魏宇清,謝 婷,劉 歡,劉羽霏,鐘青萍,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070;3.省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東廣州 510075)

香辛料提取物對副溶血弧菌生物膜的抑制作用

魏宇清1,2,3,謝 婷1,劉 歡1,劉羽霏1,鐘青萍1,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070;3.省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東廣州 510075)

對大蒜、肉桂等6種天然的香辛料分別采用水和80%乙醇進(jìn)行提取并篩選出對副溶血弧菌抑菌能力較強的提取物,探究這些香辛料提取物對副溶血弧菌生物膜的抑制作用。研究結(jié)果表明大蒜、肉桂、丁香具有較強的抗菌作用,而花椒、小茴香、迷迭香則相對較弱。肉桂和大蒜的乙醇提取物對副溶血弧菌的最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)皆為6.25 mg/mL。亞抑菌濃度的提取物除了能夠抑制副溶血弧菌生物膜的形成,還能抑制生物膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性,減少細(xì)菌胞外多糖的分泌。激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)觀察發(fā)現(xiàn),處理后死細(xì)胞的數(shù)量明顯增多,且生物膜內(nèi)多糖的含量明顯變少。

香辛料,副溶血弧菌,生物膜,抑制

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是常見的食源性致病菌,為革蘭氏陰性嗜鹽弧菌,廣泛存在于淺海海水及蝦、蟹、蛤、牡蠣等海產(chǎn)品中,人們食用了被其污染的食物后,可能會引起以發(fā)熱、腹瀉、惡心、嘔吐等為主要癥狀的急性胃腸炎,嚴(yán)重者可出現(xiàn)脫水、休克,甚至死亡[1]。

生物膜(biofilm)是微生物鑲嵌并生長在自身產(chǎn)生的胞外多聚物(主要是胞外多糖、蛋白質(zhì)和胞外DNA)中的微生物群體,其多附著在物體的表面[2]。生物膜是微生物對環(huán)境的一種適應(yīng),是與游離態(tài)相對應(yīng)的一種生長狀態(tài)[3]。細(xì)菌在食品加工設(shè)備表面形成生物膜后,不僅能夠降低設(shè)備的熱交換率,增加能耗,還能夠腐蝕設(shè)備表面,而且其持續(xù)不斷地釋放出致病菌,對食品造成持續(xù)性的污染[4]。然而,生物膜對殺菌劑、消毒劑等的耐受性是浮游菌的1000倍[5],因此傳統(tǒng)的抗菌物質(zhì)對生物膜的作用效果較差,而化學(xué)合成藥物[6]、酶解[7]等方法成本較高、工藝復(fù)雜,甚至對人體有副作用,從而造成二次污染。因此開發(fā)新型、高效、安全的天然抗生物膜物質(zhì)具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

香辛料一般是指植物的種子、果實、根、樹皮、漿果、芽或葉子等[8],主要用于食品的調(diào)味、著色和保藏。大多數(shù)香辛料還具有抑菌、抗氧化等功能[9-11],但是其對生物膜是否有抑制及清除作用鮮有報道。因此本文選用大蒜、肉桂、迷迭香、丁香、花椒和小茴香等常見的香辛料,分別以水和80%乙醇提取抗菌物質(zhì),并根據(jù)抑菌圈的大小從中選取兩種抑菌活性強的香辛料,測定其對VP的最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)后,進(jìn)一步研究其對VP生物膜的作用,為后續(xù)的新型抗生物膜制劑的開發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜、迷迭香、肉桂、花椒、小茴香及丁香 均購于廣州市農(nóng)貿(mào)市場;副溶血弧菌(ATCC17802)由本實驗室保藏;三氯乙酸(TCA) 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;重蒸酚 北京索萊寶科技有限公司;XTT、甲萘醌、異硫氰酸熒光素-刀豆球蛋白A(FITC-conA)、碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)、鏈霉蛋白酶E(Pronase E) 均購自美國Sigma公司;氨芐西林(Ampicillin,AM)、卡那霉素(kanamycin,KA) 天根生化科技(北京)有限公司。

電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海錦屏儀器儀表有限公司;高速中藥粉碎機 瑞安市永歷制藥機械有限公司;九陽多功能榨汁機 中國九陽股份有限公司;KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵、R1001-VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;7 DU0(780&7Live)激光共聚焦掃描顯微鏡 德國蔡司公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB):胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、NaCl 30 g、去離子水1 L。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0～7.4;121 ℃,0.15 MPa下高壓滅菌15 min。

含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基(TSA):在上述TSB配方的基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂,加熱融化后滅菌。

水解酪蛋白胨肉湯(MH肉湯):稱取MH肉湯培養(yǎng)基21 g,加入去離子水1 L,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝三角瓶,121 ℃,0.15 MPa下高壓滅菌15 min。

1.2.2 香辛料中抗菌物質(zhì)的提取 迷迭香、肉桂、花椒、小茴香及丁香于45 ℃烘干后用中藥粉碎機粉碎,大蒜用榨汁機絞碎,各取25 g樣品,裝入500 mL三角瓶中,加入250 mL 80% 乙醇(v/v)或去離子水,用超聲波輔助提取,功率為180 W,溫度為55 ℃,提取時間為1 h。減壓抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)條件為55 ℃,60 r/min,轉(zhuǎn)入25 mL具塞試管,定容后使質(zhì)量濃度為1 g/mL(即1 g香辛料提取物定容為1 mL),密封后保存于4 ℃冰箱中備用[12]。

1.2.3 香辛料抑菌能力的測定 采用牛津杯法,在含3% NaCl的TSA固體培養(yǎng)基上加入200 μL濃度約為108CFU/mL的菌液,涂布均勻后,用無菌鑷子將滅菌并冷卻至常溫的牛津杯呈三角形放置于平板上,在牛津杯中加入100 μL提取液,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈直徑。同時以無菌水作陰性對照,濃度為0.2 mg/mL的氨芐西林(AM)和卡那霉素(KA)為陽性對照。

1.2.4 提取物對副溶血弧菌MIC的測定 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中先加入100 μL滅菌后的MH肉湯培養(yǎng)基,然后在第一列加入用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋后的提取物100 μL,混合均勻后從中吸取100 μL至下一列中,依次至六個濃度梯度,然后再在每孔中加入100 μL濃度為106CFU/mL的菌液。每列三個重復(fù),第七行為不加提取物和菌液的空白對照,第八行為不加提取物的陰性對照。30 ℃培養(yǎng)24 h后首先肉眼觀察渾濁度,提取物濃度最低但孔內(nèi)卻澄清的濃度即為最低抑菌濃度,然后在595 nm波長下測定吸光值,只有相鄰兩孔的吸光值差異較大且極顯著(p<0.01)時,確定為該提取物的MIC。

1.2.5 生物膜形成量的測定 按1.2.4的方法在96孔板中加入含不同濃度提取物的含菌培養(yǎng)基,同時設(shè)不加提取物的陰性對照組。將96孔板放置于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出孔板,棄去菌液,用250 μL無菌生理鹽水清洗2次,然后60 ℃干燥固定15 min,再每孔加入0.1%的結(jié)晶紫溶液200 μL,染色5 min,用250 μL無菌生理鹽水清洗3次,干燥后加入33%的冰乙酸200 μL,放置10 min,在595 nm處測OD值[13]。

1.2.6 生物膜代謝活性的測定 XTT是一種類似于MTT的甲基四氮鹽,活細(xì)胞中的線粒體能夠?qū)ⅫS色的XTT還原成橙色的可溶解的甲臜產(chǎn)物,其顏色的深度與細(xì)胞的活力成正比[14]。本文選用XTT作為指示劑,研究香辛料提取物對VP生物膜內(nèi)的細(xì)胞活力的影響。將XTT用PBS配制成1 g/mL的溶液,儲存在-20 ℃冰箱中。甲萘醌在用之前溶解在丙酮中,使其終濃度為1 mmol/L,每次實驗所用XTT與甲萘醌比例為12.5∶1。按1.2.4的方法在96孔板中加入含不同濃度提取物的含菌培養(yǎng)基,同時設(shè)不加提取物的陰性對照組。30 ℃條件下培養(yǎng)24 h使其形成生物膜。然后移除浮游菌,用100 μL無菌PBS緩沖液沖洗3次,加入13.5 μL的XTT-甲萘醌混合液,輕輕震動孔板,然后放置在黑暗處30 ℃孵育4 h,在420 nm波長下測定其OD值[14]。

1.2.7 胞外多糖(Extracellular polysaccharides,EPS)含量的測定 將制備好的濃度為108CFU/mL的菌懸液按1%的接種量加入到放有蓋玻片的TSB培養(yǎng)基試管中,并加入防腐劑溶液,同時設(shè)不加防腐劑的對照組。副溶血弧菌在30 ℃下培養(yǎng)24 h后形成生物膜,取出蓋玻片,用生理鹽水洗三次后放入10 mL生理鹽水中超聲震蕩10 min(20 W,37 ℃)。取出玻片,將菌懸液煮沸10 min,室溫冷卻20 min。再加入50 μL的Pronase E,37 ℃孵育2 h,加入200 μL的質(zhì)量濃度為10%的TCA溶液,冰水放置30 min,10000 r/min離心30 min。收集上清液,加入等體積的乙醇溶液,-20 ℃放置1 h,15000 r/min離心20 min,除去上清液,沉淀物用95%的苯酚和5 mL濃硫酸,沸水浴10 min,反應(yīng)液呈紅色,設(shè)置未加抑菌物質(zhì)的陰性對照組,在420 nm波長下測定其OD值[15]。

1.2.8 激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)觀察生物膜 在培養(yǎng)皿中放入滅菌后的載玻片,然后加入15 mL含有2×MIC的肉桂提取物的TSB培養(yǎng)基,接入菌種,使最終濃度為106CFU/mL。于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出載玻片,用PBS洗3次,用濾紙輕輕吸去多余的水,在避光環(huán)境下于載玻片上滴加5 μL FITC-conA混合溶液,4 ℃放置30 min;在相同位置上再滴加5 μL PI溶液,4 ℃放置15 min。然后將載玻片放置于CLSM中觀察生物膜的結(jié)構(gòu)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

1.2.9.1 抑制率計算[14,16]

抑制率(%)=陰性對照組OD值-實驗組OD值/陰性對照組OD值×100

1.2.9.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算,并對其進(jìn)行顯著性分析(p<0.01為差異極顯著,0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 牛津杯法測定不同提取物的抑菌效果

通過牛津杯法測定了6種不同的香辛料的水提取物和80%乙醇提取物以及兩種抗生素氨芐西林(AM)和卡那霉素(KA)對副溶血弧菌的抑菌能力,結(jié)果見圖1。結(jié)果表明,肉桂、大蒜不論是水提取物還是乙醇提取物都表現(xiàn)出了較強的抑制效果,而迷迭香和小茴香的乙醇提取物具有較強的抑菌效果但其水提取物無抑菌效果;而丁香和花椒的乙醇提取物的抑菌能力不如其水提取物。陽性對照AM和KA的抑菌圈直徑小于肉桂和大蒜的乙醇提取物。后續(xù)研究中選用肉桂和大蒜的乙醇提取物,進(jìn)一步測定其對副溶血弧菌的MIC,以及對生物膜的抑制作用。

圖1 不同香辛料提取物及抗生素對副溶血弧菌的抑菌作用Fig.1 Inhibition effects of different spices and antibiotics on VP

2.2 篩選后的提取物對VP的MIC

分別測定肉桂和大蒜的乙醇提取物對VP的MIC,結(jié)果如圖2所示,兩種提取物對VP的MIC均為6.25 mg/mL。

圖2 香辛料提取物對副溶血弧菌的MICFig.2 The MIC of extracts of spices to VP

2.3 香辛料提取物對VP生物膜形成的抑制作用

肉桂和大蒜提取物對VP生物膜均有較強的抑制作用,且抑制率與濃度呈正相關(guān)(圖3),肉桂提取物的抑制率與濃度之間具有明顯的線性關(guān)系(R2=0.9803),在MIC時其抑制率為75.46%。大蒜提取物在MIC濃度下,抑制率達(dá)到87.68%;2×MIC濃度的大蒜提取物對VP生物膜的抑制率為97.20%,大于MIC濃度時的抑制率,但兩者之間的差異并不顯著,說明大蒜提取物在MIC濃度下已經(jīng)基本抑制了VP形成生物膜。

圖3 提取物對副溶血弧菌生物膜形成量的影響Fig.3 The inhibition effects of spices extracts on VP biofilm formation

2.4 香辛料提取物對VP生物膜代謝活性的影響

兩種提取物對VP生物膜代謝活性的影響如圖4所示。當(dāng)肉桂提取物濃度從1.56 mg/mL(1/4×MIC)增加到6.25 mg/mL(MIC),其對生物膜代謝活性的抑制率不斷增加。但高于MIC時,其對VP生物膜代謝活性的抑制率變化不大(兩兩之間差異不顯著),說明到MIC濃度時代謝活性抑制作用已基本達(dá)到極限。大蒜提取物也有相同的趨勢,但大蒜提取物的抑制作用更強,其在MIC(6.25 mg/mL)時,抑制率接近80%,而肉桂的抑制率約為60%。

圖4 提取物對副溶血弧菌生物膜代謝活性的影響Fig.4 The reductions of metabolic activities of biofilms by the extracts of spices

圖5 香辛料提取物對副溶血弧菌EPS的影響Fig. 5 The effects of spices extracts on EPS of VP

2.5 香辛料對VP生物膜胞外多糖的抑制作用

胞外多糖是細(xì)菌生物膜的主要成分,既是生物膜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),又是功能的主要承擔(dān)者[17]。因此,抑制或減少細(xì)菌分泌胞外多糖,是抑制生物膜形成的一種重要方法。香辛料提取物對VP胞外多糖的影響如圖5所示。由圖5可知,不論是肉桂還是大蒜的乙醇提取物對VP胞外多糖的抑制作用都隨著提取物濃度的增加而增強,且不同濃度之間的差異顯著,說明香辛料提取物濃度的改變會顯著影響VP胞外多糖的分泌。

2.6 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察香辛料提取物對生物膜的作用

激光共聚焦掃描顯微鏡除了能夠觀察細(xì)菌生物膜的平面圖像,還能夠?qū)ι锬さ牧Ⅲw結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維掃描,而且在熒光染料的作用下還能夠直觀地觀察胞外多糖及細(xì)胞的多少。本研究通過CLSM觀察肉桂乙醇提取物對VP生物膜的抑制情況,結(jié)果如圖6所示。通過a圖與c圖以及b圖與d圖的比較發(fā)現(xiàn),經(jīng)過2×MIC濃度的肉桂乙醇提取物處理之后,生物膜中死細(xì)胞的數(shù)量明顯增多,而多糖含量顯著減少,說明肉桂對VP具有較強的殺滅作用,且能減少胞外多糖的產(chǎn)生。

圖6 CLSM觀察肉桂提取物對副溶血弧菌生物膜的抑制作用Fig.6 The inhibition effects of cinnamon on VP biofilm observed by CLSM

3 結(jié)論與討論

以牛津杯法測定迷迭香、肉桂、丁香、花椒、小茴香、大蒜等的水提取物和80%乙醇提取物對VP的抑菌能力,結(jié)果顯示,肉桂的乙醇提取物和大蒜的乙醇提取物的抑菌能力最強。以96孔板法測定此兩種提取物對VP的MIC均為6.25 mg/mL。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析肉桂和大蒜的乙醇提取物對VP生物膜的抑制作用,分析其對VP生物膜形成總量、細(xì)胞代謝活性以及胞外多糖含量的影響。結(jié)果表明,在MIC時,肉桂和大蒜的乙醇提取物對VP生物膜形成的抑制率分別為75.46%和87.68%;并能降低細(xì)胞的代謝活性以及EPS的分泌,VP的代謝活性分別下降了54.67%和80.00%,EPS分別減少了78.57%和69.05%。說明這兩種提取物對VP生物膜的形成具有顯著的抑制作用。

抑制細(xì)菌形成生物膜可通過阻止細(xì)菌對物體表面的粘附,阻斷細(xì)菌間的信號交流甚至直接殺死細(xì)菌等[18]。而Sandra S等[19]從肉桂中提取精油,并用氣質(zhì)聯(lián)用檢測其主要成分為肉桂醛、丁香酚和芳樟醇,肉桂精油在亞抑菌濃度下能夠抑制不動桿菌、鞘脂單胞菌屬和寡養(yǎng)單胞菌生物膜的形成。崔海英等[20]采用MTT染色法和菌落計數(shù)法研究丁香精油對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用,結(jié)果表明,在0.1%丁香精油的作用下,生物膜的抑制率達(dá)到了99.73%,而且活菌數(shù)量也減少了99.93%。這些結(jié)果與本研究結(jié)果類似,但這些研究都沒有解釋香辛料等天然產(chǎn)物對細(xì)菌生物膜作用的具體機制,也說明仍有大量的工作需要完成。

香辛料是我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷恼{(diào)味品,我國是生產(chǎn)香辛料的大國[21],但是目前大多仍是利用其芳香氣味的功能,對其抗氧化及抗菌性能的利用則有待進(jìn)一步開發(fā)。在未來,結(jié)合本文的研究可以利用香辛料生產(chǎn)控制致病菌形成有害生物膜的制劑,為食品安全問題提供新的解決方案。

[1]胡小許,張義全. 黃倩,等. 副溶血弧菌Tox R截短體蛋白的表達(dá)純化及其DNA結(jié)合活性[J]. 微生物學(xué)報,2014,54(8):956-961.

[2]Pantanella F,Valenti P,Natalizi T,et al. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces:pros and cons of the main techniques currently in use[J]. Annali di igiene:medicina preventiva e di comunità,2013,25(1):31-42.

[3]賈文祥. 微生物生物膜研究的新進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2012,40(5):1-9.

[4]萬娜. 魚精蛋白對細(xì)菌及生物膜的抑制作用及初步應(yīng)用研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[5]Cerca N,Martins S,Cerca F,et al. Comparative assessment of antibiotic susceptibility of coagulase-negative staphylococci in biofilm versus planktonic culture as assessed by bacterial enumeration or rapid XTT colorimetry[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2005,56(2):331-336.

[6]Smith RS,Iglewski BH. P. aeruginosa quorum-sensing systems and virulence[J]. Current Opinion in Microbiology,2003,6(1):56-60.

[7]Xavier JB. Biofilm-control strategies based on enzymic disruption of the extracellular polymeric substance matrix-a modelling study[J]. Microbiology,2005,151(12):3817-3832.

[8]郭紅珍,杜鵑,史振霞,等. 幾種常見香辛料的抑菌作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(17):10273-10274.

[9]繆曉平,鄧開野,譚梅唇. 三種香辛料提取物抑菌及抗氧化性能的研究[J]. 中國調(diào)味品,2010,35(10):107-109.

[10]Sonia Sethi,Aparna Dutta,B Lal Gupta, et al. Antimicrobial activity of spices against isolated food borne pathogens[J]. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences,2013,5(1):260-262.

[11]Mousumi B,Prabir KS. Inhibitory effect of garlic on bacterial pathogens from spices[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2003,19(6):565-569.

[12]紀(jì)淑娟,隋時. 丁香抑菌成分超聲波提取工藝研究[J]. 食品科學(xué),2008,29(5):201-204.

[13]渠宏雁,李學(xué)鵬,儀淑敏,等. 亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制作用[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(21):178-182.

[14]Mejdi Snoussi A,Ameni Dehmani,Emira Noumi,et al. Chemical composition and antibiofilm activity of Petroselinum crispum and Ocimum basilicum essential oils against Vibrio spp. Strains[J]. Microbial Pathogenesis,2016,90:13-21.

[15]王桂洋. 殼聚糖對希瓦氏菌生物被膜抑制和清除作用的研究[D]. 杭州:浙江工商大學(xué),2015.

[16]Mitra M B,Jens R. Antibiofilm activity of essential oils and plant extracts against Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilms[J]. Food Control,2016,61:156-164.

[17]Sutherland IW. Biofilm exopolysaccharides:a strong and sticky framework[J]. Microbiology,2001,147(1):3-9.

[18]Francolini I,Donelli G. Prevention and control of biofilm based medical-device-related infections[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology,2010,59(3):227-238.

[19]Sandra S,André L. Essential oils show specific inhibiting effects on bacterial biofilm formation[J]. Food Control,2012,36(1):224-229.

[20]崔海英,周慧,劉延濤,等. 丁香精油對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用研究[J]. 中國食品添加劑,2015,12:55-59.

[21]王劼,張水華. 香辛料及其應(yīng)用[J]. 廣州食品工業(yè)科技,2000,16(1):46-48.

Inhibition effects of spices on biofilm formation ofVibrioparahaemolyticus

WEI Yu-qing1,2,XIE Ting1,LIU Huan1,LIU Yu-fei1,ZHONG Qing-ping1,*

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Institute of Microbiology,Guangzhou 510070,China;3.State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China,Guangzhou 510075,China)

In this study,antibacterial activities of 6 spice samples were extracted by water or ethanol,then 2 spices whose antibacterial activities were more efficient were selected to analyze the inhibition effects on biofilm ofVibrioparahaemolyticus(VP). The results showed that,the garlic,cinnamon and clove had the stronger antibacterial activities,but the antibacterial activities of Chinese prickly ash,fennel and rosemary were lower. MIC values of the garlic,cinnamon were 6.25 mg/mL for VP,respectively. Sub-MICs of all the extracts could not only inhibit the biofilm formation,but also reduce the metabolic activity and the secretion of extracellular polysaccharide of cells in the biofilms. With the aid of confocal laser scanning microscope(CLSM),the increase of dead cell numbers and the decrease of biofilm polysaccharides could be observed obviously.

spice;Vibrioparahaemolyticus;biofilm;inhibition

2016-06-30

魏宇清(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：824052630@qq.com。

*通訊作者:鐘青萍(1967-)，女，博士，副教授，研究方向：食品安全、食品微生物，E-mail：zhongqp@scau.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項目(31271956);2015年廣東省質(zhì)量工程項目-食品微生物學(xué)精品資源共享課。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)04-0101-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.011