劉亞豐,李源琦

(華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

一種正弦波形變化光刺激器研制

劉亞豐,李源琦

(華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

光遺傳學(xué)方法為調(diào)控特定神經(jīng)元及神經(jīng)環(huán)路提供了一種新的途徑，極大地推動(dòng)了神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展。在利用光遺傳學(xué)方法調(diào)控細(xì)胞時(shí)，通常需要正弦波形變化的光刺激信號(hào)。該文采用偏振激光器、半波片、偏振片及步進(jìn)電機(jī)，搭建一套光強(qiáng)變化呈正弦規(guī)律的刺激器，其輸出頻率精準(zhǔn)，最高頻率可達(dá)89 Hz。實(shí)踐表明，該技術(shù)方案將在光遺傳學(xué)中有良好的應(yīng)用前景。

光遺傳學(xué)；光刺激；步進(jìn)電機(jī)；正弦光波

大腦由上千億個(gè)神經(jīng)細(xì)胞相互連接構(gòu)成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，它們從上游細(xì)胞接收信息，經(jīng)過傳導(dǎo)、信息整合及計(jì)算，輸出傳至下游細(xì)胞。大腦細(xì)胞數(shù)量、種類之多，給大腦功能揭示及其對(duì)行為學(xué)調(diào)控帶來巨大挑戰(zhàn)。電生理學(xué)技術(shù)通過玻璃或金屬電極刺激電極周圍細(xì)胞，來分析研究這些細(xì)胞與行為活動(dòng)之間的因果關(guān)系，但電極引入通常會(huì)給生物組織帶來較大傷害，且由于自身材料限制，其空間分辨率較低，無法實(shí)現(xiàn)特定類型細(xì)胞的調(diào)控[1-2]。光遺傳學(xué)技術(shù)是近十年新出現(xiàn)的一種神經(jīng)調(diào)控技術(shù)，它通過基因靶向定位或病毒注射等技術(shù)，將光敏感蛋白特異性地表達(dá)在目標(biāo)神經(jīng)元胞體或突起上，在特定波長(zhǎng)的光刺激下，引起神經(jīng)元去極化產(chǎn)生動(dòng)作電位，從而激活細(xì)胞，或細(xì)胞產(chǎn)生超極化，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞活性的抑制，這種技術(shù)為特異性的雙向控制特定神經(jīng)元及神經(jīng)環(huán)路提供一種新的選擇，得以快速推廣應(yīng)用[3-6]。

利用光遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞調(diào)控時(shí)，通常要改變刺激光的頻率、脈寬、功率等給特定神經(jīng)環(huán)路或網(wǎng)絡(luò)施加不同類型信號(hào)的輸入，需要能夠產(chǎn)生如正弦、方波、三角波等波形變化的刺激信號(hào)，以規(guī)范輸入信號(hào)。調(diào)制發(fā)光二極管驅(qū)動(dòng)電路雖可方便實(shí)現(xiàn)這些波形，但受到其發(fā)散角大的影響，無法實(shí)現(xiàn)大腦深層細(xì)胞的光刺激激活。

激光器由于有眾多優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。對(duì)激光光強(qiáng)的調(diào)制，通常有內(nèi)部調(diào)制和外部調(diào)制。內(nèi)部調(diào)制即在激光器內(nèi)部，通過加載特定電信號(hào)改變激光輸出波形[7-8]，但這種內(nèi)部調(diào)制方式使得激光功率穩(wěn)定下來需要較長(zhǎng)時(shí)間，激光波形波動(dòng)較大，無法滿足神經(jīng)科學(xué)研究需要。外部調(diào)制方法通?？刹捎秒姽饩w、聲光晶體、磁光晶體來實(shí)現(xiàn)[7-8]，但存在調(diào)制方式不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化調(diào)制、或輸出波形信號(hào)不夠精準(zhǔn)、或器件成本較高等問題。激光器輸出的通常是線偏振光，而半波片可調(diào)制激光偏振態(tài)，如果再結(jié)合偏振片，將很方便實(shí)現(xiàn)多種波形光信號(hào)的產(chǎn)生。另外這種方法成本低，控制易實(shí)現(xiàn)，輸出激光信號(hào)能在毫秒水平穩(wěn)定下來。本文基于以上原理，搭建一套正弦光波信號(hào)發(fā)生器，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方案將在光遺傳學(xué)技術(shù)中有廣闊的應(yīng)用前景。

1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

如圖1所示，設(shè)激光器輸出線偏光光強(qiáng)為I1，沿著激光傳輸方向垂直光軸處放置一塊特定波長(zhǎng)的半波片。線偏振光垂直入射到半波片(其光軸為X方向)，則透射光仍為線偏振光。設(shè)入射激光振動(dòng)方向與半波片光軸間夾角為α，則經(jīng)過半波片后線偏振光振動(dòng)方向從原來的方位轉(zhuǎn)過2α角。在半波片后又垂直放置一塊偏振片，其光軸與X軸夾角為β，通過該偏振片后的光強(qiáng)為I2，由馬呂斯定律則可推導(dǎo)它們之間的關(guān)系如下：

圖1 系統(tǒng)原理圖

(1)

如果半波片以ω角速度做勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，則t時(shí)刻半波片光軸轉(zhuǎn)過的角度為ωt，則：

(2)

在初始位置，設(shè)定α=β，則：

(3)

由式(3)可以看出，激光光強(qiáng)隨時(shí)間呈正弦規(guī)律變化，證明采用半波片和偏振片理論上是可行的。另外可知，正弦變化光波信號(hào)的頻率是半波片轉(zhuǎn)動(dòng)頻率的4倍。

在理論分析的基礎(chǔ)上，搭建了實(shí)驗(yàn)測(cè)量系統(tǒng)，如圖2所示，473 nm激光器(MLL-III-473，長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司)、半波片(GCL-060414，大恒新紀(jì)元科技股份有限公司)、三棱鏡(GCL-030104，大恒新紀(jì)元科技股份有限公司)、偏振片(GCL-050003，大恒新紀(jì)元科技股份有限公司)、反射鏡M1、M2、M3(GCC-102102，大恒新紀(jì)元科技股份有限公司)等依次擺放。半波片被固定在步進(jìn)電機(jī)上用于勻速旋轉(zhuǎn)，步進(jìn)電機(jī)步距角為1.8 °，驅(qū)動(dòng)設(shè)置為2細(xì)分。系統(tǒng)采用直角棱鏡和3塊反光鏡對(duì)光路進(jìn)行調(diào)整，實(shí)現(xiàn)出射激光與入射激光在同一傳播方向上。光電池電路將激光信號(hào)變?yōu)殡妷盒盘?hào)，輸入示波器(TDS1002，TEKTRONIX INC.)，用于觀察和測(cè)量激光波形變化。

根據(jù)電機(jī)步距角、細(xì)分?jǐn)?shù)，可知正弦光波頻率f與步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)脈沖頻率f0關(guān)系如式(4)所示：

(4)

2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析

當(dāng)給步進(jìn)電機(jī)發(fā)送脈沖信號(hào)時(shí)，如圖3(a)所示，系統(tǒng)有穩(wěn)定的光波信號(hào)產(chǎn)生，利用示波器可測(cè)得其強(qiáng)度呈正弦規(guī)律變化，如圖3(b)所示，進(jìn)而可測(cè)得正弦光波頻率為步進(jìn)電機(jī)脈沖頻率的1/100。改變脈沖信號(hào)頻率，正弦光波頻率也相應(yīng)改變，實(shí)際測(cè)量與理論計(jì)算具有較高的一致性，如表1所示。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)步進(jìn)電機(jī)脈沖頻率過高時(shí)，實(shí)測(cè)正弦光波頻率低于理論計(jì)算值，這可能是步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)速過高，發(fā)生丟步，導(dǎo)致電機(jī)轉(zhuǎn)速比理論值偏慢造成的。

(a)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

(b)系統(tǒng)實(shí)物圖 (c)直角棱鏡與步進(jìn)電機(jī)安裝圖2 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)圖

實(shí)驗(yàn)測(cè)試表明，采用偏振光、半波片、步進(jìn)電機(jī)可實(shí)現(xiàn)對(duì)連續(xù)激光輸出進(jìn)行調(diào)制，獲得穩(wěn)定的正弦變化光波。當(dāng)給系統(tǒng)輸入期望光波頻率，系統(tǒng)能快速產(chǎn)生相應(yīng)頻率的正弦光波，如圖4所示，相關(guān)系數(shù)為0.998，說明二者高線性，證明正弦波形變化光刺激器設(shè)計(jì)方案正確可行。

(a)步進(jìn)電機(jī)脈沖發(fā)送波形圖

(b)正弦光波波形圖圖3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

脈沖頻率f0/kHz正弦光波頻率f理論值/Hz正弦光波頻率f實(shí)測(cè)值/Hz1.79818.018.42.11421.121.42.76227.627.33.74537.537.34.75347.547.65.33053.353.06.29763.062.27.35373.575.19.15791.688.9

圖4 正弦光波信號(hào)實(shí)測(cè)頻率與理論頻率關(guān)系

3 結(jié)束語

光遺傳學(xué)技術(shù)是遺傳學(xué)技術(shù)與光刺激技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生的產(chǎn)物，是一種精確調(diào)控細(xì)胞的方法，被《Nature Methods》雜志評(píng)為2010年最受關(guān)注的科技成果[9]，已被各個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛用于研究學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)認(rèn)知功能[10]，有望用于帕金森氏病、阿爾茨海默病、精神分裂癥等神經(jīng)疾病的治療[5]。

光遺傳學(xué)進(jìn)行光刺激時(shí)，不僅要考慮刺激光波長(zhǎng)、功率，也需要考慮刺激光波形，使得調(diào)控細(xì)胞更接近細(xì)胞正常生理狀態(tài)。對(duì)于刺激功率，通常不低于1 mW/mm2即可激活細(xì)胞[11-12]，常用激光器輸出功率滿足需求；對(duì)于波長(zhǎng)，則要根據(jù)細(xì)胞表達(dá)的光敏感蛋白激發(fā)譜線來選取，對(duì)于興奮性光敏感蛋白ChR2，可采用473 nm或488 nm波長(zhǎng)激發(fā)，對(duì)于抑制性光敏感蛋白NpHR，可采用589 nm波長(zhǎng)激發(fā)[3]；對(duì)于激光波形，可采用對(duì)激光進(jìn)行內(nèi)部或外部調(diào)制的方法獲得正弦波、三角波等。本系統(tǒng)采用外部調(diào)制方法，利用激光器、半波片、偏振片及步進(jìn)電機(jī)，搭建一套光強(qiáng)變化呈正弦規(guī)律的刺激器，通過改變步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)速可以快速獲得期望頻率的刺激光。該方案簡(jiǎn)單便捷、所需成本較低，在神經(jīng)調(diào)控等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

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An Optical Stimulator Whose Intensity Change Follows the Sinusoidal Waveform

LIU Yafeng, LI Yuanqi

(College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)

Optogenetics provides a new way to regulate and control the activity of specific neurons of neural circuits and thus greatly promotes the development of neuroscience.In the use of optogenetics methods to control cells, we usually require a light stimulation signal with sinusoidal waveform changes.In this paper, a set of sinusoidal wave signal generator is built based on a polarization laser, half-wave plate, polarizing plate and stepper motor.Its output frequency was very accurate and the highest frequency was up to 89 Hz.The experimental results demonstrate our technology scheme will have good application prospects in the field of optogenetics.

optogenetics; photostimulaiton; stepper motor; sinusoidal light waveform

2015-10-10；修改日期:2016-11-29

生物科學(xué)國(guó)家理科基地能力提高項(xiàng)目(NSFC-J1103514)；湖北省教學(xué)研究項(xiàng)目(2014070，2015060)。

劉亞豐(1976-)，男，博士，工程師，主要從事生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)、光遺傳學(xué)、電生理學(xué)方面的研究。

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10.3969/j.issn.1672-4550.2017.01.021