、神經(jīng)傳導(dǎo)束崩解為主要表現(xiàn)的起始損傷和炎癥反應(yīng)為主要表現(xiàn)的二次損傷,在第一階段中神經(jīng)傳導(dǎo)束崩解產(chǎn)物進一步分解成為以Nogo-A、MAG和OMgp為代表的髓鞘源性抑制因子(myelin-associated inhibitory factors,MAIFs),研究表明此類因子可以通過其復(fù)合受體之一LINGO-1介導(dǎo)了多種不利于神經(jīng)損傷修復(fù)的生物學(xué)作用[4]。LINGO-1是由614個氨基酸構(gòu)成的跨膜生物蛋白,包括12個富亮氨酸重復(fù)序列,1個Ig區(qū),1個跨膜區(qū)和1個短小的胞漿區(qū)[5]。研究表明,LINGO-1可以通過NgR1/P75/LINGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1調(diào)控RhoA途徑,終使生長錐塌陷而使軸突再生受阻;也可以參與并下調(diào)EGFR,從而影響Akt通路而調(diào)控神經(jīng)元存活;還可以少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟及再髓鞘化[6]。抑制LINGO-1基因功能可以促進脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)[7],但是LINGO-1對脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及凋亡作用卻未見相關(guān)報道。

神經(jīng)克隆球的直徑大小可以反映出神經(jīng)干細(xì)胞固有的增殖能力,實驗結(jié)果顯示LINGO-1對克隆球直徑具有負(fù)性作用,經(jīng)過LINGO-1 shRNA干擾后克隆球直徑明顯大于對照組。L??v等[8]在其試驗中曾觀察到應(yīng)用LINGO-1抗體后,NSCs中BrdU陽性細(xì)胞明顯增多,這與本實驗所觀察到的結(jié)果一致,隨著LINGO-1功能受到了抑制,NSCs增殖加快,進而形成克隆球的直徑也會高于對照組。

進一步檢測LINGO-1對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響提示抑制LINGO-1基因的表達(dá)可以促進脊髓神經(jīng)干細(xì)胞增殖。本實驗通過LINGO-1 shRNA干擾后BrdU陽性細(xì)胞率從3.8%提高至8.5%,提高達(dá)2倍之多,這提示LINGO-1 shRNA對脊髓神經(jīng)干細(xì)胞具有負(fù)性調(diào)控作用。L??v等[8]對皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞也進行過干預(yù)檢測,采用LINGO-1特異性抗體對LINGO-1進行功能封閉,發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞率從5%提高至18%,提高達(dá)3倍有余,造成這一差異的原因可能是脊髓和腦皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞本身生物學(xué)差異造成的。除了檢測LINGO-1基因?qū)顾枭窠?jīng)干細(xì)胞的增殖作用外,同時也檢測其對凋亡的作用,顯示抑制LINGO-1基因的表達(dá)可以降低脊髓神經(jīng)干細(xì)凋亡。本實驗通過LINGO-1 shRNA干擾后TUNEL陽性細(xì)胞率從11.2%下降至8.4%,這與Zhang等[9]在神經(jīng)元中觀察到的結(jié)果一致。Zhang等[9]進一步發(fā)現(xiàn)這一作用是通過LINGO-1胞內(nèi)段直接作用蛋白WNK3來完成的,LINGO-1可以激活WNK3的自身磷酸化活性,進而發(fā)生Caspase-3依賴性凋亡。

本研究沒有進一步檢測LINGO-1影響SNSCs增殖及凋亡所可能涉及的通路,這也是本研究下一步所努力的方向。明確LINGO-1對脊髓神經(jīng)干細(xì)胞增殖及凋亡的影響,可以更加廣泛地了解LINGO-1的生物學(xué)功能,也為進一步促進脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)提供可能的作用靶點,為治療脊髓損傷帶來更多的希望。

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[7] Ji B,Li M,Wu WT,etal.LINGO-1 antagonist promotes functional recovery and axonal sprouting after spinal cord injury[J].Mol Cell Neurosici,2006,33(3):311-320.

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Effects of LINGO-1 on proliferation and apoptosis of spinal cord derived neural stem cells

ZHAO Chenguang1,XU Gang2,JU Fen1,SUN Wei1,YUAN Hua1,MOU Xiang1*

(1DepartmentofRehabilitation,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2OrthopedicCenterofChinesePLA,GeneralHospitalofXinjiangMilitaryRegion;*Correspondingauthor,E-mail:Pro.mu@fmmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effects of LINGO-1 on proliferation and apoptosis of spinal cord derived neural stem cells(SNSCs).MethodsSNSCs isolated from rat spinal cord were culturedinvitroand divided into RNAi group and control group.SNSCs were transfected with LINGO-1 shRNA lentiviral vector in RNAi group and blank lentiviral vector in control group.The effects of LINGO-1 on proliferation and apoptosis were examined by BrdU and TUNEL staining.ResultsAfter down-regulation of LINGO-1 expression,the diameter of neurospheres in siNRA group was 1.18 times over that of the diameter in control group(P<0.05).The BrdU positive cell rate in RNAi group and control group was 8.5% and 3.8%,respectively(P<0.05),and the TUNEL positive cell rate in in RNAi group and control group was 8.4% and 11.2%(P<0.05).ConclusionDown-regulation of LINGO-1 gene could increase proliferation of SNSCs and decrease apoptosis of SNSCs.

LINGO-1； spinal cord derived neural stem cells； spinal cord injury； proliferation； apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項目(81100932);中國博士后科研基金資助項目(20100481518);陜西省國際合作項目(2015KW-035)

趙晨光,男,1981-05生,博士,主治醫(yī)師

2016-11-16

R329.2

A

1007-6611(2017)03-0222-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.005