劉宏，王森，黃凱，楊宗統(tǒng)，項(xiàng)路娟，王冬冬，劉永舉，王建琳，尹燕博，

(1．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109;2．青島博隆實(shí)驗(yàn)動物有限公司，山東青島266225;3．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島266103)

不同體型比格犬血清腫瘤標(biāo)志物含量調(diào)查

劉宏1，王森1，黃凱2，楊宗統(tǒng)1，項(xiàng)路娟2，王冬冬1，劉永舉3，王建琳1，尹燕博1，2

(1．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109;2．青島博隆實(shí)驗(yàn)動物有限公司，山東青島266225;3．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島266103)

本試驗(yàn)擬對大、中、小體型3個品系的健康成年比格犬血清腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199進(jìn)行檢測，用犬腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199 ELISA試劑盒，對97只健康成年大體型比格犬、228只中體型比格犬、63只小體型比格犬的血清進(jìn)行相關(guān)腫瘤標(biāo)志物濃度測定，為比格犬腫瘤模型篩選提供參考。試驗(yàn)結(jié)果表明，小體型比格犬血清中AFP、CA125、CA153、CEA的濃度明顯低于其他兩個品系犬(P＜0．05);而CA199的濃度明顯高于中體型比格犬(P＜0．05)。大體型比格犬血清中AFP、CEA、CA125、CA153的濃度最高，小體型比格犬血清中CA199最高，推測認(rèn)為大體型比格犬患消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)腫瘤的風(fēng)險較高，小體型比格犬患腺癌的風(fēng)險較高。

比格犬;血清;腫瘤標(biāo)志物;ELISA

腫瘤是一類危害人類身體健康的疾病，尤其是惡性腫瘤，其高發(fā)病率和高死亡率嚴(yán)重威脅著人類生命安全及身心健康，腫瘤的防治是目前生物與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。由于腫瘤發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，受多因素影響，導(dǎo)致治療時機(jī)把握與治療效果不佳，故早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷成為腫瘤的治療的關(guān)鍵。

目前臨床應(yīng)用的X線檢查、超聲檢查、CT檢查、核磁共振檢查、內(nèi)腔鏡檢查等手段能從不同角度對腫瘤進(jìn)行診斷，可在一定程度上提高腫瘤的早期診斷率，但又各有其局限性［1］。腫瘤標(biāo)記物(tumor marker，TM)是在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成分泌的或是機(jī)體對腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生和/或升高的，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素酶、多胺及癌基因產(chǎn)物等［2］。腫瘤標(biāo)志物特異性強(qiáng)，僅能在腫瘤組織細(xì)胞中產(chǎn)生，正常組織細(xì)胞中不存在，且腫瘤標(biāo)志物敏感性高，僅有少量存在時即可被檢測到，有助于腫瘤的篩選及早期診斷。臨床上，以腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行的診斷已經(jīng)成為腫瘤患者的重要檢查指標(biāo)［3］。

在國內(nèi)外的科研工作中，比格犬被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域［2］，用于人類相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制、篩選治療藥物，是人類疾病研究最好的動物模型［4］。但在生理?xiàng)l件下，比格犬主要血清相關(guān)腫瘤標(biāo)志物是否存在?不同品系之間是否相同?目前還未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究擬對不同體型品系健康比格犬的主要血清相關(guān)腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、乳腺癌標(biāo)記物(CA153)、卵巢癌抗原(CA125)、胰腺癌敏感標(biāo)記物(CA199)進(jìn)行測定與比較，以豐富比格犬的生理學(xué)內(nèi)容，并為不同腫瘤模型建立的比格犬選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物12月齡以上，大體型比格犬90只，體重18～23 kg;12月齡以上，中體型比格犬228只，體重13～17 kg;12月齡以上，自繁小體型比格犬64只，體重9～12 kg。此次實(shí)驗(yàn)用比格犬均由青島博隆實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供［SCXK(魯)2012-0003］。

1．2 儀器與試劑電動臺式離心機(jī)(80－2，上海梅香儀器有限公司);酶標(biāo)儀(318C+，上海沛歐分析儀器有限公司);5種腫瘤標(biāo)志物檢測試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1．3 方法每只比格犬前肢內(nèi)側(cè)靜脈處采集血液2 mL，300 r/min×g離心5 min，取上清液待測。向96孔板中加入準(zhǔn)備好的待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30 min;洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30 min;洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min;加入終止液，用酶標(biāo)儀測定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)品制備曲線，計(jì)算待測樣品濃度。

1．4 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用GraphPad Prism Program 6 (GraphPad Software，San Diego，CA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0．05為差異顯著。

2 結(jié)果

不同體型品系成年比格犬血清中都含有AFP、CEA、CA153、CA125、CA199，且這5種腫瘤標(biāo)志物的濃度差別較大。不同體型品系比格犬間血清中AFP的含量主要集中到10～33 μg/L，不同品系之間差別較大，但大體型品系與中體型品系比格犬之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而小體型品系與其他兩種品系之間差異顯著(P＜0．05)(見圖1)。不同體型品系比格犬間血清中CEA的含量主要集中到10～21 μg/L，不同品系之間存在一定差別，但大體型品系與中體型品系比格犬之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而小體型品系與其他兩種品系之間差異顯著(P＜0．05)(見圖2)。

圖1 不同體型成年比格犬血清AFP含量

圖2 不同體型成年比格犬血清CEA含量

不同品系成年比格犬血清中CA153濃度大部分集中到3～9 U/L之間，且大體型品系與中體型品系之間的CA153含量相似，而小體型與大體型、中體型比格犬血清中CA153濃度有顯著性差異(P＜0．05)(見圖3)。不同品系成年比格犬血清中CA125濃度大部分集中到6～21 U/L之間，且大體型品系與中體型品系比格犬之間無明顯差別，小體型與大體型、中體型比格犬血清中CA125濃度有顯著性差異(P＜0．05)(見圖4)。不同品系成年比格犬血清中CA199濃度大部分集中到7～16 U/L之間，且大體型品系與中體型品系和小體型品系之間無明顯差別(P＞0．07)，而小體型品系成年比格犬血清中CA199的含量顯著高于中體型品系成年比格犬(P＜0．05)(見圖5)。

圖3 不同體型成年比格犬血清CA153含量

圖4 不同體型成年比格犬血清CA125含量

圖5 不同體型成年比格犬血清CA199含量

3 討論

自20世紀(jì)80年代以來，各種腫瘤標(biāo)志物相繼在臨床應(yīng)用于腫瘤的診斷，腫瘤標(biāo)志物的檢出具有高效、方便、標(biāo)本易獲取等優(yōu)點(diǎn)，同時也為組織學(xué)分型、臨床分期、預(yù)后判斷和療效檢測等提供重要的應(yīng)用價值［5］。比格犬作為重要的人類腫瘤研究的重要模型，已有報(bào)道人工誘發(fā)比格犬肺癌、肝癌、骨癌和乳腺癌等用于人類腫瘤模型的研究［6－7］，且也有比格犬患乳腺癌［8］等腫瘤疾病的研究報(bào)道，且大部分的研究報(bào)道主要集中到腫瘤的發(fā)生機(jī)制和臨床病例方面，而無生理狀態(tài)下腫瘤標(biāo)志物檢測的相關(guān)報(bào)道。

腫瘤標(biāo)志物最重要的價值是能明確手術(shù)、放療和藥物治療是否有效，有的還可反映腫瘤殘留量，故檢測腫瘤標(biāo)志物的濃度可為臨床提供重要的信息。不同類型腫瘤具有不同的腫瘤表面標(biāo)志物質(zhì)，目前常見的血清腫瘤標(biāo)記物主要包括AFP、CEA、CA153、CA125、CA199等。AFP是有胚肝細(xì)胞核卵黃囊產(chǎn)生的甲胎蛋白，在發(fā)生肝細(xì)胞癌、卵黃囊和胚胎性腫瘤時其血清濃度升高，是目前為止診斷原發(fā)性肝癌最敏感的標(biāo)志物［9］。CEA為基因編碼于19號染色體上的具有人類抗原決定簇的酸性糖蛋白，為胚胎性致癌抗原，于1965年發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是結(jié)腸癌的標(biāo)志物［10－11］，但是后來被認(rèn)為在各種消化道腫瘤均有所表達(dá)。單項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物的檢測可能會造成腫瘤的漏診或誤診，多種標(biāo)記物聯(lián)合檢測可提高腫瘤的檢出率。研究認(rèn)為AFP和CEA聯(lián)合診斷原發(fā)性肝癌的陽性率和特異性明顯高于單獨(dú)檢測AFP。本研究中，不同體型品系成年比格犬血清中AFP和CEA都具有明顯的差別，但二者在不同品系比格犬種變化相似，且大體型品系犬最高，而小體型品系犬的濃度明顯低于其他品系犬。這表明，AFP和CEA的濃度可作為肝癌和(或)結(jié)腸癌的重要標(biāo)志物質(zhì)，在大體型比格犬中濃度最高，表明該品系犬對消化系統(tǒng)腫瘤較為敏感，可作為消化系統(tǒng)腫瘤研究的模型動物。

CA125最初從上皮性卵巢癌檢測出的一種糖蛋白，主要應(yīng)用于卵巢癌的診斷和隨訪，其他惡性腫瘤患者血清CA125的水平也會升高，其他疾病如炎癥、肝硬化等非惡性腫瘤時，CA125可有不同程度的升高，但一般低于正常值［12］。CA153是乳腺癌的特異性指標(biāo)，其濃度增高提示患有乳腺癌、肺癌、腎癌、消化道腫瘤、評巢癌的可能性，其水平變化與乳腺癌診斷、復(fù)發(fā)相關(guān)［13］。本研究中不同體型品系成年比格犬血清中AFP和CEA都具有一定的差別，其中大體型品系和中體型品系犬相似，而在小體型品系犬中的含量明顯低于其他品系。這表明，CA125和CA153的濃度可作為卵巢癌和乳腺癌等生殖系統(tǒng)腫瘤的重要標(biāo)志物質(zhì)，在大、中體型比格犬中濃度較高，而小體型品系犬中最低，表明小體型品系犬對生殖系統(tǒng)腫瘤較不敏感，不建議作為生殖系統(tǒng)腫瘤研究的模型動物。

CA199是由Koprowski于1979年用結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1116免疫BALB/c小鼠而得到的一株腫瘤特異性單克隆116－NS199。正常人血清中含量極微，當(dāng)患者肝、膽、胰等疾病時即會出現(xiàn)含量升高，它對腫瘤的療效觀察、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移均有十分重要的臨床價值。1983年Del Villano等首先描述了血清CA199對胰腺癌的診斷意義，CA199為與腺癌高度相關(guān)的物質(zhì)，由腺癌細(xì)胞產(chǎn)生，胰腺癌、胃癌伴轉(zhuǎn)移過程中CA199明顯升高［9］。本研究中不同體型品系成年比格犬血清中CA199都具有一定的差別，其中在中體型品系含量最低，而在小體型品系犬中的含量最高，且明顯高于中體型品系犬。這表明，CA199的濃度可作為腺癌，尤其是胰腺癌的重要標(biāo)志物質(zhì)，在大、中體型比格犬中濃度較低，而小體型品系犬中最高，表明小體型品系犬對胰腺癌等腺癌相關(guān)腫瘤的發(fā)生較敏感，可作為腺癌腫瘤研究的模型動物。

綜上研究結(jié)果表明，不同體型品系成年比格犬血清腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199的濃度存在一定差異，大體型品系比格犬腫瘤標(biāo)記物較高可作為多種腫瘤模型的研究，這為篩選比格犬品系作為腫瘤研究提供了重要的基礎(chǔ)，同時對比格犬作為實(shí)驗(yàn)動物的品系繁育具有重要的指導(dǎo)意義。

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S858.292

B

0529-6005(2017)01-0075-03

2016-01-18

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA101303)

劉宏(1988-)，女，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，Email:liuhong_22188@163．com

王建琳，Email:bjsxxw@126．com;尹燕博，Email: yanboyin2011@163．com