趙書崗+文菁+趙悅平

摘要：為揭示梨果實石細(xì)胞分化的機(jī)理，調(diào)控石細(xì)胞形成和含量，克隆了鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali）4-香豆酸∶輔酶A連接酶基因Pb4CL片段（GenBank登錄號：KF177692），該片段長467 bp，經(jīng)同源性比對，該片段與沙梨、歐洲花楸和枇杷等物種4CL基因高度同源，編碼155個氨基酸殘基，存在4CL蛋白質(zhì)高度保守區(qū)域，具有腺苷酸合成class I超級結(jié)構(gòu)域。建立了梨Pb4CL基因的熒光實時定量表達(dá)檢測體系，在石細(xì)胞分化期Pb4CL基因相對表達(dá)量逐漸升高，后呈下降趨勢。

關(guān)鍵詞：鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali）；4-香豆酸∶輔酶A連接酶；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類號：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6267-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.066

Abstract： In order to reveal differentiation and histogenesis mechanism of stone cells in fruitlets， and regulate and control the stone cell contents， Yali pear（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali） fruits Pb4CL fragment was cloned（GenBank number：KF177692）. Pb4CL gene fragment was 467 bp. The analysis of the sequence revealed that the Pb4CL gene was highly homologous with that of other species such as Pyrus communis， Sorbus aucuparia and Eriobotrya japonica in amino acids. The gene fragment encode postulated proteins of 155 amino acids in which the high conserved domain of 4CL protein was， like AFD_class_I superfamily. Expression system of real-time fluorescence quantitative RT-PCR for detecting Pb4CL gene was established. The relative expression of Pb4CL gene was rised during stone cell differentiation， and had a falling trend.

Key words：Yali pear（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali）； 4CL； gene cloning； expression analysis

梨（Pyrus spp.）是世界性的重要落葉果樹，是中國果樹栽培的重要樹種之一。梨果質(zhì)脆、汁多、酸甜適口，多具芳香味，深受人們的喜愛，其食用品質(zhì)受多種綜合因素的影響，其中石細(xì)胞是影響梨果實品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[1，2]。石細(xì)胞為厚壁細(xì)胞的一種類型，由薄壁細(xì)胞經(jīng)次生壁的強(qiáng)烈增厚且高度木質(zhì)化而來，次生壁堅硬呈同心層次[3]。木質(zhì)素是石細(xì)胞次生壁的主要成分之一[4-6]，包括3種類型——對羥基苯基木質(zhì)素（H）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G）和紫丁香基木質(zhì)素（S），分別為對-香豆醇（p-coumaryl alcohol）、松柏醇（Coniferyl alcohol）與芥子醇（Sinapyl alcohol）3種單體聚合，它們都是苯丙烷類衍生的類苯丙酸化合物[7，8]，來源于香豆酸羥基化和甲基化的衍生物。4-香豆酸∶輔酶A連接酶（4CL），又稱羥基肉桂酸∶CoA連接酶、4-香豆酰∶輔酶A合成酶，它是苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，可催化香豆酸、咖啡酸和阿魏酸及芥子酸形成相應(yīng)硫酯，這些中間產(chǎn)物可進(jìn)入木質(zhì)素合成特異途徑，進(jìn)一步合成木質(zhì)素單體[9]。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注4CL蛋白質(zhì)及其基因序列，目前已經(jīng)克隆了棉花[10]、煙草[11]、高粱[12]、水稻[13]等多種植物的4CL基因。該基因以小的基因家族形式存在，多具有2～4個成員[14]，且不同成員催化底物特異性存在差異，其在苯丙烷代謝途徑中參與的分支途徑不同。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)4CL活性受到抑制時，擬南芥植株木質(zhì)素含量會降低50%[15]，且改變了木質(zhì)素的類型，說明4CL基因在調(diào)控木質(zhì)素合成中也扮演了重要角色。張夏南等[16]從黃金梨果肉中克隆了10個與木質(zhì)素合成相關(guān)的cDNA，經(jīng)熒光實時定量分析發(fā)現(xiàn)Pp4CL1和Pp4CL2在幼果期表達(dá)，而在果實發(fā)育后期基因相對表達(dá)量較低。本研究以石細(xì)胞分化期鴨梨幼果為試材，克隆了4CL基因片段，并建立了相應(yīng)的熒光實時定量表達(dá)檢測體系，研究其在次生壁分化期的表達(dá)變化，分析其在此過程中的作用，為研究木質(zhì)素與次生壁木質(zhì)化的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園，位于河北省保定市郊區(qū)，為沖積平原潮土，黏壤，肥力中等，樹齡12年生，生長結(jié)果正常，花期平均溫度16.2 ℃，相對濕度30%～50%。供試材料為盛果期鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali）。4月初蕾期選擇生長勢一致的鴨梨樹10棵，于花蕾大氣球期在樹冠的中層南部選擇花蕾發(fā)育期基本一致的短果枝掛牌，每序只留第1、2朵邊花。開花當(dāng)日采用雪花梨花粉對其進(jìn)行授粉，采集花后8、10、12、14、16、18、20 d幼果，剔去子房中心部位，液氮速凍，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 總RNA的提取方法參考孫雯[17]的方法并進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)TransGen公司的TransScriptTM One-Step gDNA Removal 和cDNA Synthesis Super Mix的操作說明進(jìn)行cDNA的合成，產(chǎn)物在-70 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 4CL蛋白質(zhì)編碼基因保守區(qū)片段的克隆 根據(jù)GenBank中的沙梨（Pyrus pyrifolia）、花楸（Sorbus aucuparia）、枇杷（Eriobotrya japonica）等薔薇科植物4CL蛋白質(zhì)編碼基因的保守區(qū)序列，利用Primer Primier 5.0設(shè)計上下游引物F1（5′-CGTCGCTCTAC CCTACTC-3′，5′-CTGCCTCTGTCATTCCAT-3′），由北京華大基因公司合成。反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，上游引物F1（20 μmol/L）0.4 μL，下游引物R1（20 μmol/L）0.4 μL，模板cDNA 2 ng，Taq酶（5 U）0.4 μL，MgCl2 2.0 μL，加ddH2O 至25 μL。反應(yīng)程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將克隆獲得的產(chǎn)物切膠回收，與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，經(jīng)菌體PCR驗證正確后送華大（北京）股份有限公司測序。

1.2.3 石細(xì)胞分化期Pb4CL表達(dá)分析 以蘇雅男[18]設(shè)計的梨β-actin基因擴(kuò)增引物ACT-F（5- TTGGGATGGGTCAGAAGG-3）、ACT-R（5-CTGTGAGCAGAACTGGGTG-3）作為內(nèi)參引物。根據(jù)已克隆得到的4CL基因片段序列利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計實時定量PCR引物4CL-F（5-GTGATGCTAACGCACAAGGG-3）、4CL-R（5-AGTGGCAGCACGCATAAGAC-3）。并對引物進(jìn)行特異性驗證，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。采用TaKaRa公司的SYBR-Green Real-time PCR Master Mix試劑盒，反應(yīng)在Mastercycler ep realplex4 real-time PCR儀（Eppendorf，德國）上進(jìn)行。反應(yīng)體系為cDNA模板（50 mg/μL）1 μL、上下游引物（20 μmol/L）各0.25 μL、SYBR？誖Premix ExTaqTM Ⅱ 10 μL，加ddH2O至20 μL，每個樣品3個重復(fù)。反應(yīng)程序為94 ℃ 1 min；94 ℃ 15 s，57.5 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。利用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 序列經(jīng)Vecscreen（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去載體后，利用NCBI）的BLAST分析程序進(jìn)行比對；利用DNAMAN生物學(xué)軟件對基因的氨基酸序列進(jìn)行分析；并利用DNAMAN、BLAST軟件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列以及編碼氨基酸序列，進(jìn)行同源性分析。蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測由NCBI的Conserved Domain Search tool（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）完成。

1.2.5 4CL酶活性測定 參照饒國棟等[19]的方法并略作調(diào)整。

2 結(jié)果與分析

2.1 4CL蛋白編碼基因cDNA片段克隆

以鴨梨石細(xì)胞分化期幼果提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用特異性引物F1和R1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示得到一條500 bp左右清晰的條帶（圖1），與預(yù)期目的片段大小一致，將該片段命名為Pb4CL。將所得產(chǎn)物切膠回收，純化后，采用pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，菌液PCR檢測鑒定陽性克隆，菌液PCR結(jié)果顯示克隆片段已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌。陽性克隆送北京六合華大基因公司測序。測序結(jié)果經(jīng)Vecscreen（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去除載體序列。測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果大小相近，該片段長度為467 bp的4CL基因cDNA核苷酸序列。經(jīng)DNAMAN軟件分析，其最大讀碼框位于2～466 bp之間，編碼155個氨基酸殘基（圖2）。

2.2 Pb4CL基因片段編碼蛋白質(zhì)分析

將所測鴨梨PbLAC基因序列與NCBI中收錄的梨及相關(guān)近緣物種進(jìn)行同源性比較，利用Blast程序在GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。鴨梨Pb4CL基因cDNA片段序列與沙梨（Pyrus pyrifolia，JX290374.1）、歐洲花楸（Sorbus aucuparia，GU938595.1）、枇杷（Eriobotrya japonica，EF685345.1）和樹莓（Rubus idaeus，AF239687.1）等物種的同源性分別為99%、99%、96%和81%，因此證明該序列即為4CL基因序列，定名為Pb4CL，GenBank登錄號為KF177692。利用在線工具ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）對Pb4CL基因編碼氨基酸序列進(jìn)行分析。在所得氨基酸序列中，除Trp、Pyl和Sec外其他氨基酸均有涉及，其中Leu的含量最高，占氨基酸總數(shù)的14.8%；Val次之，占氨基酸總數(shù)的10.3%。利用DNAMAN軟件對所得氨基酸序列、沙梨（GI470133579）、歐洲草莓（GI460408299）、花楸（GI508715386）等已知4CL蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源比對，同源性分別為100%、99.35%、92.6%（圖3）。通過NCBI的Conserved Domain Search Tool 對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，在鴨梨PbLAC基因編碼的蛋白質(zhì)屬腺苷酸合成class I超家族，包含4CL蛋白絕對保守區(qū)域“SSTGTTG”，在該序列中具有多個CoA和AMP結(jié)合位點（圖4），因此證實該基因編碼的氨基酸序確實為4CL蛋白質(zhì)序列，該核苷酸序列可以用于進(jìn)行下一步的熒光定量分析。

利用MEGA 5.05軟件對氨基酸序列進(jìn)行比對，并建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹。鴨梨Pb4CL基因編碼蛋白質(zhì)與另外10種植物的進(jìn)化關(guān)系如圖5所示。薔薇科蘋果亞科沙梨、鴨梨、花楸、枇杷分到一組，其中鴨梨和沙梨關(guān)系最近，而薔薇亞科智利草莓、歐洲草莓和樹莓分到一組，毛白楊和歐洲大葉楊分到一組。從所得氨基酸與其他植物4CL蛋白質(zhì)序列分析的遺傳距離得出，在植物形態(tài)學(xué)上近緣的植物類型其4CL蛋白質(zhì)表現(xiàn)進(jìn)化關(guān)系較近，說明4CL蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中存在高度保守性，也進(jìn)一步驗證了所得序列的可靠性。

2.3 石細(xì)胞分化期Pb4CL基因表達(dá)分析

利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)，以鴨梨β-Actin為內(nèi)參，分析了4CL在石細(xì)胞分化期的表達(dá)情況。在石細(xì)胞分化期，4CL表達(dá)量變化如圖6所示，在開花后第10天，Pb4CL表達(dá)量略有下降，此后逐漸升高，在第14天略有下降但差異不明顯，在開花后第18天出現(xiàn)峰值，開花后20 d開始下降。Pb4CL基因表達(dá)變化與酶活性測定相近，且在石細(xì)胞次生壁大量分化期出現(xiàn)明顯變化，Pb4CL與石細(xì)胞分化存在一定關(guān)聯(lián)。

2.4 石細(xì)胞分化期相關(guān)酶活性變化

為進(jìn)一步驗證石細(xì)胞分化期Pb4CL基因的表達(dá)變化，對4CL酶進(jìn)行測定分析。如圖7所示，在石細(xì)胞分化期4CL酶活性呈先下降后升高的趨勢，鴨梨在開花第16天出現(xiàn)峰值，達(dá)146.0 U/g（FW），在花后20 d明顯下降。對4CL活性及Pb4CL基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明二者呈顯著正相關(guān)（R=0.801）。

3 討論

4CL位于苯丙氨酸代謝途徑的分支點上，參與類黃酮物質(zhì)和木質(zhì)素的合成代謝[20]，可催化香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸等與CoA形成相應(yīng)的輔酶A酯，而后者則可進(jìn)入苯丙烷類分支途徑通過還原反應(yīng)生成木質(zhì)素單體，因此4CL是木質(zhì)素合成的限速酶之一[21]。目前，已在水稻[13]、棉花[10]、高粱[12]、沙梨[16]等物種上分離到4CL基因。本研究中克隆了鴨梨Pb4CL基因片段，通過與GenBank中收錄的4CL基因序列進(jìn)行同源性比對，該片段與沙梨、枇杷等薔薇科植物4CL基因同源性極高。通過Pb4CL編碼氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)其具有“SSTGTTGLPKGV”結(jié)構(gòu)域[14]，而該結(jié)構(gòu)域同是所有植物4CL蛋白質(zhì)的絕對保守區(qū)域，此外在該氨基酸序列中，具有多個CoA和AMP結(jié)合位點。從氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系來看，鴨梨Pb4CL編碼蛋白質(zhì)與沙梨等薔薇科物種蛋白質(zhì)遺傳距離最短，說明4CL蛋白質(zhì)在進(jìn)化中具有保守性，也進(jìn)一步證實該片段編碼序列為鴨梨4CL蛋白質(zhì)序列。

研究證實，在美洲山楊中Pt4CL1參與木質(zhì)素形成，Pt4CL2參與類黃酮生物合成[21]，Lee等[22]通過反義基因技術(shù)抑制擬南芥中的4CL酶活性，擬南芥木質(zhì)素組分紫丁香基木質(zhì)素顯著增加，總木質(zhì)素含量顯著下降。Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)在水稻中，4CL主要以4-香豆酸和阿魏酸為底物參與木質(zhì)素的單體合成。在多項研究中均證實4CL蛋白質(zhì)參與木質(zhì)素的合成[14，23]，王斌等[24]認(rèn)為套袋可降低PAL、C4H、4CL和CAD的活性，使中間產(chǎn)物含量降低，從而抑制石細(xì)胞的產(chǎn)生。鴨梨Pb4CL基因的表達(dá)變化與鴨梨幼果石細(xì)胞分化期4CL酶活性變化相近，說明本研究建立的熒光實時定量表達(dá)檢測體系能夠反應(yīng)4CL蛋白質(zhì)的活性變化。由于鴨梨石細(xì)胞出現(xiàn)于花后2周，并在此后大量出現(xiàn)，本研究中克隆的鴨梨Pb4CL基因表達(dá)量在石細(xì)胞分化期出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，與石細(xì)胞次生壁出現(xiàn)的時期一致，此時木質(zhì)素大量積累，說明在梨石細(xì)胞分化期4CL參與了石細(xì)胞次生壁的形成。在開花后20 d大量石細(xì)胞次生壁已經(jīng)初步形成，僅在石細(xì)胞團(tuán)外部有部分細(xì)胞繼續(xù)分化，這可能與后期Pb4CL基因表達(dá)量出現(xiàn)下降有關(guān)，其結(jié)果有待于進(jìn)一步研究。

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