周海嬌　何木　王晨陽　石博文

摘要：近幾年，微生物發(fā)酵技術(shù)在相關(guān)工程技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)獲得了相當(dāng)廣泛的應(yīng)用，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用非常普遍。隨著微生物科學(xué)的不斷進(jìn)步，人們對微生物發(fā)酵工藝的研究也越來越加深入?；诖?，文章首先分析了培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件對微生物發(fā)酵的影響，然后探討了微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法，以期為相關(guān)研究提供一些理論借鑒。

關(guān)鍵詞：微生物；發(fā)酵工藝；工藝優(yōu)化；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：TQ920 文章編號：1009-2374（2017）01-0031-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.01.015

根據(jù)已有的相關(guān)參考文獻(xiàn)可知，微生物發(fā)酵影響的因素包括發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源，無機(jī)鹽，pH值以及溫度等，本文對這些影響因素展開了詳細(xì)的研究。微生物發(fā)酵工藝的優(yōu)化可以有效地提升發(fā)酵生產(chǎn)效率，進(jìn)而使得發(fā)酵生產(chǎn)成本有效降低。針對于此本文探討了正交試驗設(shè)計法、響應(yīng)面設(shè)計法以及Plackett-Burman設(shè)計法等微生物發(fā)酵工藝的優(yōu)化方法。

1 培養(yǎng)基對發(fā)酵的影響

微生物發(fā)酵的培養(yǎng)基在微生物生長或者代謝時提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)和能量，對發(fā)酵產(chǎn)物的生物合成效率以及保障產(chǎn)品的質(zhì)量可謂是意義重大。在微生物發(fā)酵中由于菌種和發(fā)酵條件的差異以及發(fā)酵階段的不同，所需的培養(yǎng)基成分也有所差異。在通常情況下，碳源、氮源、無機(jī)鹽以及生長因子是微生物生長的四大營養(yǎng)要素。

1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源和氮源的選擇

碳源用于提供微生物能量來源、構(gòu)建細(xì)胞以及形成產(chǎn)物。碳源包括單糖、雙糖、多糖、天然復(fù)合物、油脂等，比如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及豆油等。氮源是微生物蛋白質(zhì)和其他含氮有機(jī)物的重要來源，與此同時，氮源也參與形成含氮產(chǎn)物。氮源包括無機(jī)氮源以及有機(jī)氮源，比如氨鹽、硝酸鹽、蛋白胨以及豆粉等。需要保持培養(yǎng)基配方中碳/氮源比例均衡，從而保證滿足菌體的正常生長，同時提高產(chǎn)物的合成速率。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中無機(jī)鹽對發(fā)酵的影響

無機(jī)鹽對代謝產(chǎn)物的生成及微生物的正常生長都具有相當(dāng)重要的影響。在微生物的生長代謝過程中，磷參與了微生物細(xì)胞中核酸等輔酶的構(gòu)成，是微生物能量代謝、生長的重要因素之一。在蘇云金芽抱桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物蘇云金素的分子結(jié)構(gòu)中包含磷酸根，所以在其發(fā)酵培養(yǎng)基中添加更多磷酸鹽，更有利于產(chǎn)物蘇云金素的合成。鈣離子在微生物發(fā)酵過程中的主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理狀態(tài)，比如說維持細(xì)胞的膠體狀態(tài)、降低細(xì)胞膜的通透性等。與此同時，在大多數(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基里面，添加適量的CaC03，能夠?qū)Πl(fā)酵液含菌量的變化起到相當(dāng)明顯的影響，其主要原因是CaC03的添加對發(fā)酵液的pH值具有非常良好的緩沖作用，從而大大改善了菌體的生長環(huán)境。鎂元素是許多酶的催化劑。錳、鋅、鐵、鉬以及鈷等元素是微生物所需要的微量元素。已有大量的相關(guān)研究表明，錳離子是枯草芽抱桿菌生長必不可少的元素，有很多相關(guān)方面的學(xué)者及研究人員通過研究指出，將適量的MnCl2添加到發(fā)酵培養(yǎng)基里面，能夠使枯草芽抱桿菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌物質(zhì)活性得以有效地提升。

2 培養(yǎng)條件對發(fā)酵的影響

2.1 種子質(zhì)量對發(fā)酵的影響

微生物發(fā)酵中接入的種子質(zhì)量對菌的生長以及產(chǎn)物的合成具有非常大的影響。種子的質(zhì)量取決于以下兩個方面，其分別為接種量以及接種的種齡。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入合適的接種量以及種齡適宜的優(yōu)質(zhì)種子液，能夠使目標(biāo)微生物更加迅速地進(jìn)入到對數(shù)生長期，從而使發(fā)酵周期大大地減短，進(jìn)而促使產(chǎn)物質(zhì)量得以有效提升。如果種齡過長則會直接導(dǎo)致菌體過早的發(fā)生衰退，菌體的生產(chǎn)能力也隨之而有一定程度的下降；如果種齡過短，則會直接導(dǎo)致菌體生長緩慢，產(chǎn)物合成時間大大推遲。若接種量過小，那么便會使得菌體細(xì)胞的生長量變小，從而使得對數(shù)生長期的時間、發(fā)酵時間有所延長，進(jìn)而對一些酶及產(chǎn)物的生成造成極為不利的影響；如果接種量過大，那么便會直接加快微生物培養(yǎng)基的消耗速度，促使菌體生長過快，進(jìn)而使得菌體提前進(jìn)入到穩(wěn)定期與衰亡期，對產(chǎn)物的合成造成極大的負(fù)面影響。

2.2 溫度對發(fā)酵的影響

溫度是保證酶活性的重要條件之一。過高的溫度環(huán)境會對微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性造成一定程度的破壞，嚴(yán)重地抑制微生物的正常生長，并且微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在過高的溫度環(huán)境下極易發(fā)生凝固或者變性，最終造成細(xì)胞死亡；而過低的溫度環(huán)境也會對微生物的生長造成較大程度的抑制作用，故在發(fā)酵過程中必須保證最為適宜的溫度環(huán)境。不同微生物菌種的生長溫度不同，而生長與產(chǎn)物合成階段的最適溫度也有差異。在發(fā)酵溫度的設(shè)計過程中要綜合考慮其他的發(fā)酵條件及因素，比如培養(yǎng)基成分、能源消耗、發(fā)酵周期和產(chǎn)率水平等，必要時還可以考慮變溫培養(yǎng)。

2.3 pH值對發(fā)酵的影響

最適pH值在很大程度上會直接影響到不同種類微生物生長以及產(chǎn)物的合成。pH值對微生物的影響主要是影響各種酶的生命活力，進(jìn)而使得微生物的新陳代謝與生長繁殖發(fā)生較大的改變；除此之外，pH值對營養(yǎng)物質(zhì)的利用以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有相當(dāng)重要的影響。pH值會顯著地影響培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物以及中間代謝產(chǎn)物的解離，進(jìn)而使微生物對這些物質(zhì)的利用與吸收發(fā)生一定的改變。常亞飛等人在探究蘇云金芽抱桿菌的過程中發(fā)現(xiàn)其芽抱萌發(fā)率在pH值7.0時最高，其芽抱萌發(fā)率在pH值過大或者過小時僅為40%，除此之外，若培養(yǎng)基pH值過高或者過低，還會直接影響到毒素產(chǎn)量，甚至有可能導(dǎo)致完全不產(chǎn)生伴胞晶體毒素。

2.4 溶氧對發(fā)酵的影響

溶氧是好氧微生物生長所必須的關(guān)鍵因素之一，只有提供足夠量的氧才能維持菌的正常生長、代謝。溶氧對次生代謝產(chǎn)物的合成途徑影響顯著，而且還會對代謝的合成速度造成一定程度的影響。如果氧不足，那么便會造成微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的有氧氧化過程不能徹底地進(jìn)行，從而影響發(fā)酵液pH值，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，與此同時，還會影響產(chǎn)物合成所需的前體物質(zhì)的積累，進(jìn)而影響菌體的生長以及產(chǎn)物的生成。在微生物發(fā)酵的過程中，通過調(diào)節(jié)通氣量、攪拌速率、罐壓可以有效控制和保證氧的供給。搖瓶發(fā)酵可以采取降低裝液量、增加轉(zhuǎn)速來有效地增加溶氧量。葉云峰等人通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，裝液量對枯草芽抱桿菌B47產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響是最為顯著的，菌體生成產(chǎn)物的能力隨裝液量的減少而大大增多，這充分地說明溶氧對產(chǎn)物合成具有正面的影響。

3 微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法

通常情況下，微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化可以從培養(yǎng)基成分比例及培養(yǎng)條件兩個方面進(jìn)行優(yōu)化。最近幾年以來，隨著統(tǒng)計學(xué)在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的有效應(yīng)用，優(yōu)化方法從單因子設(shè)計法逐步發(fā)展成為正交試驗設(shè)計、均勻設(shè)計等方法，更加系統(tǒng)高效。愈來愈多的研究人員通過統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬與優(yōu)化，利用Plackett-Burman試驗設(shè)計方案來對優(yōu)化因子進(jìn)行科學(xué)的篩選，再在中心組合實驗設(shè)計基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法以達(dá)到優(yōu)化的目的。本文對目前集中比較常用的優(yōu)化方法進(jìn)行了比較詳細(xì)的探討。

3.1 正交試驗設(shè)計法

正交試驗設(shè)計法是利用正交表來分析多因素問題，通過多因素多水平實驗得出相應(yīng)的結(jié)果，然后再通過直接對比與直觀分析來找出最佳的因素水平組合，通過這種方法可以對影響微生物發(fā)酵的主要因素進(jìn)行確定。正交試驗設(shè)計法具有方法簡單、效率高以及工作量小等許多顯著的優(yōu)點，所以在對微生物發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化的過程中，正交試驗設(shè)計法是應(yīng)用得最為普遍的方法。

3.2 Plackett-Burman設(shè)計法

Plackett-Burman法主要針對因子數(shù)較多且未確定眾因子相對于響應(yīng)變量的顯著影響，采用的試驗設(shè)計方法。能夠及時有效地篩選出對試驗結(jié)果具有顯著影響的關(guān)鍵因素。在通常情況下，使用Plackett-Burman設(shè)計法開展的N次試驗最多能夠研究（N-1）個因素，對每個因素取兩個水平，通常是設(shè)低水平為原始培養(yǎng)條件，高水平為低水平的1.25倍，通過對各個因素兩水平的差異與整體的差異進(jìn)行對比分析來對因素顯著性進(jìn)行確定。需要加以注意的是，如果因素水平選取得不合適有可能導(dǎo)致Plackett-Burman試驗結(jié)果無效，從而需要重新選取因素來進(jìn)行再一次的試驗；如果Plackett-Burman試驗的模型有效，那么則可以確定對試驗具有顯著影響的因素，然后下一步可以通過開展響應(yīng)面設(shè)計等方法來篩選出最優(yōu)的條件。袁輝林等利用Plackett-Burman設(shè)計方法獲得了預(yù)期結(jié)果。

3.3 響應(yīng)面設(shè)計法

響應(yīng)面設(shè)計法主要結(jié)合統(tǒng)計分析、數(shù)學(xué)建模等方法經(jīng)過試驗設(shè)計來對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并利用多元二次回歸方程來擬合函數(shù)關(guān)系，進(jìn)而實現(xiàn)優(yōu)化工藝參數(shù)的目的。響應(yīng)面設(shè)計法對變量因素比較多的微生物發(fā)酵的參數(shù)優(yōu)化效果是相當(dāng)良好的，在Plackett-Burman試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，可以準(zhǔn)確地確定出最優(yōu)培養(yǎng)基配方、發(fā)酵因素等，從而有效地提高微生物發(fā)酵的產(chǎn)量。響應(yīng)面設(shè)計法的適用范圍是非常廣泛的，其在生物學(xué)、制藥、醫(yī)學(xué)等方面已經(jīng)獲得了非常成熟的應(yīng)用，且取得了良好的應(yīng)用效果。

4 結(jié)語

隨著科技的不斷進(jìn)步以及生物技術(shù)水平的持續(xù)提升，微生物發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)得到了非常廣泛的發(fā)展，除了在農(nóng)業(yè)與工業(yè)方面獲得了廣泛的應(yīng)用外，其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用更加值得期待。利用微生物發(fā)酵技術(shù)可以有效地解決許多正常生產(chǎn)不能夠解決的難題。合理運用微生物發(fā)酵技術(shù)，并對發(fā)酵工藝進(jìn)行持續(xù)地優(yōu)化與改進(jìn)，可以有效地提升生產(chǎn)效率，推動發(fā)酵工程技術(shù)不斷前進(jìn)與健康發(fā)展，從而擴(kuò)大微生物發(fā)酵在各領(lǐng)域的應(yīng)用價值。

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作者簡介：周海嬌（1985-），女，江蘇連云港人，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司主任，工程師，碩士，研究方向：生物制藥。

（責(zé)任編輯：黃銀芳）