劉小飛，廖飛雄，李冬梅，劉曉榮

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

白鶴芋屬植物原產(chǎn)中南美洲和東南亞［1］，是國際上重要的天南星科室內(nèi)觀葉觀花植物［2］，具有獨(dú)特的開花特性。目前有關(guān)白鶴芋屬的研究主要集中在組織培養(yǎng)、栽培技術(shù)、種子萌芽特性、開花習(xí)性等方面［3-4］。有關(guān)白鶴芋屬植物種質(zhì)、系統(tǒng)演化和遺傳等方面研究報(bào)道并不多，而且市場上白鶴芋屬大多數(shù)品種名稱較混亂，難以從傳統(tǒng)分類的表型特征、譜系或地理來源等信息對其進(jìn)行分類。

序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP）是一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，自建立以來已應(yīng)用于種質(zhì)資源的鑒定評價(jià)、遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育分析、品種指紋圖譜繪制等方面［5-10］。目前還未見有關(guān)白鶴芋屬SRAP標(biāo)記相關(guān)方面的研究報(bào)道。本研究在建立和優(yōu)化白掌SRAP反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，通過SRAP標(biāo)記對 23個(gè)白鶴芋屬樣品進(jìn)行分析，以期從分子水平揭示其親緣關(guān)系，為白鶴芋屬資源的有效利用和保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料白鶴芋屬23個(gè)樣品包括21個(gè)栽培品種和2個(gè)原生種（表1），于2013年4月中旬采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地環(huán)境園藝研究所資源圃。采集供試材料的幼嫩葉片，用冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

采用Liu等［11］改良的CTAB-氯仿-異戊醇法，單株取嫩葉提取基因組DNA。引物、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照劉小飛等［12］，上游引物有me1～me5，下游引物有em1～em6，共30個(gè)引物組合；反應(yīng)程序中72℃延伸時(shí)間改為100 s，其他參數(shù)不變。指紋圖譜構(gòu)建及聚類分析參照劉小飛等［12］。主坐標(biāo)分析采用Nei遺傳距離［13］。

表 1 供試白鶴芋屬材料

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

30個(gè)SRAP引物組合共擴(kuò)增出343個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為214個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)62%，平均每個(gè)引物組合擴(kuò)增出多態(tài)性條帶7.1條，其中多態(tài)性較好的有19個(gè)引物組合（表2），部分引物擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

圖1 引物Me5/Em4對23份白鶴芋屬種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果

表2 30個(gè)引物組合在23個(gè)白鶴芋屬種質(zhì)中的多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果

2.2 基于SRAP標(biāo)記的聚類分析

從表3可以看出，23份白鶴芋屬種質(zhì)兩兩之間的遺傳相似系數(shù)分布在0.36～0.98之間。其中mo和S. cannifolium的相似系數(shù)最小、為0.36，表明兩個(gè)種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；甜糕和綠怡1號之間的相似系數(shù)最大、為0.98，表明兩個(gè)種質(zhì)間的親緣關(guān)系最近。

從聚類結(jié)果（圖2）可以看出，以相似系數(shù)0.72為標(biāo)準(zhǔn)，23份白鶴芋屬種質(zhì)可分為 3類7組。第Ⅰ、Ⅱ類主要是花序具有乳頭狀突起的種質(zhì)。以相似系數(shù)0.84為標(biāo)準(zhǔn)，第Ⅰ、Ⅱ類可以進(jìn)一步分組，第Ⅰ類只有1份種質(zhì)，這個(gè)種具有與其他白鶴芋屬植物差別明顯的性狀和生長特性，植株緊湊，葉片帶黃綠、具鵝絨質(zhì)感，白色脈顯著，側(cè)脈白色。這些性狀的開發(fā)將大大豐富白鶴芋屬植物的觀賞性狀從而提高其觀賞價(jià)值。第Ⅱ類分為5組：第 1 組包括S.‘Coddy color’和S.‘Parrish’等15份種質(zhì)，這組種質(zhì)花序多具有乳頭狀突起；第 2 組含亮葉1份種質(zhì)；第 3 組含香水1份種質(zhì)；第 4組含mo和皇后2份種質(zhì)；第5組為華麗1號和華麗2號，株型較大。第Ⅲ類有1份種質(zhì)，為原生種S.cannifolium，花序不具有乳頭狀突起，雌蕊發(fā)育不完全，具香味。

圖2 23份白鶴芋屬種質(zhì)SRAP擴(kuò)增譜帶的UPGMA聚類結(jié)果

2.3 利用主坐標(biāo)分析的白鶴芋屬23份種質(zhì)親緣關(guān)系

采用主坐標(biāo)分析對23份白鶴芋屬種質(zhì)SRAP標(biāo)記的原始矩陣進(jìn)行解析，結(jié)果表明，前3個(gè)主坐標(biāo)可以闡明的相關(guān)性分別為16.8%、8.7%和 5.8%。

進(jìn)一步通過第一、第二主坐標(biāo)二維圖對

23份種質(zhì)排序，以及通過前3個(gè)主坐標(biāo)三維圖對其進(jìn)行排序，結(jié)果見圖3和圖4。 由圖3可知，23份白鶴芋屬種質(zhì)可分為4類。第Ⅰ類共有19份，該組的花序多具有明顯的乳頭狀突起的種質(zhì)；第Ⅱ類僅為S. floribundum1份種質(zhì)，該種質(zhì)花序乳頭狀突起不明顯；第Ⅲ類僅有S.cannifolium1份種質(zhì)，該組花序的乳頭狀突起不明顯，且雌蕊與雄蕊近等高；第Ⅳ類有2份種質(zhì)。

表3 23份白鶴芋屬種質(zhì)相似性矩陣

圖3 23份白鶴芋屬種質(zhì)SRAP標(biāo)記主坐標(biāo)分析第一、第二主坐標(biāo)散點(diǎn)圖

在圖3分類基礎(chǔ)上，對其第三主坐標(biāo)分析，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，23份白鶴芋屬種質(zhì)可進(jìn)一步分為5組：第Ⅰ類12份種質(zhì)，第Ⅱ類7份種質(zhì)，第Ⅲ類和第Ⅳ類均僅有1份種質(zhì)，第Ⅴ類2份種質(zhì)歸為1組。

圖4 23份白鶴芋屬種質(zhì)SRAP標(biāo)記主坐標(biāo)分析的三維散點(diǎn)圖

比較分析圖2～圖4表明，系統(tǒng)聚類和主坐標(biāo)分析所得結(jié)果相近，但主坐標(biāo)分析可以更加直觀地顯示各種質(zhì)間的關(guān)系，分析結(jié)果更清晰。

3 討論

SRAP標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種園藝植物［14］。本試驗(yàn)所選用的30對引物可以較好地對23份白鶴芋屬種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，表明該方法適用于白鶴芋屬種質(zhì)資源鑒評及親緣關(guān)系分析。系統(tǒng)聚類分析可以對親緣關(guān)系較近的種質(zhì)進(jìn)行分析，而對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)分析效果不理想，主坐標(biāo)分析方法可有效解決該問題。Renganayaki等［15］和 Sun 等［16］分別在對牧草和春小麥的研究中應(yīng)用該方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)主坐標(biāo)分析在分析主要類群間關(guān)系時(shí)可以提供充足信息。本研究中，將兩者結(jié)合起來可以更好、更全面地闡明白鶴芋屬23個(gè)種質(zhì)間的親緣關(guān)系，為后續(xù)的遺傳育種提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。此外，應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記分析構(gòu)建白鶴芋屬植物的指紋圖譜，可以有效解決市場上白鶴芋屬種質(zhì)命名上的混亂現(xiàn)狀，從而更好地指導(dǎo)科研和生產(chǎn)。

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