陳大霞+王鈺+張雪+潘媛+李隆云

[摘要]采用SCoT分子標(biāo)記分析4種黃連屬藥用植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，并用POPGENE計(jì)算遺傳參數(shù)，TREECONW軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明：28條引物共檢測(cè)到434條帶，其中多態(tài)性條帶430條；各遺傳參數(shù)均表明黃連屬藥用植物種間的遺傳多樣性極為豐富（種間PPB=99.1%，N_a=1.990 6，N_e=1.329 3，H=0.212 2，I=0.337 8），但種內(nèi)遺傳多樣性較低（種內(nèi)PPB=16.8%，N_a=1.168 2，N_e=1.073 0，H=0.043 7，I=0.067 7）；遺傳分化系數(shù)G_st=0.794 0，說明79.4%的遺傳變異來源于種間；同種黃連屬藥用植物的不同植株均聚在一起，證實(shí)SCoT分子標(biāo)記可作為黃連屬藥用植物親緣關(guān)系研究的有效方法之一。

[關(guān)鍵詞]黃連屬； SCoT； 藥用植物； 親緣關(guān)系

[Abstract]The genetic diversity and genetic relationship among four medicinal species of Coptis were detected by the approach of sequence-related amplified polymorphism （SCoT）. The associated genetic parameters were calculated by POPGENE1.31. The systematic diagram of genetic relationship were clustered by TREECONW. The results showed that a total of 434 bands were produced by using 28 primers， of which 430 were polymorphic loci. There was a high level of genetic diversity among species （PPB=99.1%，N_a=1.990 6，N_e=1.329 3，H=0.212 2，I=0.337 8）. However， genetic diversity was lower within species， the average of genetic parameters wasPPB=16.8%，N_a=1.168 2， N_e=1.073 0，H=0.043 7，I=0.067 7. The Nei′s genetic differentiation coefficient was 0.794 0， that indicated that most of the genetic variation existed among species. By clustering analysis， different individuals gathered in the same group. The results confirmed that SCoT marker can be used as one of the effective methods to reveal the genetic diversity and relationship among medicinal species of Coptis.

[Key words]SCoT； Coptis； medicinal plant； genetic relationship

黃連為名貴常用中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國(guó)已有2 000多年的藥用歷史，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效。我國(guó)分布的黃連屬植物中黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連C. deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.及云南黃連C. teetoides C.Y.Cheng.是《中國(guó)藥典》各版本收錄藥材黃連的基原植物 [2]。此外，分布于四川峨眉、雅安與洪雅地區(qū)的峨嵋野連C. omeiemsis （Chen） C.Y.Cheng.、西藏南部昌都地區(qū)的西藏黃連C. teeta Wall.及四川馬邊一帶的線萼黃連C. linearisepala T.Z.Wang et C.K.hsieh.等多種栽培或野生黃連屬植物的根莖作為藥用?！度毡舅幘址健烦蛰d了《中國(guó)藥典》收錄藥材黃連的基原植物外，還收載了日本黃連C.japonica Makino.。因此，理清黃連屬法定用種及地方用種的親緣關(guān)系，準(zhǔn)確進(jìn)行基原鑒別對(duì)確保黃連的臨床用藥安全具有重要意義。

黃連屬藥用植物親緣關(guān)系的研究及鑒別早期主要側(cè)重于外部形態(tài)特征^[1]、數(shù)量分類^[2]及核型研究^[3-4]。近年來，將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于黃連屬藥用植物遺傳多樣性與親緣關(guān)系的研究報(bào)道逐漸增多。本文以黃連屬的4種藥用植物為研究對(duì)象，采用SCoT（sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記）分子標(biāo)記技術(shù)^[5]研究黃連屬藥用植物種間的遺傳特征，探討物種間的親緣關(guān)系，為黃連屬藥用植物的鑒定建立新方法，為形態(tài)分類提供分子水平的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試黃連 供試的黃連屬4種藥用植物見表1，其中黃連為長(zhǎng)期人工栽培種，峨眉黃連與三角葉黃連為就地保護(hù)撫育與栽培，日本黃連為引進(jìn)栽培。采集植株的幼嫩葉片洗凈晾干后，放入裝有足量硅膠的自封袋快速干燥?；氐綄?shí)驗(yàn)室后，取出葉片提取基因組DNA。每種藥用植物均采集24株。

1.2 儀器與試劑 PCR儀（S1000 Thermal Cycler，美國(guó)BIO-RAD）、凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR，美國(guó)BIO-RAD）、超微量分光光度計(jì)（ND-2000，美國(guó)Thermo Scientific）、電泳儀（DYY-6C型，北京六一）、電泳槽（DYCP-31F，北京六一）。

SCoT引物（上海生工）、植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根）、Trans2K Plus DNA Marker （北京全式金）、TaqDNA聚合酶（日本TOYOBO）、dNTPs（日本TOYOBO）、GelRed核酸凝膠染料（美國(guó)Biotium）、瓊脂糖（進(jìn)口分裝），其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 基因組DNA的提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒提取4種黃連屬藥用植物，共計(jì)96個(gè)植株的基因組DNA，濃度和純度采用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。擴(kuò)增時(shí)，將DNA濃度稀釋至40 mg·L^-1。

1.4 PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè) 從Collard和Mackill^[5]開發(fā)的SCoT引物中篩選出28條擴(kuò)增條帶清晰的引物用于SCoT-PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。SCoT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15 μL，內(nèi)含1×PCRbuffer，200 μmol·L^-1 dNTP，1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺，0.4 μmol·L^-1引物，1 U TaqDNA聚合酶和40 ng模板，不足部分用滅菌的超純水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；然后94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，36 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2.5 μL 6×DNA 上樣緩沖液（內(nèi)含GelRed核酸凝膠染料）混勻后，以1×TAE為電泳緩沖液在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，電壓150 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距凝膠前沿大約2～3 cm時(shí)停止電泳，取出凝膠在成像系統(tǒng)上觀察、照相與保存。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)擴(kuò)增條帶的電泳遷移率及其有無統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，有帶記“1”，無帶記“0”。聚類分析采用TREECONW軟件進(jìn)行，遺傳參數(shù)采用POPGENE version軟件計(jì)算，包括多態(tài)位點(diǎn)百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）、表觀等位基因數(shù)量（observed number of alleles， N_a）、等位基因有效值（Effective number of alleles，N_e）、Nei′s基因多樣度指數(shù)（Nei′s gene diversity，H）、Shannon′s多樣性信息指數(shù)（I）、總的基因多樣度（Whole genetic diversity，H_t）、種內(nèi)基因多樣度（genetiv diversity within population，H_s）、種間基因多樣性（genetic diversity among populations，D_st）、基因分化系數(shù)（genetic differentiation，G_st）、基因流（gene flow，N_m）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT標(biāo)記的擴(kuò)增多態(tài)性 篩選出28條擴(kuò)增譜帶清晰并呈現(xiàn)多態(tài)性的引物用于黃連屬4種藥用植物的親緣關(guān)系分析， SP21的擴(kuò)增圖譜見圖1。28條SCoT引物共擴(kuò)增出434條帶，其中有430條為多態(tài)性條帶，占總擴(kuò)增條帶的99.1%。每個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)在7～22條，平均15.5條，其中多態(tài)性條帶數(shù)7～22條，平均15.4條。從以上SCoT標(biāo)記的擴(kuò)增多態(tài)性數(shù)據(jù)可看出供試的4種黃連屬藥用植物遺傳多樣性極為豐富。

2.2 種間與種內(nèi)的SCoT遺傳多樣性 POPGENE計(jì)算的各種遺傳參數(shù)表明黃連屬4種藥用植物種間的遺傳多樣性非常豐富，見表3。種間的PPB=99.1%，N_a=1.990 6，N_e=1.329 3，H=0.212 2，I=0.337 8。但種內(nèi)的遺傳多樣性極低，且變化幅度不大：PPB在10.4%～24.9%，平均為16.8%；N_a變化幅度在1.103 5～1.249 4，平均為1.168 2；N_e變化幅度在1.041 3～1.093 4，平均為1.073 0；H變化幅度在0.026 0～0.057 4，平均為0.043 7；I變化幅度在0.042 1～0.090 5，平均為0.067 7）。

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析 在假設(shè)遺傳平衡條件下計(jì)算出供試材料總基因多樣性H_t=0.212 2，其中種內(nèi)基因多樣性H_s=0.043 7，種間的基因多樣度性（D_st=H_t-H_s）為0.168 5，大于H_s；Nei′s的基因分化系數(shù)G_st=0.794 0，表明有79.4%的遺傳變異存在于種間，20.6%的遺傳變異存在于種內(nèi)；基因流[N_m=0.5（1-G_st）/G_st]為0.129 7，表明種間基因交流處于極低等水平，交流極少。以上POPGENE計(jì)算出的遺傳參數(shù)表明：供試黃連屬藥用植物種間的遺傳多樣性遠(yuǎn)大于種內(nèi)的遺傳多樣性，種間存在著高度的遺傳分化。

2.4 親緣關(guān)系與聚類分析 POPGENE計(jì)算出供試黃連屬藥用植物種間遺傳一致度在0.730 8～0.792 9，平均為0.765 0，遺傳距離分布在0.232 1～0.313 6，平均為0.268 4，見表4。黃連、三角葉黃連與峨眉黃連3種黃連屬藥用植物之間的遺傳一致度、遺傳距離差異不大，表明三者之間的親緣關(guān)緣較近。日本黃連與其他3種黃連屬藥用植物的遺傳一致度較低，遺傳距離較遠(yuǎn)，表明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

用TREECONW軟件計(jì)算供試材料個(gè)體間的遺傳距離，按UPGMA法進(jìn)行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖，見圖2。從聚類圖中可看出：峨眉黃連與三角葉黃連首先聚為一支，再與黃連聚在一起；日本黃連處于單獨(dú)一個(gè)進(jìn)化枝上，與其他分子界限明顯。個(gè)體聚類的置信值均為100，可信度極高，均聚在同種藥用植物內(nèi)。

3 討論

3.1 基于分子標(biāo)記的黃連屬藥用植物遺傳多樣性 從已有文獻(xiàn)報(bào)道看，揭示黃連屬藥用植物遺傳多樣性主要采用RAPD標(biāo)記，DNA條形碼多用于探索黃連屬藥用植物的鑒別。常艷波^[6]采用RAPD標(biāo)記揭示黃連屬藥用植物（黃連、三角葉黃連、云南黃連、峨眉黃連、線萼黃連、西藏黃連、日本黃連）在物種水平上多態(tài)位點(diǎn)比率（PPB）為97.46%，同一種C. chinesis居群間的多態(tài)位點(diǎn)比率為10.24%，顯著低于物種間的多態(tài)位點(diǎn)比率，表明黃連屬植物的遺傳多樣性是豐富的。武敬亮^[7]用RAPD標(biāo)記揭示黃連屬藥用價(jià)值較大的4個(gè)物種（黃連、三角葉黃連、云連、峨眉黃連）之間多態(tài)性比例65.3%，說明各物種具有較為豐富的遺傳多樣性。韓凡^[8]用RAPD標(biāo)記揭示4種黃連屬藥用植物（黃連、三角葉黃連、峨眉黃連和線萼黃連）的多態(tài)百分率為89.37%，說明黃連屬樣本之間遺傳多樣性較為豐富。本文的研究結(jié)果表明供試的4種黃連屬藥用植物物種水平上的遺傳多樣性極為豐富（多態(tài)性百分率達(dá)99.1%），但同一種內(nèi)個(gè)體之間的遺傳多樣性均較低（多態(tài)性百分率10.4%～24.9%，平均僅為16.8%），其中，峨眉黃連、三角葉黃連的遺傳多樣性水平較低（多態(tài)性百分率分別為10.4%，12.5%），黃連、日本黃連的遺傳多樣性水平相對(duì)較高（19.5%，24.9%）。由于供試材料、分子標(biāo)記的不同，所得到的結(jié)果有一定差異，但均從不同角度揭示了黃連屬藥用植物較為豐富的遺傳多樣性，不同種之間存在特有的遺傳特性。

一個(gè)物種遺傳多樣性的高低與其分布范圍、繁育方式等有關(guān)。從物種的分布范圍看：黃連主要分布在長(zhǎng)江中下游各省市，是黃連屬藥用植物中用藥最廣泛、栽培面積最廣、產(chǎn)量最大的物種；峨眉黃連常生長(zhǎng)在陸峭的巖縫間，主要分布在四川峨眉山脈，居群小而分散，屬于狹域種；三角葉黃連僅分布于僅分布于四川峨眉山、洪雅一帶，多為栽培，生長(zhǎng)區(qū)域狹窄；日本黃連為從日本引進(jìn)物種。從以上分析推斷，黃連屬藥用植物遺傳多樣性水平與物種的分布區(qū)域及小生境有著一定的聯(lián)系。從繁育方式上看，三角葉黃連染色體為三倍體（2n=3x=27），偶爾有種子結(jié)實(shí)，但其大多不育，生產(chǎn)上采用“扯秧苗栽秧”的無性繁殖方式進(jìn)行繁殖^[3]，因此其遺傳多樣性水平低于種子繁殖物種。

3.2 黃連屬常用藥用植物的親緣關(guān)系研究 中藥材黃連的來源植物除《中國(guó)藥典》收載的黃連、云連、三角葉黃連之外，我國(guó)各地尚有多種黃連屬植物如峨眉黃連、西藏黃連、短萼黃連等的根莖作為黃連入藥。對(duì)于某些種的分類地位無論是形態(tài)標(biāo)記還是分子標(biāo)記得到的結(jié)果是一致的，如云連，但某些種的分類地位頗有爭(zhēng)議，爭(zhēng)議主要集中在黃連、三角葉黃連與峨眉野連三者的親緣關(guān)系。研究者采用不同方法，多角度對(duì)黃連屬藥用植物的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，早期多采用形態(tài)標(biāo)記，后期引入分子標(biāo)記，但不同的研究方法得到的結(jié)果并非完全一致。形態(tài)分類主要以花瓣形狀、萼片的形狀及寬窄、葉形差異為黃連屬植物分類的依據(jù)，認(rèn)為三角葉黃連與黃連親緣關(guān)系更近^[1]。武敬亮采用RAPD分子標(biāo)記，也認(rèn)為三角葉黃連與黃連親緣關(guān)系更近。但韓凡等^[8]采用RAPD分子標(biāo)記與本文采用的SCoT標(biāo)記，認(rèn)為三角葉黃連與峨眉黃連親緣關(guān)系更近。

此外，對(duì)三角葉黃連的栽培起源爭(zhēng)議也頗大，一種認(rèn)為三角葉黃連為黃連與峨眉野連的雜交種，另一種認(rèn)為三角葉黃連是峨眉黃連種內(nèi)多倍化的結(jié)果。前者的主要證據(jù)為劉曉光^[9]采用DNA條形碼研究發(fā)現(xiàn)三角葉黃連分別與黃連和峨眉黃連具有較多共有基因型，由此可初步推斷三角葉黃連是由黃連和峨眉黃連雜交起源而來。后者主要證據(jù)源于黃驥等^[3]對(duì)國(guó)產(chǎn)黃連屬植物的染色體核型分析，表明三角葉黃連為三倍體，對(duì)稱程度較高，核型為3A型，其染色體大小與峨眉黃連最接近，結(jié)合這2個(gè)種分布區(qū)相重疊的實(shí)際，可以推測(cè)三角葉黃連是峨眉黃連種內(nèi)多倍化并以營(yíng)養(yǎng)繁殖方式固定下來，即三角葉黃連應(yīng)栽培起源于峨眉黃連。本文的聚類結(jié)果支持后一種推測(cè)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]王天志，方忻平，張浩，等. 藥用黃連的原植物研究[J].中藥通報(bào)，1988，13（1）：7.

[2]孫紅祥，張昌禧，吳遠(yuǎn)文. 黃連屬藥用植物的數(shù)量分類學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1995，30（1）：7.

[3]黃驥，陳浙，夏志華，等.國(guó)產(chǎn)黃連屬植物的染色體核型分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（5）：931.

[4]向剛，傅體華，范巧佳.中藥黃連3種基原植物的核型研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010， 35 （11）：1367.

[5]Collard B C Y， Mackill D J. Start codon targeted（SCoT） polymorphism： a simple， novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J]. Plant Mol Biol Rep， 2009，27（1）：86.

[6]常艷波. 黃連屬藥用植物RAPD鑒定與親緣關(guān)系研究[D].成都：四川大學(xué)，2005.

[7]武敬亮. 4種黃連屬（Coptis）植物的RAPD鑒定以及黃連的居群多樣性分析[D].南充：西華師范大學(xué)，2005.

[8]韓凡，鄒嘉欣，宋良科，等. 峨眉黃連及其近緣種的遺傳多樣性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（30）：14648.

[9]劉曉光. 基于群體遺傳學(xué)的黃連屬DNA條形碼研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]