趙晨璐，王黎霞，宋麗聰，鄭新楓，張建軍，阮文科，安健

(1．北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京昌平102206; 2．北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京房山102442)

Eimeria tenlla和E．a(chǎn)cervulina對凋亡誘導(dǎo)抑制的研究

趙晨璐1，王黎霞2，宋麗聰1，鄭新楓1，張建軍1，阮文科1，安健1

(1．北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京昌平102206; 2．北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京房山102442)

為了研究雞艾美耳屬球蟲不同種在入侵細(xì)胞早期對凋亡誘導(dǎo)抑制的差異，將柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenlla)和堆型艾美耳球蟲(E．a(chǎn)cervulina)純化的裂殖子入侵馬－達(dá)氏牛腎細(xì)胞(MDBK細(xì)胞)1．5 h后，對被入侵的細(xì)胞計數(shù)并計算入侵率;加入含6%乙醇的完全培養(yǎng)基對細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡3 h，檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，E．tenlla裂殖子和E．a(chǎn)cervulina裂殖子入侵率為21%和43%;凋亡誘導(dǎo)組的凋亡率是36．98%;柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組的凋亡率是25．77%;堆型艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組的凋亡率是28．92%。柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組與凋亡誘導(dǎo)組之間差異極顯著(P＜0.01);堆型艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組與凋亡誘導(dǎo)組之間差異極顯著(P＜0.01)。柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組與堆型艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組之間差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果提示，E．a(chǎn)cervulina裂殖子入侵細(xì)胞并起到明顯的抑制細(xì)胞凋亡作用，在入侵早期也許有類似于E．tenlla裂殖子抑制凋亡的機(jī)制;與E．tenlla裂殖子的抑制率相比略低，這可能與它的個體大小、致病能力有關(guān)。

球蟲;艾美耳屬;裂殖子;凋亡抑制;MDBK細(xì)胞

艾美耳屬的7種頂復(fù)門寄生蟲導(dǎo)致的雞球蟲病，給全世界的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，控制其發(fā)病迫在眉睫，深入研究球蟲與被入侵細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制是防治該病的基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是程序性的細(xì)胞死亡，某些病原體卻可以延長宿主細(xì)胞的生命來確保它們能在細(xì)胞內(nèi)生長、發(fā)育、繁殖。據(jù)報道，弓形蟲能夠改變細(xì)胞凋亡機(jī)制，促進(jìn)或抑制宿主細(xì)胞凋亡［1］。球蟲子孢子會在發(fā)展早期階段保護(hù)宿主細(xì)胞避免發(fā)生凋亡;另外，宿主細(xì)胞凋亡的抑制有利于柔嫩艾美耳球蟲在細(xì)胞內(nèi)生長發(fā)育［2］。

為了對球蟲的早期入侵有更全面更透徹的認(rèn)識，本試驗分別用E．tenlla和E．a(chǎn)cervulina入侵細(xì)胞，以6%乙醇的完全培養(yǎng)基為誘導(dǎo)凋亡劑，用光學(xué)顯微鏡觀察入侵情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率，分析兩種球蟲的抑制凋亡能力差異，探討球蟲與宿主細(xì)胞的作用機(jī)制，為防治球蟲病的發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株E．tenlla和E．a(chǎn)ceverlina孢子化卵囊，北京農(nóng)學(xué)院病理實驗室提供，復(fù)壯周期為3個月。

1．2 細(xì)胞MDBK細(xì)胞，本實驗室保存用于雞球蟲研究的貼壁細(xì)胞系。

1．3 試驗動物剛出殼健康農(nóng)大5號公雞雛，將其飼養(yǎng)于照明充足，經(jīng)過消毒的無球蟲環(huán)境中。用不加藥飼料喂養(yǎng)至12日齡，同時公雛雞在此過程不受污染，自由飲食。

1．4 方法

1．4.1 卵囊的感染分A，B兩組。A組:20只12日齡健康雛雞口腔灌服E．tenlla孢子化卵囊7×104個/只;B組:在A組雛雞灌服36 h后，20只無感染健康雛雞灌服E．a(chǎn)cervulina孢子化卵囊2×105個/只。

1．4．2 裂殖子的獲取及純化在灌服E．tenlla孢子化卵囊4．5 d，即灌服E．a(chǎn)cervulina卵囊3 d后，將試驗雞分別剖檢。將感染E．tenlla卵囊的雞盲腸剪開，于冰浴中刮取腸道黏膜，勻漿，離心收集沉淀，后離心收集上清，除去紅細(xì)胞等;再次離心收集沉淀，加40℃溫?zé)岬南疵撘褐貞覀溆谩?zhǔn)備DE-52纖維層析柱，將懸有裂殖子的洗脫液緩慢加入，收集E．tenlla裂殖子。E．a(chǎn)cervulina裂殖子取十二指腸用同樣的方法收集。

1．4．3 MDBK細(xì)胞的培養(yǎng)將保存于液氮中的MDBK細(xì)胞于1 min內(nèi)在37℃水浴中快速溶解，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞瓶，緩慢加入DMEM完全培養(yǎng)基后，用移液槍吹吸混勻，在細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，換新的完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞長至細(xì)胞瓶80%～90%，進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳至3～5代即可。

1．4．4 試驗分組A組:對照組;B組:凋亡誘導(dǎo)組;C組:柔嫩艾美耳球蟲組;D組:柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組;E組:堆型艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組;F組:堆型艾美耳球蟲組。每組做3個重復(fù)。

1．4．5 裂殖子的入侵分別加入細(xì)胞數(shù)量3倍的E．tenlla、E．a(chǎn)cervulina裂殖子，入侵細(xì)胞1．5 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察，對被入侵的細(xì)胞計數(shù)并計算入侵率。入侵率為每個視野中被裂殖子感染的細(xì)胞占視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比，重復(fù)3次取平均值。

1．4．6 MDBK細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)加入含有6%乙醇的完全培養(yǎng)基3 h進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡。

1．4．7 凋亡的檢測將處理后的細(xì)胞離心收集沉淀，加Binding Buffer重懸;加入PI和Annexin VFITC，混合均勻后避光常溫孵育15 min;再加入Binding Buffer檢測［3］。

1．4．8 數(shù)據(jù)處理用SPSS軟件對多組MDBK細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)之間的差異進(jìn)行分析比較，當(dāng)P＜0.05，差異顯著;P＜0.01，差異極顯著。

2 試驗結(jié)果

2.1 柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲裂殖子的入侵E．tenlla裂殖子入侵率為21%，E．a(chǎn)cervulina裂殖子入侵率為43%(圖1A)、(圖1B)。

圖1 裂殖子入侵細(xì)胞Fig.1 Merozoites invade cells

2．2 流式細(xì)胞術(shù)對凋亡的檢測對照組的凋亡率是2．64%(圖2A);凋亡誘導(dǎo)組的凋亡率是36．98% (圖2B);柔嫩艾美耳球蟲組的凋亡率是4.19%(圖2C);柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組的凋亡率是25．77%(圖2D)堆型艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組的凋亡率是28．92%(圖2E);堆型艾美耳球蟲組的凋亡率是7．53%(圖2F)。柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組與凋亡誘導(dǎo)組之間差異極顯著(P＜0.01)，抑制凋亡30%;堆型艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組與凋亡誘導(dǎo)組之間差異極顯著(P＜0.01)，抑制凋亡22%。柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組與堆型艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)組之間差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDBK細(xì)胞在各種處理方式下的凋亡水平

細(xì)胞凋亡線粒體途徑是通過介導(dǎo)bcl-2相關(guān)X蛋白基因(bcl-2 associated X protein，bax)的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡［4］。本試驗發(fā)現(xiàn)，E．a(chǎn)cervulina在入侵早期也許有類似于E．tenlla或弓形蟲抑制凋亡的機(jī)制，通過caspase蛋白及各種抗凋亡或促凋亡因子的相互抗衡，達(dá)到抑制宿主細(xì)胞凋亡的作用。

E．tenlla卵囊平均22×19 μm，E．a(chǎn)cervulina卵囊平均大小為8.3×14.6 μm［5］。本研究觀察到，E．a(chǎn)cervulina裂殖子的長度為6～9 μm，而E．tenlla裂殖子為10～17 μm。E．tenlla，E．a(chǎn)cervulina裂殖子入侵率分別為21%和43%;當(dāng)細(xì)胞加入凋亡誘導(dǎo)劑，兩者抑制凋亡率分別為22%和30%;雖然在入侵率的對比上，E．a(chǎn)cervulina裂殖子高于E．tenlla裂殖子，但從結(jié)果看出，前者沒有后者抑制凋亡能力強(qiáng)，這也許因為裂殖子抑制凋亡能力與個體大小，裂殖子個體入侵能力有關(guān)。個體小從而產(chǎn)生的抑制凋亡的因子相對偏少。

E．tenlla在雞盲腸上皮細(xì)胞中完成內(nèi)源性生長階段［6］。E．tenlla常在感染后引起盲腸高度腫脹和嚴(yán)重出血，出現(xiàn)血便，死亡率最高［7］。E．a(chǎn)cervulina主要寄生于雞十二指腸，其次為空腸;病變集中在十二指腸，腸壁有充血、壞死現(xiàn)象，黏膜增厚，嚴(yán)重時甚至死亡。這兩種艾美耳球蟲寄生部位，產(chǎn)生病理現(xiàn)象的差異說明兩種蟲子有著不完全一樣的入侵機(jī)制和致病作用，也許與其抑制宿主細(xì)胞凋亡能力的差異有關(guān)。

本試驗表明，E．a(chǎn)cervulina裂殖子入侵MDBK細(xì)胞率為43%，高于E．tenlla裂殖子入侵率21%;E．a(chǎn)cervulina裂殖子入侵細(xì)胞并起到明顯的抑制細(xì)胞凋亡作用，E．a(chǎn)cervulina在入侵早期也許有類似于E．tenlla抑制凋亡的機(jī)制，與E．tenlla裂殖子的抑制率相比略低，這可能與它的個體小、致病能力弱有關(guān)，兩者抑制機(jī)制的具體差異有待研究。

［1］Laliberte J，Carruthers V B．Host cell manipulation by the human pathogen Toxoplasma gondii［J］．Cellular and Molecular Life Sciences，2008(65):1900-1915．

［2］Zhang Y，Zheng M X，Xu Z Y，et al．Relationship between Eimeria tenella development and host cell apoptosis in chickens［J］．Poultry Science，2015，94(12):2970-2979．

［3］宋麗聰，王黎霞，劉新月，等．柔嫩艾美耳球蟲裂殖子對侵入細(xì)胞凋亡抑制通路的研究［J］．中國獸醫(yī)雜志，2016，52(1): 14-16．

［4］王雪峰，何援利．凋亡調(diào)節(jié)基因bcl-2/bax與卵巢早衰的關(guān)系［J］．生殖與避孕，2008，28(8):487-490．

［5］孔繁瑤．家畜寄生蟲學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1997:330-331．

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Theinduced Apoptosis inhibited by Eimeria tenlla and E．a(chǎn)cervulina

ZHAO Chen-lu1，WANG Li-xia2，SONG Li-cong1，ZHENG Xin-feng1，ZHANG Jian-jun1，RUAN Wen-ke1，AN Jian1
(1．Animal Science and Technology College，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China;2．Institute of animal husbandry and veterinary medicine，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China)

The aim of study is to investigate the apoptosis inhibition differences of the cells invaded by kinds of Eimeria during early invasion stage．The E．tenlla and E．a(chǎn)cervulina merozoites were inoculated in MDBK cells for 1．5 hours，and both the invaded cells were counted and the ratio of invasion was calculated．Completed medium containing 6%ethanol was added to the cells to induce cell apoptosis．After 3 hours，cell apoptosis was detected．The results indicated that the E．tenlla merozoites invasion rate was 21%and the E．a(chǎn)cervulina merozoites invasion rate was 43%．The apoptosis rate in the induction of apoptosis group was 36．98%．The induction of apoptosis with E．tenlla group was 25．77%．The apoptosis rate in the induction of apoptosis with E．a(chǎn)cervulina group was 28．92%．The apoptosis rate of the control group was 2．64%．The difference between induction of apoptosis with E．tenlla group and induction of apoptosis group was significant(P＜0.01)．The difference between induction of apoptosis with E．a(chǎn)cervulina group and induction of apoptosis group was significant(P＜0.01)．The difference between induction of apoptosis with E．tenlla group and induction of apoptosis with E．a(chǎn)cervulina group was significant(P＜0.05)．The results suggest that，E．a(chǎn)cervulina merozoites could invade cells and play a significant role in inhibition of apoptosis during the early state of invasion．E．a(chǎn)cervulina merozoites may have some inhibition mechanism of apoptosis as same as E．tenlla merozoites．The inhibition rate of E．a(chǎn)cervulina merozoites is slightly lower than the E．tenlla merozoites，which may be due to its body size or disease-causing ability．

Coccidiosis;Eimeria;Merozoites;Apoptosis;MBDK cell

AN Jian

S855.9

A

0529-6005(2017)01-0013-03

2016-05-09

趙晨璐(1992-)，女，碩士生，主要從事獸醫(yī)寄生蟲與分子生物學(xué)研究，E-mail:1084188785@qq．com

安健，E-mail:anyh001@bac．edu．cn