張 聰，曹立宇，李玉潔

胃癌晚期患者預(yù)后較差，5年生存率亦較低，在疾病早期，大多數(shù)患者缺乏典型的臨床癥狀，且目前胃癌缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物，多數(shù)患者就醫(yī)時已是晚期，因此探索新的有實(shí)際臨床意義的腫瘤標(biāo)志物是目前診治胃癌的重要任務(wù)之一。Runx家族包含3個成員，分別是Runx-1、Runx-2、Runx-3,其中Runx-3為轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)節(jié)特異性的效應(yīng)基因來發(fā)揮抑癌作用，并參與正常胃黏膜細(xì)胞的生長、凋亡以及分化等過程[1]。國內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果表明，Runx-3在調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞的生長、凋亡以及分化等過程中TGF-β-catenin信號通路起著重要的中介作用。β-catenin是一種多功能糖蛋白，為環(huán)連蛋白家族成員之一[2]，可激活Wnt通路，進(jìn)而在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3]。本組實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化法檢測早期胃癌內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection, ESD)標(biāo)本中Runx-3、β-catenin蛋白的表達(dá)及臨床意義，為胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷探索新方法。

1 材料與方法

1.1材料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)鏡中心于2014年1月～2015年12月之間行ESD后明確診斷為早期胃癌的標(biāo)本49例，其中男性36例，女性13例，發(fā)病年齡(65.2±8.7)歲；另選取正常胃黏膜30例作為對照組。所有病例均經(jīng)兩位病理專家復(fù)診并參照WHO(2012)中胃黏膜上皮性病變的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。

1.2方法所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，4 μm厚連續(xù)切片，切片分別作HE及免疫組化染色。用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。實(shí)驗(yàn)操作步驟按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，Runx-3一抗稀釋濃度為1 ∶600，β-catenin一抗為工作液，免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司。免疫組化采用EnVision兩步法。

1.3結(jié)果判定Runx-3蛋白免疫組化陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核；β-catenin蛋白免疫組化陽性表達(dá)可定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)；陽性細(xì)胞呈棕黃色。采用半定量積分法進(jìn)行染色結(jié)果的判讀，隨機(jī)選取10個10×40倍視野：(1)以陽性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的比例計(jì)分：≤25%為1分，26%～50%為2分，﹥50%為3分；(2)根據(jù)陽性細(xì)胞染色的強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～3分為陰性(-)，4～6分為陽性(+)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)各組率之間的差異；相關(guān)性分析采用Spearman法分析檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Runx-3和β-catenin蛋白在正常胃黏膜及早期胃癌組織中的表達(dá)Runx-3在正常胃黏膜組織及早期胃癌組織中的陽性率分別為86.67%(26/30)、34.69%(17/49)；Runx-3蛋白在正常胃黏膜中的表達(dá)顯著高于早期胃癌組織(P<0.05)。β-catenin蛋白在正常胃黏膜中為完整的細(xì)胞膜表達(dá)，異位表達(dá)(質(zhì)/核表達(dá))率為0(0/30)，其在早期胃癌組織中的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均有表達(dá)，其異位表達(dá)率為75.51%(37/49)；β-catenin蛋白在正常胃黏膜組織及早期胃癌組織的細(xì)胞膜陽性率分別為100%(30/30)、57.14%(28/49)。β-catenin蛋白在早期胃癌組織中的異位表達(dá)率顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05，表1，圖1～6)。

2.2Runx-3蛋白表達(dá)與早期胃癌臨床病理特征的關(guān)系Runx-3蛋白在早期胃癌組織細(xì)胞核的表達(dá)與患者年齡、性別、腫塊直徑、浸潤深度等無關(guān)(P>0.05)，但與脈管侵犯有關(guān)(P<0.05)；Runx-3蛋白在早期胃癌組織細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)與患者年齡、性別、腫塊直徑、浸潤深度、脈管侵犯等均無關(guān)(P>0.05，表2)。

①②③④⑤⑥

圖1正常胃黏膜組織的HE染色圖2早期胃癌內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)組織的HE染色圖3Runx-3蛋白在早期胃癌組織中的表達(dá)(胞核陽性)，EnVision兩步法圖4Runx-3蛋白在早期胃癌組織中胞核和胞質(zhì)表達(dá)缺失，EnVision兩步法圖5β-catenin蛋白在正常胃黏膜組織中的表達(dá)(胞膜陽性)，EnVision兩步法圖6β-catenin蛋白在早期胃癌內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)組織的細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)，EnVision兩步法

2.3β-catenin蛋白表達(dá)與早期胃癌臨床病理特征的關(guān)系β-catenin蛋白在早期胃癌組織細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)與患者年齡、性別、腫塊直徑、浸潤深度、脈管侵犯等均無關(guān)(P>0.05)；β-catenin蛋白在早期胃癌組織細(xì)胞膜的表達(dá)與患者年齡、性別、腫塊直徑、浸潤深度等均無關(guān)(P>0.05)，但是與脈管侵犯有關(guān)(P<0.05，表3)。

2.4早期胃癌中Runx-3蛋白與β-catenin蛋白表達(dá)的關(guān)系Runx-3和β-catenin蛋白在早期胃癌組織中的表達(dá)經(jīng)Pearson等級相關(guān)分析處理后顯示(表4)：Runx-3蛋白細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)與β-catenin蛋白細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)無關(guān)(r=0.040，P=0.778)；Runx-3蛋白細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)與β-catenin蛋白細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.337，P=0.039；r=0.047，P=0.047)；β-catenin蛋白細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)與Runx-3蛋白細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.237，P=0.044；r=-0.237，P=0.044)；β-catenin蛋白細(xì)胞核的表達(dá)與Runx-3蛋白細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)均無關(guān)(r=-0.023，P=0.873；r=-0.023，P=0.873)。β-catenin蛋白細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)與Runx-3蛋白細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.314，P=0.026；r=0.314，P=0.026)。

表1 Runx-3和β-catenin在正常胃黏膜及早期胃癌組織中的表達(dá)

ESD標(biāo)本.內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)標(biāo)本

表2 Runx-3表達(dá)與早期胃癌臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

表3 β-catenin表達(dá)與早期胃癌臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

表4 早期胃癌中Runx-3蛋白與β-catenin蛋白表達(dá)之間的關(guān)系

*P<0.05

3 討論

在哺乳動物中，Runx-1、Runx-2、Runx-3,三者之間存在廣泛的相似性，并且在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平受到協(xié)同調(diào)控[4-6]。人們通過基因敲除等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：Runx-1基因在胚胎造血中發(fā)揮重要作用，Runx-2基因則與閉鎖顱骨的發(fā)生、發(fā)育相關(guān)，Runx-3在神經(jīng)發(fā)育、胸腺發(fā)生以及胃上皮的分化和凋亡中表現(xiàn)出作用[8]。近年人們發(fā)現(xiàn)在食管癌、結(jié)直腸癌、肝癌、甲狀腺癌及乳腺癌中存在Runx-3基因的異常表達(dá)，且與腫瘤分化、分期及預(yù)后等相關(guān)[7-11]。Chen等[11]通過免疫組化及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)，食管癌中Runx-3蛋白低表達(dá)，且其低表達(dá)與臨床分期顯著相關(guān)(P<0.05)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Runx-3基因的表達(dá)可明顯抑制食管癌細(xì)胞的遷移、侵襲等，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Runx-3基因可能成為食管癌的治療靶點(diǎn)。Lim等[12]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，Runx-3的低表達(dá)與胃癌的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)，但其機(jī)制尚未完全明了，其失活和缺失是早期胃癌發(fā)生的關(guān)鍵因素，減少Runx-3的表達(dá)與生存期呈負(fù)相關(guān)，是患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素，另發(fā)現(xiàn)，Runx-3基因恢復(fù)表達(dá)之后，胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移受到明顯抑制。

β-catenin蛋白是起初被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞間黏附連接中發(fā)揮作用；除此之外，β-catenin亦是Wnt信號通路中極其重要的效應(yīng)因子，在細(xì)胞的增殖及分化中起重要作用，其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致原癌的基因激活及周期調(diào)控基因異常，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。β-catenin蛋白可定位于細(xì)胞的不同部位，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核(可單獨(dú)或同時表達(dá))。國內(nèi)外多種研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤，如肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等，β-catenin蛋白的異常表現(xiàn)為β-catenin蛋白在細(xì)胞膜的表達(dá)缺失而在細(xì)胞質(zhì)/核出現(xiàn)異常累積，多項(xiàng)研究[14-16]報道β-catenin蛋白表達(dá)的缺失在胃癌中是一個較為普遍的現(xiàn)象。金雯等[17]應(yīng)用免疫組化法檢測181例結(jié)直腸癌組織中β-catenin蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白異位陽性率為56.9%，顯著高于正常黏膜組(P<0.05)。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化法觀察Runx-3、β-catenin蛋白在早期胃癌中的表達(dá)水平，結(jié)果與大多研究結(jié)果相一致，說明Runx-3及β-catenin蛋白在早期胃癌的發(fā)生和脈管侵犯中扮演重要角色，可作為早期胃癌診斷的參考指標(biāo)。

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