頓珠加才，張俸偉，夏小婷，宋恩亮，陳 宏，雷初朝*

(1.西藏農(nóng)科院草業(yè)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850009；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技系統(tǒng)，陜西 楊凌，712100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100)

[目的] 分析西藏牛和日喀則駝峰牛的Y染色體遺傳多樣性及父系起源。[方法] 采用PCR擴(kuò)增、測序及生物信息學(xué)方法。[結(jié)果] 通過對13頭西藏牛Y-SNPs分析，發(fā)現(xiàn)西藏牛包含普通牛Y1、Y2及瘤牛Y3三種單倍型組，其頻率分別為0.077、0.846和0.077；對8頭日喀則駝峰牛Y-SNPs的分析表明，日喀則駝峰牛具有普通牛Y2和瘤牛Y3兩種單倍型組，其頻率分別為0.125和0.875。西藏牛和日喀則駝峰牛的單倍型多樣度分別為0.2949±0.1558和0.2500±0.1802，表明西藏牛和日喀則駝峰牛具有較低的父系遺傳多樣性。[結(jié)論] 西藏牛主要為普通牛Y2起源，日喀則駝峰牛主要為瘤牛Y3起源，且其遺傳多樣性較低。

西藏牛；日喀則駝峰牛；Y-SNPs；遺傳多樣性；父系起源

西藏地處我國西南部，平均海拔高，自然環(huán)境惡劣，氣候復(fù)雜，但有較多的草甸草場，適合放牧和農(nóng)業(yè)種植。西藏地區(qū)牛種資源豐富，擁有耐高耐寒的特性，能適應(yīng)高海拔和嚴(yán)酷的自然氣候[1]。西藏牛是西藏地區(qū)特有的黃牛品種，具有適應(yīng)高海拔缺氧環(huán)境和粗放飼養(yǎng)管理的特征，但存在體型小和生產(chǎn)性能低的缺點(diǎn)。目前對于西藏牛生理生化水平的研究較多，而關(guān)于其Y染色體分子遺傳多樣性及父系起源的研究較少[2]。日喀則駝峰牛是近代日喀則地區(qū)的農(nóng)牧民自發(fā)地從印度、尼泊爾、不丹等地引入的瘤牛公牛與當(dāng)?shù)氐狞S牛雜交，經(jīng)過長時間的選育，逐漸形成的獨(dú)特類群，與當(dāng)?shù)攸S牛相比有很明顯的優(yōu)勢，如體格較大、產(chǎn)乳性能增加[2]。但是對于日喀則駝峰牛的父系起源研究尚未見報道。本文利用家牛兩個Y-SNPs(ZFY10和UTY19)標(biāo)記對西藏牛和日喀則駝峰牛進(jìn)行分子遺傳多樣性研究，以期從分子水平上探究西藏牛和日喀則駝峰牛的Y染色體分子遺傳多樣性、父系起源和群體結(jié)構(gòu)，為西藏牛和日喀則駝峰牛的遺傳資源保護(hù)和利用提供理論依據(jù)，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集及基因組DNA的提取

在西藏自治區(qū)日喀則市定結(jié)縣薩爾鄉(xiāng)采集13頭西藏牛公牛耳組織樣本，在日喀則市附近和定結(jié)縣陳塘鎮(zhèn)采集8頭日喀則駝峰牛公牛的耳組織樣本，用試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)方法提取基因組DNA，并將其稀釋到10 ng/μL，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物的合成和PCR擴(kuò)增

參考G?therstr?m 等[3]、Ginja等[4]發(fā)表的家牛Y-SNP標(biāo)記，合成2對引物(UTY19和ZFY10)(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為12.5 μL：2×PrimeSTAR Max Premix 6.25 μL，上下游引物(10 pmol/L)各0.25 μL，模板DNA 1μL，超純水5.25μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸30 s，36個循環(huán)，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 西藏牛和日喀則駝峰牛Y染色體UTY-19和ZFY-10標(biāo)記的PCR信息

1.3 PCR產(chǎn)物測序、單倍型分型及單倍型多樣度計算

檢驗合格的PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司3730XL型DNA測序儀(Applied Biosystems)進(jìn)行正反向測序，使用Chromas 2.3軟件對測序結(jié)果進(jìn)行檢測，并用Bioedit 7.0.9軟件進(jìn)行分析，利用 Arlequin 3.0 軟件進(jìn)行單倍型多樣度(H±SD)計算。

2 結(jié)果與分析

通過對西藏日喀則市2個黃牛品種西藏牛和日喀則駝峰牛的兩個Y-SNPs標(biāo)記(UTY19和ZFY10)的測序分析，結(jié)果顯示，2個Y-SNPs標(biāo)記在13頭西藏牛和8頭日喀則駝峰牛中具有明顯的多態(tài)性(表2)。參考G?therstr?m 等[3]、Ginja 等[4]對家牛Y染色體單倍型組判定的標(biāo)準(zhǔn)，可知13頭西藏牛中有1頭為普通牛Y1單倍型組，1頭為瘤牛Y3單倍型組，其余11頭為普通牛Y2單倍型組，Y1、Y3和Y2單倍型組個體所占頻率依次是0.077、0.846和0.077，表明西藏牛有3種Y染色體單倍型組，以Y2單倍型組為主，Y1和Y3單倍型組為輔，西藏牛的Y染色體單倍型多樣度為0.2949±0.1558。在8頭日喀則駝峰牛中，1頭為普通牛Y2單倍型組，其余7頭為瘤牛Y3單倍型組，Y3和Y2單倍型組個體所占頻率依次是0.875和0.125，日喀則駝峰牛的單倍型多樣度為0.2500±0.1802，表明日喀則駝峰牛有2種Y染色體單倍型組，以Y3單倍型組為主，Y2單倍型為輔。

表2 西藏牛和日喀則駝峰牛Y染色體單倍型組類型，頻率及單倍型多樣度

3 討論

Y染色體分子標(biāo)記(Y-SNPs和Y-STRs)被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外家牛的父系遺傳研究中， Edwards等[5]分析了歐洲和亞洲138個品種2087頭牛的Y染色體分子遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)歐洲牛為普通牛Y1和Y2兩種父系起源，亞洲西南部為瘤牛Y3父系起源。常振華等[6]用4個Y-SNPs標(biāo)記對16個地方牛品種進(jìn)行研究，結(jié)果表明北方黃牛以普通牛Y2單倍型組為主，南方黃牛以瘤牛Y3單倍型組為主，中原黃牛既含有普通牛Y2單倍型組，也含有瘤牛Y3單倍型組。趙曉誠等[7]用UTY19和ZFY10兩個標(biāo)記對30頭嶺南黃牛進(jìn)行研究，結(jié)果表明嶺南黃牛的父系起源以瘤牛為主，普通牛為輔。

從起源上講，西藏牛是原牛遷移到西藏地區(qū)，而未向西方遷移，保留下來的古老牛種[8]。西藏牛主要產(chǎn)區(qū)在西藏雅魯藏布江中下游、喜馬拉雅山東段和三江流域下游地區(qū)及毗鄰的草甸草場，尤以拉薩、林芝、昌都、山南市分布最多。據(jù)我們調(diào)查，日喀則市也有西藏牛分布，對日喀則市定結(jié)縣的西藏牛未見研究。本文通過對西藏牛兩個Y-SNPs的分析，表明該品種中以單倍型Y2為主，單倍型Y1與Y3為輔，據(jù)此推測西藏牛以普通牛Y2父系起源為主，其單倍型多樣度為0.2949±0.1558，這個結(jié)果與Li 等[9]對16個中國地方黃牛品種的平均單倍型多樣度0.6830±0.0130相比較，表明西藏牛父系遺傳多樣性較低。雷初朝等[10]，羅永發(fā)等[11]的研究都將西藏牛歸類到北方黃牛類型中，而常振華等[6]的研究表明北方黃牛以單倍型組Y2為主，所以普通牛單倍型組Y1的出現(xiàn)，推測是由于引進(jìn)的西方牛品種(如安格斯、荷斯坦牛等品種)與西藏牛雜交導(dǎo)致的雄性基因滲入所致；西藏牛單倍型組Y3的存在，表明定結(jié)縣西藏牛與日喀則駝峰牛存在一定程度的雜交。

日喀則駝峰牛屬于西藏地區(qū)的牛種，其起源受到印度、尼泊爾、不丹等地引入的瘤牛公牛的影響，擁有瘤牛血統(tǒng)[2]。楊章平等[12]通過對西藏南部高寒地區(qū)瘤牛群體形態(tài)及生態(tài)特征的研究，發(fā)現(xiàn)我國西藏瘤牛和云南瘤牛之間可能存在血緣關(guān)系。羅永發(fā)等[11]的研究表明，日喀則駝峰牛由于受到瘤牛血緣漸滲的影響，而與其他普通牛品種的遺傳距離很遠(yuǎn)。通過對日喀則駝峰牛兩個Y-SNP的結(jié)果分析，推測日喀則駝峰牛有兩個父系起源，主要以瘤牛單倍型組Y3為主，普通牛單倍型組Y2為輔。這與中國畜禽遺傳資源志·牛志中日喀則駝峰牛形成的歷史吻合。日喀則駝峰牛的單倍型多樣度為0.2500±0.1802，低于Li等[9]對16個中國地方黃牛品種的平均單倍型多樣度0.6830±0.0130，表明日喀則駝峰牛的父系遺傳多樣性較低。

[1] 陳智華, 鄧曉瑩. 西藏牦牛和黃牛遺傳多態(tài)性的研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 1999,(3): 274-277.

[2] 國家畜禽遺傳資源委員會編著. 中國畜禽遺傳資源志·牛志[M].北京:2011.

[3] G?therstr?m A, Anderung C, Hellborg L, et al. Cattle domestication in the Near East was followed by hybridization with aurochs bulls in Europe[J]. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences, 2005, 272(1579):2345.

[4] Ginja C, da Gama LT, Penedo MCT. Y chromosome haplotype analysis in Portuguese cattle breeds using SNPs and STRs[J]. Journal of Heredity, 2009, 100(2):148-157.

[5] Edwards CJ, Ginja C, Kantanen J, et al. Dual origins of dairy cattle farming--evidence from a comprehensive survey of European Y-chromosomal variation[J]. Plos One, 2011, 6(1): e15922.

[6] 常振華, 衛(wèi)利選, 張潤鋒,等. 中國黃牛Y-SNPs遺傳多樣性與起源研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2011, 42(11): 1537-1542.

[7] 趙曉誠, 林清, 左自意, 等. 嶺南黃牛Y-SNP遺傳多樣性與父系起源研究[J].中國牛業(yè)科學(xué), 2017, 43(4): 4-6.

[8] 陳幼春主編. 中國黃牛生態(tài)種特征及其利用方向[M], 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1990.

[9] Li R, Zhang XM, Campana MG, et al. Paternal origins of Chinese cattle[J]. Animal Genetics, 2013, 44(4): 446-449.

[10] 雷初朝, 陳宏, 胡沈榮. Y染色體多態(tài)性與中國黃牛起源和分類研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2000, 9(4): 43-47.

[11] 羅永發(fā), 王志剛, 李加琪,等. 采用微衛(wèi)星標(biāo)記分析13個中外牛品種的遺傳變異和品種間的遺傳關(guān)系[J]. 生物多樣性, 2006, 14(6): 498-507.

[12] 楊章平, 常洪, 李相運(yùn), 等. 西藏南部高寒地區(qū)瘤牛群體形態(tài)及生態(tài)特征研究[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2002, 23(1): 23-26.