李洋洋，韓迪，閆寶松，鄭健，*，閻秀峰

（1.東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源與環(huán)境研究中心/東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，黑龍江牡丹江157011）

不同品系猴頭菇子實體中總酚含量測定

李洋洋1，韓迪1，閆寶松2，鄭健1，*，閻秀峰1

（1.東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源與環(huán)境研究中心/東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，黑龍江牡丹江157011）

該文以猴頭菇子實體為原料，采用超聲波輔助提取法優(yōu)化猴頭菇總酚提取工藝條件。采用Folin-Ciocalteu比色法測定總酚的含量，沒食子酸為標準品，以猴頭菇子實體中總酚的含量為評價指標，分別對提取溶劑、提取時間和料液比進行優(yōu)化，建立了猴頭菇子實體中總酚的含量測定方法，得到最佳料液比1∶40（g/mL），純水提取，提取時間60min，總酚含量在0～14μg時與吸光度呈良好的線性關系，其回歸方程Y=0.037 3X+0.003 7，r≥0.999，平均加樣回收率為101.41%，RSD為1.20%。同時，將該方法在最適條件下測定了10個不同品系猴頭菇子實體中總酚的含量，不同品系猴頭菇子實體中總酚的含量在2.20mg/g～4.77mg/g之間。結(jié)果表明，該方法簡單、快速、重復性好，可用于猴頭菇子實體的總酚含量測定方法。

猴頭菇；Folin-Ciocalteu比色法；總酚；不同品系

酚類物質(zhì)是主要存在于植物中的復雜酚類化合物，屬植物的次生代謝產(chǎn)物[7-8]。目前食用菌酚類物質(zhì)也有諸多報道，具有強大的抗氧化活性和清除自由基的能力，可作為天然的抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn)，一些食用菌的抗氧化活性與總酚的含量相關，酚類物質(zhì)能夠抑制動脈硬化、癌癥等疾病，主要原因是酚類物質(zhì)可以與金屬離子螯合，減少金屬離子對氧化反應的催化，抑制脂氧合酶，清除自由基[9]。本試驗以酚類物質(zhì)為測定目標，建立猴頭菇子實體總酚含量的測定方法；同時對不同品系猴頭菇子實體中總酚含量進行了測定，為猴頭菇的質(zhì)量控制和營養(yǎng)成分分析提供穩(wěn)定、可靠的評價手段，并為人工栽培技術(shù)及在醫(yī)藥和食品行業(yè)的開發(fā)、應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

10個不同品系的猴頭菇菌種分別采自黑龍江省林副特產(chǎn)研究所、海林、磨刀石、小興安嶺、大興安嶺、長白山、柴河、三道關、福建三明、浙江常山縣（菌株名稱分別為TC_1#、TC_2#、TC_3#、XXAL-Y、1001、CBSY、CH-Y、SDG-Y、Ha、99），之后在黑龍江省海林土砬子村的菇棚地進行繁殖培育，待成熟后于60℃烘干至恒重。

沒食子酸標準品（純度≥98%）：購自Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙醇、丙酮：均為分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司；無水碳酸鈉（分析純），購自天津市致遠化學試劑有限公司；Folin-Ciocalteu試劑（FC試劑），購自天津市光復精細化工研究所。

BIOMATE 3S型紫外-可見分光光度計：Thermo Scientific；CU-420型水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；LEGEND MICROITR型離心機：Thermo Scientific。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取一水合·沒食子酸15.1mg，置錫箔紙包裹的2mL離心管中，加1.365mL純水溶解，搖勻得質(zhì)量濃度為10mg/mL的沒食子酸母液，再用純水稀釋得質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的沒食子酸對照品溶液。

1.2.2 標準曲線的繪制[10]

精密吸取對照品溶液0、20、30、40、60、80、100、120、140μL于離心管中，對應加入500、480、470、460、440、420、400、380、360μL純水后，分別加入0.5mLFC試劑，混勻，避光反應2min，然后分別加入2mL 7.5% Na2CO3，最后加入1mL純水搖勻，置于40℃水浴鍋中暗水浴30min，用紫外可見分光光度計測定760 nm的吸光值。分別以沒食子酸含量（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程。

1.2.3 供試品溶液的制備

將干燥的猴頭菇子實體粉碎，過60目篩。精密稱取0.25 g樣品（n=3），加8mL水超聲60min，用水定容至10mL。取1.5mL溶液于2mL離心管中，12000 r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即得猴頭菇供試品溶液。

為優(yōu)化提取工藝，選擇不同提取溶劑（不同濃度乙醇溶液、25%甲醇、25%丙酮和純水）、不同提取時間（15、30、45、60min）和不同料液比[1∶10、1∶20、1∶40、1∶100（g/mL）]進行提取工藝的優(yōu)化。

1.2.4 猴頭菇樣品總酚含量的測定

精密吸取樣品溶液0.1mL，加入0.4mL純水后，再加入0.5mLFC試劑，混勻，避光反應2min，然后加入2mL 7.5%Na2CO3，最后加入1mL純水搖勻，置于40℃水浴鍋中暗水浴30min，用紫外可見分光光度計測定760 nm的吸光值。根據(jù)標準曲線計算總酚濃度。

1.2.5 Folin-Ciocalteu比色法方法學評價

1）穩(wěn)定性：取同一樣品溶液0.1mL，按顯色條件顯色完全后測吸光值，分別在0、15、30、60、90、120min測吸光值。

2）精密度：取0.1mL待測溶液1份，按顯色條件顯色完全后測吸光值，連續(xù)測6次。

3）重復性：取0.1mL待測溶液6份，按顯色條件顯色完全后測吸光值。

4）加樣回收率：按照最佳提取工藝，制備猴頭菇供試品溶液。精密吸取0.1mL猴頭菇試樣，按顯色條件反應，在760 nm條件下測吸光值。根據(jù)標準曲線方程計算樣品中總酚的含量，測定猴頭菇溶液中總酚含量；取0.05mL猴頭菇試樣，分別加入0.05mL濃度依次為30、80、140μg/mL的沒食子酸對照品溶液，根據(jù)標準曲線方程計算該樣品中總酚的含量，計算回收率。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

檢測數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準偏差表示，采用SPSS17.0 Duncan法進行顯著性分析，運用Microsoft Excel軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

根據(jù)1.2.2項的方法，分別以沒食子酸含量（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為：Y=0.037 3X+0.003 7，r=0.999 6。結(jié)果表明總酚含量在0～14μg范圍內(nèi)線性關系良好。標準曲線見圖1。

2.2 總酚提取單因素試驗

2.2.1 提取溶劑對猴頭菇總酚含量的影響

首先選擇料液比1∶40（g/mL），提取時間60min，分別在體積分數(shù)為25%、50%、75%和100%的甲醇中超聲輔助提取，考察不同濃度甲醇對于猴頭菇總酚提取效率的影響。試驗結(jié)果表明，在25%的甲醇中提取效率最高，50%次之，100%甲醇提取效率最低，說明有機相越少，猴頭菇總酚的提取效率越高。

其次分別選用25%甲醇、25%乙醇、25%丙酮和純水進行超聲輔助提取，結(jié)果如圖2A所示。由圖2A可知，水提猴頭菇總酚含量最高，為3.17mg/g±0.12mg/g，顯著高于其他溶劑的提取含量，主要原因是酚類物質(zhì)含有羥基，是極性大分子化合物，提取溶劑的極性越大，溶解度越大，得到總酚含量越高。故選擇水作為總酚提取的溶劑。

2.2.2 提取時間對猴頭菇總酚含量的影響

選擇料液比1∶40（g/mL），最佳提取溶劑（水），選取提取不同時間（15、30、45、60min）進行超聲輔助提取，研究不同提取時間對猴頭菇總酚含量的影響，結(jié)果如圖2B所示。由圖2B可知，提取時間越長，總酚提取含量越高，提取時間為60min時，總酚含量達到3.32mg/g。但相鄰兩個時間點的猴頭菇總酚提取效率沒有顯著性差異，結(jié)合實際情況，選擇提取時間為60min。

2.2.3 料液比對猴頭菇總酚含量的影響

選擇最佳提取溶劑（水）和提取時間（60min），樣品分別以料液比1∶10、1∶20、1∶40、1∶100（g/mL）的比例進行超聲輔助提取，研究不同料液比對猴頭菇總酚含量的影響，結(jié)果如圖2C所示。由圖2C可知，隨著料液比的增加，總酚含量隨之增加。主要原因是溶劑的量越多，傳質(zhì)動力越大，擴散到溶劑里的酚類物質(zhì)就越多?？紤]到提取溶劑用量過多，對后面的試驗步驟帶來不便，因此選擇1∶40（g/mL）作為總酚含量提取的最佳料液比。

圖2 提取溶劑（A），提取時間（B）和料液比（C）對猴頭菇中總酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction solvent（A），extraction time（B）and solid to liquid ratio（C）on total polyphenols content from Hericium erinaceus

2.3 Folin-Ciocalteu比色法評價

按照本研究確定的最佳提取工藝，根據(jù)1.2.5項的方法，對本研究所采用的Folin-Ciocalteu比色法的穩(wěn)定性、精密度、重復性和加樣回收率進行評價，結(jié)果分別見表1和表2。

由表1和表2表明，在本實驗室條件下，該比色顯色方法靈敏度較高、準確可靠，可重復性較好，比較穩(wěn)定，適用于對猴頭菇樣品進行總酚的定量測定。

2.4 不同品系猴頭菇子實體樣品中的總酚含量

在上述Folin-Ciocalteu比色法方法學考察的基礎上，按照最佳提取工藝對不同品系猴頭菇子實體樣品中的總酚含量進行測定，結(jié)果如圖3所示。

表1 Folin-Ciocalteu比色法的穩(wěn)定性、精密度、重復性試驗結(jié)果Table1 Results of stability，precision and repeatability experiment of Folin-Ciocalteu colorimetry

表2 Folin-Ciocalteu比色法的回收率試驗結(jié)果Table2 Results of recovery rate experiment of Folin-Ciocalteu colorimetry

圖3 不同品系猴頭菇總酚含量Fig.3 Total polyphenols contents in different Hericium erinaceu strains

由圖3可知，10個不同品系猴頭菇中總酚含量在2.20mg/g～4.77mg/g，不同猴頭菇品系中總酚含量存在顯著差異。其中，采自浙江常山縣（99）的猴頭菇菌株培育的猴頭菇中總酚含量最高，其次為采自柴河（CHY）、林副特產(chǎn)所（TC_1#）、長白山（CBS-Y）、山道關（SDG-Y）和海林（TC_2#）的猴頭菇菌種培育的猴頭菇，采自福建三明（Ha）和磨刀石地區(qū)的猴頭菇菌種培育的猴頭菇中總酚含量最低。

3 結(jié)論

酚類物質(zhì)是蘑菇子實體中主要活性成分之一，它在生物抗氧化防御體系中具有重要作用[11]。蘑菇總酚含量影響其抗氧化能力的大小，因此，該方法可以作為猴頭菇質(zhì)量評價研究的方法之一，為人工栽培與選育猴頭菇品種提供參考。

通過單因素試驗考察了提取溶劑（25%甲醇、25%乙醇、25%丙酮、純水）、提取時間（15、30、45、60min）、料液比[1∶10、1∶20、1∶40、1∶100（g/mL）]對猴頭菇總酚提取的影響，最終優(yōu)選出的提取條件為純水提取，提取時間60min，料液比1∶40（g/mL）。該方法簡單、穩(wěn)定性好、精密度高。本試驗通過對10個不同品系猴頭菇子實體總酚含量的測定，采用SPSS 17.0 Duncan法進行顯著性分析，結(jié)果表明：不同品系猴頭菇中總酚含量差異顯著，其中99號總酚含量明顯高于其他品種，其含量為4.77mg/g。

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Determination of Total Polyphenol Content from Different Hericium erinaceus Strains

LI Yang-yang1，HAN Di1，YAN Bao-song2，ZHENG Jian1，*，YAN Xiu-feng1
（1.Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University/Key Laboratory of Salinealkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field，Ministry of Education，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development，Heilongjiang Forest Byproduct and Speciality Institute，Mudanjiang 157011，Heilongjiang，China）

The total polyphenol content from Hericium erinaceus was abstracted by ultrasonic-assisted extraction. The total polyphenol content was analyzed by Folin-Ciocalteu（FC）colorimetry method，and gallic acid was used as reference substance. Effects of extraction solvent，extraction time and solid to liquid ratio on total polyphenols content from Hericium erinaceus were investigated. It showed that the optimized extraction conditions were water extract，the extraction time was 60 min and the solid-liquid ratio is 1 ∶ 40（g/mL）. The calibration curves were linear over gallic acid content ranging from 0～14 μg，the typical standard curves were Y =0.037 3X+0.003 7 with the line regression correlation coefficients greater than 0.999. The average recovery was 101.41 % with RSD of 1.20 %. This method was also successfully applied to the determination of total polyphenols content from ten different Hericium erinaceus strains. The total polyphenol content from different Hericium erinaceus strains between 2.20 mg/g～4.77 mg/g .This method established is simple，rapid and repeatable，which is suitable for analysis of total polyphenols in Hericium erinaceus.

Hericium erinaceus；Folin-Ciocalteu（FC）colorimetry method；total phenols；different strains

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.026

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費（201404703）

李洋洋（1991—），女（漢），碩士研究生，主要從事細胞活性產(chǎn)物研究。

2016-05-30

猴頭菇（Hericium erinaceus）屬齒菌科真菌猴頭菌，又名獅鬃菇或刺猬菌，是一種珍貴的藥食兼用菌。

*通信作者猴頭菇營養(yǎng)豐富，味道鮮美，素有“山珍猴頭，海味燕窩”之說。猴頭菇的藥效成分主要有多糖、低聚糖、多酚、猴頭菌素、猴頭菌酮、甾醇類和脂肪酸等，具有保肝護胃、抗癌、抗氧化、保護神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫和防治心血管疾病等作用[1-3]，能夠治療胃炎，修復消化道粘膜，對食道癌、胃癌等腫瘤有很好的抑制作用，對眩暈、失眠、陽痿、體質(zhì)虛弱、心腦血管患者有較好的調(diào)理作用[4]。野生猴頭菇主要生長在東北大興安嶺，常于春夏之交生于麻櫟、板栗等活立木的死結(jié)、樹洞及朽木上。目前野生猴頭菇較為稀少，人工種植技術(shù)始于20世紀50年代末，猴頭菇營養(yǎng)價值高可作為保健品，藥用價值也高度受到人們的喜愛，所以猴頭菇品種的優(yōu)選對于人工種植優(yōu)質(zhì)猴頭菇具有重要意義[5-6]。