吳劍龍，曹明溶?

（1.暨南大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510630；2.暨南大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510630）

循環(huán)腫瘤細胞在原發(fā)性肝癌中的應用及展望

吳劍龍1，曹明溶2?

（1.暨南大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510630；2.暨南大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510630）

原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，侵襲、轉移力強，死亡率高，且預后較差。循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）是指實體瘤或者轉移灶癌細胞脫落并釋放入外周血液循環(huán)當中的腫瘤細胞，它與患者治療后的復發(fā)及轉移有著密切聯(lián)系。隨著精準醫(yī)療時代的到來及細胞檢測技術的進步，循環(huán)腫瘤細胞檢測促進了乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤的診斷、病情管理、治療及預后評估?，F(xiàn)筆者就近年來關于 CTCs 在原發(fā)性肝癌中的應用及前景進行綜述。

循環(huán)腫瘤細胞；原發(fā)性肝癌；治療應用

原發(fā)性肝癌（肝癌）在當前全球男性腫瘤中發(fā)病率位居第五位，女性中居第七位[1]。盡管如此，絕大多數(shù)肝癌患者仍然出現(xiàn)在非西方國家，據(jù)2012年統(tǒng)計，中國肝癌新發(fā)率已占全球50%以上。原發(fā)性肝癌在全球癌癥致死病因中高居第二位，全世界平均每年約有25萬人死于肝癌，而我國約占總數(shù)的45%，嚴重威脅我國人民的生命和健康[2]。近年來隨著檢驗技術及診斷方式的進步，肝癌的檢出率有所上升，死亡率有所下降，但大部分患者確診時已是晚期、復發(fā)或轉移，此時往往已經(jīng)失去治療的“黃金”時期。為了進一步優(yōu)化對原發(fā)性肝癌的診療，高效的、準確預測復發(fā)風險的和評估預后效果的檢測指標具有很重要的價值。循環(huán)腫瘤細胞最早在1869年由Thomas Ashworth發(fā)現(xiàn)[3]，小量存在于癌癥患者血液中類似于原發(fā)腫瘤的細胞，是一種監(jiān)測腫瘤細胞轉移以及觀察腫瘤異質性的標志物，與轉移性癌癥患者的無進展生存期率、總生存率、監(jiān)測治療效果以及制定個體化治療方案密切相關。目前，CTCs被FDA證實在乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌等預后提供有效依據(jù)[4]，但在肝細胞癌（HCC）的臨床應用是滯后于這些腫瘤類型。為此本文總結CTCs的檢測并探討其在肝癌的臨床意義及前景。

1 HCC-CTCs的富集與檢測

CTCs是由原發(fā)或轉移癌灶中脫落并釋放至外周血液循環(huán)。在外周血液中，CTCs的含量極少，通常1毫升癌癥患者外周血中約含有1000萬的白血細胞和50億的紅血細胞，其中僅含有1個循環(huán)腫瘤細胞[5]。高靈敏度和高特異度的分離富集和鑒定技術成為CTCs檢測重要體系。

CTCs的富集技術是根據(jù)循環(huán)腫瘤細胞的物理學（大小、密度、電荷及變性能力）和生物學（細胞表面蛋白表達、活性）特征，從外周血細胞中提高CTCs的相對濃度[6]。目前，常用的富集方法包括：1.密度梯度離心法 是最經(jīng)典的循環(huán)腫瘤細胞分離技術之一，通過血液細胞密度的差異，在離心力的作用下，導致不同類型的細胞分離至不同的層面。質量較輕的腫瘤細胞和單核細胞保留在離心液的上層，而質量較重的紅細胞和嗜中性粒等細胞則遷移至底部。在此機制上，建立了傳統(tǒng)的ficoll-hypaque和德國的oncoquick法。使用ficoll-hypaque或oncoquick方法在原發(fā)性肝癌中進行了CTCs的密度梯度分離，以將CTCs與其他血細胞分離。相對于ficoll-hypaque法，oncoquick法能有效的避免了不同細胞層間的交叉污染[7-8]。2.濾過法 根據(jù)細胞的大小，使用特定的過濾器，將目的細胞與其他細胞分離。CTCs可以很容易的從外周血中通過聚碳酸酯孔膜中分離出來。這種技術溫和，不會造成細胞的損傷，有效地提高分析效能[9]。然而濾過法具有相對較低的靈敏度和特異性，小CTCs可能丟失，而大的白細胞可能影響CTCs的檢測。3.免疫磁性分離法是目前臨床及科研應用最廣泛及唯一通過FDA批準的分離技術，原理為：CTCs表面表達的特異性抗原，與磁珠包被的同源抗體結合，制成免疫磁珠，形成“腫瘤細胞-抗原抗體-磁珠”復合物，在外加磁場的作用下，進一步分離和富集循環(huán)腫瘤細胞[9]。目前，根據(jù)磁性細胞分選策略的不同，大致分為: 陽性富集法和陰性富集法。在陽性富集法中，直接與腫瘤相關細胞表面抗原結合（如EpCAM、CK-19）捕獲CTCs，缺乏明確的腫瘤細胞相關抗原是這方法的主要局限性。陰性富集法中通過靶向性結合白細胞共同表達的抗原（如CD45）去除血液中大部分白細胞，從而獲得CTCs，這種方法由于與非特異性的抗原結合，可能會導致假陽性[10]。

成功富集CTCs后，第二步就是準確識別來自外周血細胞中的腫瘤細胞。一般來說，CTCs主要檢測方法可分為兩組：基于流式細胞儀和以核酸為基礎的方法[11]?；诹魇郊毎麅x技術使用免疫細胞化學法來分析不同的腫瘤細胞；以核酸為基礎的技術使用PCR、RT-PCR、實時定量的RT-PCR、全基因擴增和熒光原位雜交技術（FISH技術）檢測外周血液中的細胞DNA或RNA序列，進一步區(qū)分腫瘤細胞和正常血細胞。①免疫細胞化學法（Immunocytochemistry，ICC）通過使用標記（如熒光分子）的特異性抗體與腫瘤細胞表面特異性抗原結合，形成可視化的復合物，完成對腫瘤細胞的測定。ICC的優(yōu)點對腫瘤細胞大小和形態(tài)學的分析，缺點是耗時及敏感性低[12]。②RT-PCR檢測技術，是目前以核酸為基礎的應用最廣泛、最有效的方法，主要檢測來自CTCs的DNA或mRNA，具有高靈敏度、可循環(huán)使用的優(yōu)點，但由于檢測的是核酸，測定過程中需要破壞CTCs，因而無法統(tǒng)計腫瘤細胞數(shù)目及分析腫瘤細胞的形態(tài)[13]。

2 CTCs在原發(fā)性肝癌的應用

2.1 CTCs檢測在肝癌輔助診斷及預后方面的價值

血行轉移是原發(fā)性肝癌最常見的轉移方式。目前，肝癌轉移的診斷主要依靠影像學和血清AFP的監(jiān)測。臨床上應用超聲、CT和MRI對肝癌轉移灶的檢測只能到1厘米或更大。CTCs的檢測有助于發(fā)現(xiàn)直徑小于1 mm的腫瘤，對評估腫瘤的擴散，預后和治療提供可靠的幫助。

Junhua[14]等使用巢式RT-PCR技術對72例肝細胞癌患者進行術前、術后0、3、6、9和12個月外周血CTCs表達情況進行研究，在肝癌切除術前，43例患者外周血中CTCs表達陽性，其中有22例在術后復查期間已發(fā)生肝內及肝外轉移。此外，29例術前CTCs陰性表達中，有2例分別在術后6和9個月復查時CTCs表達陽性且在術后12個月發(fā)現(xiàn)轉移灶，證實了CTCs表達陽性可作為肝癌切除術后發(fā)生肝癌轉移的關鍵預測因子。同時，Schulze[15]等借助CellSerch平臺對59例HCC患者進行檢查及生存時間的分析，結果顯示30.5%患者CTCs表達陽性，且檢測出的數(shù)目與BCLC分期呈正相關，與生存時間呈負相關，預示著原發(fā)性肝癌的預后不良，且CTCs數(shù)目與腫瘤預后密切相關。有課題組研究顯示肝癌切除術前外周血中CTCs數(shù)＞2個/7.5 mL，則預測術后HCC患者的腫瘤復發(fā)，特別是在AFP水平＜400 ng/mL或低復發(fā)風險的患者中[16-17]。這些研究結果均表明CTCs可作為一種新型的肝癌轉移診斷指標，輔助臨床醫(yī)生對肝癌的復發(fā)和轉移進行早期診治。

2.2 CTCs在肝癌臨床療效的相關性

目前研究證明，肝癌患者在行手術治療前已有CTCs進入血液循環(huán)，通過自身的免疫逃逸、癌基因與抑癌基因相互作用等因素以休眠狀態(tài)潛伏于患者體內，在某些因素的刺激下，它們被喚醒進入增殖，分散地存在并播散至機體的其他部位或組織，從而引起肝內外轉移或肝內復發(fā)[18]。當轉移病灶不能被當前影像學檢查或檢測技術監(jiān)測到時，臨床醫(yī)生沒有一個明確的指標來指導這一時期的診治，這可能錯過癌灶治療的關鍵時段。因此，CTCs在外周血中的表達，即使是很小的病灶（＜1 mm）或者在腫瘤尚未在體內形成轉移灶時，可作為此時期的一個新靶點，降低腫瘤轉移和手術后的復發(fā)風險，從而提高患者的生存率。AFP是目前HCC診斷及判斷預后效果最常用的指標，但對于那些低AFP水平甚至假陽性的患者，CTCs的監(jiān)測對于HCC的復發(fā)及轉移的預測則更具指導意義。

3 展 望

原發(fā)性肝癌是全球最致命的腫瘤之一。過去幾年中，隨著診斷和治療方式的進步，原發(fā)性肝癌患者預后已經(jīng)大大改善。但由于檢測技術精準度的局限性，腫瘤復發(fā)和轉移的患者總體預后仍然不佳，因此CTCs可作為新型監(jiān)測腫瘤標記物。CTCs在外周血的存在是腫瘤轉移的第一步，它是評估腫瘤狀態(tài)及預后一個重要生物學標志，在腫瘤復發(fā)和轉移的早期診斷、個性化治療方案、預后評估及預測腫瘤轉移機理等方面具有積極的意義。由于CTCs無創(chuàng)診斷，可以在治療過程中監(jiān)測患者全身情況，患者依從性較好，因此該技術逐漸推廣應用于臨床工作。但CTCs檢測成本昂貴、無標準化的檢測方法、釋放入血中的規(guī)律性及在肝癌方面的研究相對較少等問題，期望臨床醫(yī)生和研究人員可以更深入地探索CTCs相關檢測的技術及在HCC中的應用，旨在改善患者預后，延長患者的生存期，更好地應用于臨床腫瘤的診治。

[1] Jump D B,Depner C M,Tripathy S,et al.Potential for Dietary ω-3 Fatty Acids to Prevent Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Reduce the Risk of Primary Liver Cancer[J].Advances in Nutrition,2015,6(6):694-702.

[2] Wallace M C,Preen D,Jeffrey G P,et al.The evolving epidemiology of hepatocellular carcinoma: a global perspective[J].Expert Review of Gastroenterology &Hepatology,2015,9(6):765.

[3] Ashworth T.A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death[J].The Australian Medical Journal,2009,3(14):146-149.

[4] Friedlander T W,Premasekharan G,Paris P L.Looking back,to the future of circulating tumor cells[J].Pharmacology & Therapeutics,2014,142(3):271-280.

[5] Bhana S,Wang Y,Huang X.Nanotechnology for enrichment and detection of circulating tumor cells[J].Nanomedici ne,2015,10(12):1973-1990.

[6] Ramosmedina R,Moreno F,Lopeztarruella S,et al.Review: circulating tumor cells in the practice of breast cancer oncology.[J].Clinical and Translational Oncology,2016,18(8):749-759.

[7] Alixpanabières C,Pantel K.Challenges in circulating tumour cell research.[J].Nature Reviews Cancer,2014,14(9):623-631.

[8] Broersen L H,van Pelt G W,Tollenaar R A,et al.Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer[J].Cellular Oncology,2014,37(1):9-15.

[9] Jin C,Mcfaul S M,Duffy S P,et al.Technologies for label-free separation of circulating tumor cells: from historical foundations to recent developments.[J].Lab on A Chip,2013,14(1):32-44.

[10] Zhang C,Guan Y,Sun Y,et al.Tumor heterogeneity and circulating tumor cells[J].Cancer Letters,2016,374(2):216-223.

[11] Joosse S A,Gorges T M,Pantel K.Biology,detection,and clinical implications of circulating tumor cells.[J].Embo Molecular Medicine,2015,7(1):1-11.

[12] Yu N,Zhou J,Cui F,et al.Circulating tumor cells in lung cancer: detection methods and clinical applications.[J].Lung,2015,193(2):157-171.

[13] Hart C D,Galardi F,Pestrin M,et al.Using CTCs for pharmacogenomic analysis[J].Pharmacological Research,2016,106:92-100.

[14] Jin J,Niu X,Zou L,et al.AFP mRNA level in enriched circulating tumor cells from hepatocellular carcinoma patient blood samples is a pivotal predictive marker for metastasis[J].Cancer Letters,2016,378(1):33-37.

[15] Schulze K,Gasch C,Staufer K,et al.Presence of EpCAM-positive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma.[J].International Journal of Cancer,2013,133(9):2165.

[16] Sun Y F,Xu Y,Yang X R,et al.Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection[J].Hepatology,2013,57(4):1458.

[17] Sun W,Huang T,Li G,et al.The advantage of circulating tumor cells over serum carcinoembryonic antigen for predicting treatment responses in rectal cancer[J].Future Oncology,2013,9(10):1489-1500.

[18] Liu S,Li N,Yu X,et al.Expression of intercellular adhesion molecule 1 by hepatocellular carcinoma stem cells and circulating tumor cells.[J].Gastroenterolo gy,2013,144(5):1031.

R735.7

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ISSN.2095-8242.2017.066.13052.03

吳劍龍（1991-），男，廣東中山人，在讀碩士研究生，研究方向：普通外科學

曹明溶，男，教授，碩士，碩士研究生導師，E-mail：tcaomr@jnu.edu.cn

吳玲麗