張樹(shù)娜，李燕子，楊惠林，黃文軍，騰小娜

(青海紅十字醫(yī)院，西寧 810000)

以往國(guó)內(nèi)外研究提示長(zhǎng)期處于高原低氧環(huán)境下，男性精液質(zhì)量呈下降趨勢(shì)[1-3]。目前高原低氧環(huán)境導(dǎo)致精子濃度降低的機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論。

國(guó)外研究[4]發(fā)現(xiàn)，精子DNA損傷與精子活力呈負(fù)相關(guān)性，這提示精子DNA受損是影響男性精液質(zhì)量因素之一。長(zhǎng)期暴露在高原低氧環(huán)境下，精子DNA的損傷程度呈加重趨勢(shì)[5]。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(Checkpoint kinase1，Chk1)是細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在DNA損傷引起的周期檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。研究者[6]發(fā)現(xiàn)，Chk1表達(dá)的下降或失活會(huì)影響細(xì)胞損傷的修復(fù)。西寧地區(qū)漢族人群男性不育患者精子中Chk1基因表達(dá)情況不明。本研究通過(guò)檢測(cè)正常精子組、少精子組、弱精子組、少弱精子組Chk1基因表達(dá)差異，首次探討中度海拔地區(qū)高原低氧環(huán)境影響男性精液質(zhì)量是否與Chk1表達(dá)變化有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 精液標(biāo)本收集

選擇在青海紅十字醫(yī)院生殖中心因不育就診的世居西寧地區(qū)(海拔2250m)漢族男性患者。按《WHO人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(2010年，第5版)標(biāo)準(zhǔn)[7]，依就診者精液檢查結(jié)果分為正常精子組、少精子組、弱精子組和少弱精子組，每組收集標(biāo)本20份。世界衛(wèi)生組織依據(jù)精子運(yùn)動(dòng)能力，將精子活力分為前向運(yùn)動(dòng)(Progressive motility，PR)、非前向運(yùn)動(dòng)(Non-progressive motility，NP)、不活動(dòng)(Immotility，IM)三級(jí)。精子密度≥15×106/mL，PR≥32%時(shí)為正常精子組；精子密度<15×106/mL，PR≥32%時(shí)為少精子組；精子密度≥15×106/mL，PR<32%時(shí)為弱精子組；精子密度<15×106/mL，PR<32%時(shí)為少弱精子組。行精液檢查前就診者需禁欲2～7天，采用手淫取精法，將精液留取至無(wú)毒、無(wú)菌的取精杯中，然后放置于37 ℃水浴箱內(nèi)，液化后(15～40分鐘)檢測(cè)pH值。

1.2 主要試劑和儀器選擇

ABI-7500型實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)。精液分析系統(tǒng)(WLJY9000，北京偉力公司)。兔單克隆抗體Chk1(EP691Y，凱基生物公司)，小鼠單克隆抗體β-actin(mAbcam 8226，凱基生物公司)。Trizol試劑盒(Invitrogen 公司)，RT-PCR試劑盒(TIANGEN公司)，BCA法蛋白定量檢測(cè)試劑盒(凱基生物公司)，蛋白分子Marker試劑盒(14KD-116KD，凱基生物公司)，ECL檢測(cè)試劑盒(凱基生物公司)。

1.3 精液常規(guī)分析

按《WHO人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》操作標(biāo)準(zhǔn)，采用精液分析系統(tǒng)，對(duì)正常精子組、少精子組、弱精子組和少弱精子組進(jìn)行精液濃度和總活力、前向運(yùn)動(dòng)力檢測(cè)。

1.4 引物設(shè)計(jì)

經(jīng)過(guò)調(diào)研，國(guó)內(nèi)重點(diǎn)大學(xué)和省屬老牌院校幾乎都成功申請(qǐng)了“省級(jí)、國(guó)家級(jí)計(jì)算機(jī)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心”建設(shè)項(xiàng)目。國(guó)內(nèi)高校的計(jì)算機(jī)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心蓬勃發(fā)展，地方院校認(rèn)識(shí)到了計(jì)算機(jī)實(shí)驗(yàn)中心建設(shè)與創(chuàng)新發(fā)展的重要性和迫切性，開(kāi)始研究探索中心建設(shè)與改革措施。從現(xiàn)狀看，地方高校計(jì)算機(jī)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心建設(shè)還存在許多問(wèn)題，主要表現(xiàn)在以下方面。

引物序列均由上海生物工程公司合成，Chk1的引物序列：

上游 5′-GACTGGGACTTG-GTGCAAAC-3′，

下游 5′-CGGCACGCTTCA-TATCTACA-3′。

β-actin(QIAGEN)為內(nèi)參照。

1.5 四組精子中Chk1 mRNA的表達(dá)水平檢測(cè)

采用qRT-PCR法檢測(cè)各組精子中Chk1 mRNA的表達(dá)水平。精液標(biāo)本離心(13000r/min)10 min后，棄上清液，將白色沉淀物用PBS液[pH7.2(0.01mol/L)]洗滌3遍。精子置于1.0 mLTrizol提取液中。精子總RNA提取依照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用Nanodrop 2000試劑盒測(cè)定總RNA濃度，提取后的RNA測(cè)A260-A280吸光值，要求A260/A280比值≥2.0，并計(jì)算出RNA含量。配制瓊脂糖凝膠檢查其完整性。根據(jù)天根Fastquant cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成(上海生物工程公司)。渦旋混勻后離心(13000r/min)10 min，置PCR儀上孵育(42℃)3 min后迅速置于冰上冷卻。再在上述PCR管中加入10 μL試劑(10×Fast RT Buffer2μL+RT Enzyme Mix 1μL+FQ-RQ Primer Mix 2μL+RNase-free ddH2O 5μL)。

渦旋混勻后按如下條件在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，95 ℃ 3 min(滅活反轉(zhuǎn)錄酶)，4 ℃反應(yīng)結(jié)束后置-80 ℃冰箱備用。根據(jù)天根SuperReal熒光定量試劑盒配制20 μL反應(yīng)體系(2×SuperReal Premix Plus 10μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，上下游引物各0.6μL，cDNA模板2μL，不足量用RNase-free ddH2O補(bǔ)足)。在實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增， 反應(yīng)條件為93 ℃預(yù)變性15 min，93 ℃ 10s，58 ℃ 32 s，共做40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)樣本及內(nèi)參的△CT，以2-△△CT統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.6 四組精子中Chk1蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 精液常規(guī)參數(shù)比較

精液常規(guī)參數(shù)相關(guān)指標(biāo)見(jiàn)表1。與正常精子組相比，少精子組、弱精子組和少弱精子組的濃度、總活力和前向運(yùn)動(dòng)力均顯著降低(P<0.05) 。

Table 1 The comparison of sperm parameters in the normal，oligozoospermia，asthenospermia，and oligoasthenozoospermia groups(±s)

*：與正常精子組比較P<0.05；▲：與少精子組比較P<0.05；#：與弱精子組比較P<0.05.

2.2 四組精子中Chk1mRNA的表達(dá)變化

Chk1mRNA的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)比于正常精子組，少精子組、弱精子組、少弱精子組中的Chk1mRNA表達(dá)量都下降。少精子組為0.67±0.12、弱精子組為0.42±0.04、少弱精子組為0.36±0.04，正常精子組中Chk1mRNA的表達(dá)明顯高于其他各組(P<0.05)。

Table 2 The expressions of sperm Chk1 mRNA and protein in four groups

*：與正常精子組比較P<0.05；▲：與少精子組比較P<0.05；#：與弱精子組比較P<0.05.

2.3 四組精子中Chk1蛋白的表達(dá)變化

Chk1蛋白檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。Chk1/β-actin灰度比值在正常精子組、少精子組、弱精子組、少弱精子組中的分別為0.90±0.05、0.78±0.07、0.77±0.06、0.68±0.07，對(duì)比于正常精子組，Chk1在其余三組中的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：正常精子組(Normal group)；2：少精子組(Oligozoospermia group)；3：弱精子組(Asthenospermia group)；4：少弱精子組(Oligoasthenozoospermia group)

圖1四組精子細(xì)胞Chk1蛋白的表達(dá)結(jié)果圖

Figure1TheexpressionsofspermChk1proteininfourgroups

3 討論

近來(lái)，長(zhǎng)期高原低氧環(huán)境對(duì)人體生殖機(jī)能的影響開(kāi)始受到關(guān)注。國(guó)外報(bào)道[8]，進(jìn)入高海拔(海拔5200m)低氧環(huán)境的男性登山員，其體內(nèi)睪酮水平在經(jīng)過(guò)7周的低氧環(huán)境暴露后顯著下降。在研究慢性低氧對(duì)精子產(chǎn)生和男性生育力的影響的文獻(xiàn)報(bào)道中顯示[9]，健康男性在低氧環(huán)境暴露26天后，出現(xiàn)精子濃度降低、精子活力減弱，但這種影響在返回海平面6個(gè)月后可以恢復(fù)至先前正常水平。長(zhǎng)期處于高原低氧環(huán)境下，隨著海拔高度的升高男性精液質(zhì)量下降更為明顯[10]。

精子DNA完整性檢測(cè)已成為評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。研究表明[11]，精子DNA甲基化和精子DNA碎片率呈明顯負(fù)相關(guān)性，對(duì)比于正常男性，精子DNA碎片率在男性不育患者中顯著升高。以往報(bào)道[12]已揭示，高原低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激可產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降，增加精子DNA損傷率，加速生殖細(xì)胞凋亡[13]。

Chk1是生物進(jìn)化過(guò)程中的蛋白激酶，Chk1mRNA和蛋白主要表達(dá)在S期和G2期，Chk1是G2DNA損傷校驗(yàn)的核心，是通過(guò)Cdc25C的磷酸化來(lái)應(yīng)答DNA損傷[14]。當(dāng)DNA受損時(shí)，Chk1可以使細(xì)胞及時(shí)進(jìn)行響應(yīng)，甚至停滯其細(xì)胞周期的進(jìn)程，而且還能啟動(dòng)修復(fù)DNA損傷的信號(hào)[15]。

在對(duì)小鼠受精卵的研究過(guò)程中，Wang B等[16]發(fā)現(xiàn)，由于氧化應(yīng)激造成精子DNA損傷后，Chk1可有效修復(fù)受損的DNA。這一研究可證實(shí)高表達(dá)Chk1有利于細(xì)胞的自我修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)[17]，Chk1的低表達(dá)可導(dǎo)致DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)喪失作用，進(jìn)而影響到細(xì)胞損傷后的修復(fù)功能。Chk1的正常表達(dá)可確保DNA復(fù)制在整個(gè)細(xì)胞分裂過(guò)程中的穩(wěn)定性和完整性。因此，在對(duì)不孕不育癥機(jī)制的研究中，Chk1能否正常的表達(dá)具有重要意義。然而，中度海拔的環(huán)境下男性精液質(zhì)量降低是否與Chk1的表達(dá)異常有關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究在分子水平上對(duì)各組精子中Chk1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各組精子都存在Chk1基因和蛋白的表達(dá)，少精子組、弱精子組和少弱精子組精子中Chk1 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著低于正常精子組，且在少弱精子組中表達(dá)量最低。提示長(zhǎng)期處于中度海拔低氧環(huán)境下，男性精液質(zhì)量下降可能與Chk1mRNA及蛋白表達(dá)量降低有關(guān)。

綜上所述，中度海拔地區(qū)漢族人群男性不育患者精液質(zhì)量降低與Chk1基因表達(dá)下調(diào)的相關(guān)性研究，將為該地區(qū)男性生殖機(jī)能的研究提供新的方向。然而中度海拔地區(qū)低氧環(huán)境引發(fā)Chk1基因降低的機(jī)理還需進(jìn)一步的深入研究。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)揭示中度海拔低氧環(huán)境下男性精液質(zhì)量下降的可能發(fā)生機(jī)制，為深入探討中度海拔低氧環(huán)境引起的精子DNA損傷在分子生物學(xué)水平的研究奠定基礎(chǔ)。也為少、弱及少弱精子癥的預(yù)防、治療開(kāi)辟了新的思路和途徑。

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