閻俊，李作漢，章文斌，徐運(yùn)

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是致死性的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，死于該病的患者估計(jì)全球每年約有3萬(wàn)人，該疾病病程短、進(jìn)展很快，平均生存期約為24～48個(gè)月[1]。迄今為止，選擇性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累變性的發(fā)病機(jī)制還尚不明了，炎癥機(jī)制是其中的可能因素之一[2]。自從1995年抑制谷氨酸興奮性毒性作用的力如太被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療該疾病以來(lái)，有超過(guò)60類(lèi)藥物分子被用于嘗試治療ALS，但大多數(shù)的藥物實(shí)驗(yàn)并未取得預(yù)期療效[1]。探尋該疾病的病理機(jī)制，尋找針對(duì)機(jī)制的有效治療藥物，延長(zhǎng)患者的病程迫在眉睫。CNS損傷后，繼發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞扮演著重要的角色。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)與主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)結(jié)合，激活EGFR信號(hào)通路，從而使受體C端酪氨酸殘基自身磷酸化發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。該信號(hào)通路激活有可能起到促炎加重神經(jīng)元損傷的作用。目前尚未有ALS患者血漿TGF-α水平研究的報(bào)道，本研究嘗試通過(guò)探討該細(xì)胞因子在ALS患者及其不同亞組間血漿水平的變化，探討其在疾病中可能起到的病理作用，為酪氨酸激酶抑制劑等治療ALS的措施提供更多的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 (1)患者組：系2010年7月～2014年11月南京腦科醫(yī)院門(mén)診及住院的48例ALS患者，男26例，女22例，男女比例1.18∶1，年齡37～74歲，平均(54.52±10.20)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合國(guó)際Escorial 修訂版診斷標(biāo)準(zhǔn),“臨床確診”及“臨床擬診”的患者[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：入組前2個(gè)月服用解熱鎮(zhèn)痛消炎藥、甾體激素及他汀類(lèi)藥物；已行經(jīng)皮胃造瘺術(shù)；預(yù)測(cè)用力肺活量<50%；糖尿病患者；有系統(tǒng)性感染的患者。(2)正常對(duì)照組：系年齡、性別與患者組匹配的同期57名正常體檢者，男31名，女26名，男女比例1.19∶1，年齡36～72歲，平均(55.67±9.07)歲。該研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)，倫理號(hào)(2010)倫審第(06)號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 資料收集與分亞組 患者診斷后均進(jìn)行功能評(píng)分(ALSFRS-R評(píng)分)[4]，根據(jù)評(píng)分結(jié)果評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度，將患者分為ALSFRSR評(píng)分≤24分(重度臨床狀態(tài))和>24分(輕度臨床狀態(tài))兩個(gè)亞組[5]。根據(jù)起病部位，將患者被分為延髓起病和肢體起病兩個(gè)亞組；患者的平均病程19.3個(gè)月(2～96個(gè)月)，根據(jù)病程，將患者分為病程≤12個(gè)月和>12個(gè)月兩個(gè)亞組[5]；根據(jù)性別，將患者分為男女兩個(gè)亞組。

1.2.2 血漿TGF-α水平的檢測(cè) 提取血漿：48例ALS患者于診斷后、57名正常對(duì)照者于體檢后分別抽取肘靜脈血1 ml，采用EDTA抗凝。在2～8 ℃下離心機(jī)(上海天美科學(xué)儀器有限公司CT15RT)1000 r/min離心15 min，離心后取上清，置于EB管。標(biāo)本采集后30 min內(nèi)放入冰箱(中國(guó)海爾公司)，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。檢測(cè)標(biāo)本：標(biāo)本送到Merck Millipore公司上?？偛繉?shí)驗(yàn)室，用MILLIPLEX MAP 液相芯片試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)HCYTOMAG-60K)完成血漿TGF-α水平檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各亞組基本資料 將患者根據(jù)性別、年齡、病程、起病部位、功能評(píng)分分為若干亞組。病程≤12個(gè)月患者26例，平均年齡(55.00±8.89)歲，男14例，女12例;病程>12個(gè)月的患者22例，平均年齡(53.95±11.75)歲，男12例，女10例。延髓起病的患者12例，平均年齡(59.33±12.54)歲，男7例，女5例;肢體起病的患者36例，平均年齡(52.92±8.92)歲，男19例，女17例。ALSFRS-R評(píng)分>24分的患者37例，平均年齡(53.78±9.52)歲，男20例，女17例;ALSFRS-R評(píng)分≤24分的患者11例，平均年齡(57.67±12.04)歲，男性6例，女性6例。

2.2 各組血漿TGF-α水平的比較 ALS組患者血漿TGF-α水平(8.42±7.19)pg/ml，較正常對(duì)照組(2.12±0.59)pg/ml明顯升高(P<0.05)。男性患者與女性患者血漿TGF-α水平分別為(8.67±7.53)pg/ml與(8.12±6.93)pg/ml，均較正常對(duì)照組明顯升高(均P<0.05)，但男性患者和女性患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)。年齡≤55歲的患者和年齡>55歲的患者血漿TGF-α水平分別為(8.26±7.01)pg/ml與(8.56±7.49)pg/ml，均較正常對(duì)照組明顯升高(均P<0.05)，但年齡≤55歲的患者與年齡>55歲的患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)。病程≤12個(gè)月患者與病程>12個(gè)月患者的血漿TGF-α水平分別為(6.13±5.85)pg/ml，(11.12±7.79)pg/ml，均較正常對(duì)照組明顯升高(均P<0.05)。而且，病程>12個(gè)月患者的血漿TGF-α水平較病程≤12個(gè)月的患者明顯升高(P<0.05) 。延髓起病的患者、肢體起病的患者血漿TGF-α水平分別為(8.12±8.24)pg/ml與(8.52±6.93)pg/ml，均較正常對(duì)照組明顯升高(均P<0.05)，但延髓起病的患者和肢體起病的患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)。ALSFRS-R評(píng)分≤24分的患者與ALSFRS-R 評(píng)分>24分的患者血漿TGF-α水平分別為(12.90±9.67)pg/ml與(7.08±5.79)pg/ml，均較正常對(duì)照組明顯升高(均P<0.05)，但ALSFRS-R評(píng)分>24分的患者和ALSFRS-R 評(píng)分≤24分的患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析揭示，患者的血漿TGF-α水平與病程統(tǒng)計(jì)呈正相關(guān)(RRho=0.314，P=0.030) 。

3 討 論

ALS是一種迄今為止發(fā)病機(jī)制仍不明的疾病，只有大約5%～10%的ALS病例是家族性的，其余病例是散發(fā)性的，可能是多種基因變異和復(fù)雜環(huán)境因素共同作用所致[6-7]。該疾病病理生理機(jī)制復(fù)雜，炎癥機(jī)制可能是其中若干因素之一。研究[8]認(rèn)為，在該疾病的早期,小膠質(zhì)細(xì)胞處于M2表型，起到抑炎作用，后期隨著病程發(fā)展，轉(zhuǎn)化為M1表型，釋放促炎因子加速疾病的進(jìn)展。

作為表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族的一員，TGF-α是EGFR內(nèi)源性配體之一，通過(guò)與表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的EGF受體結(jié)合，使受體C端的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而起到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化的作用。自身磷酸化的EGFR促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜息態(tài)向激活態(tài)轉(zhuǎn)變，激活態(tài)細(xì)胞釋放大量自由氧，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、谷氨酸興奮性毒性反應(yīng)，同時(shí)可以釋放大量炎性因子，產(chǎn)生過(guò)量的一氧化氮，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[9]。有證據(jù)[10]表明，EGFR信號(hào)通路在ALS病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

作為抑制谷氨酸興奮性毒性作用的力如太是1995美國(guó)食品藥品管理局(FDA)最早批準(zhǔn)用于口服治療ALS的藥物[1]。2016年，在SOD1G93A型ALS突變鼠動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，模型鼠出現(xiàn)肢體癱瘓7 d后給予口服高選擇性酪氨酸激酶抑制劑馬賽替尼(Mastinib)30 mg/(kg·d)，最終與對(duì)照組比較，能夠延長(zhǎng)模型鼠癱瘓后生存期40%。研究[11]發(fā)現(xiàn)，高選擇性酪氨酸激酶抑制劑馬賽替尼能抑制異常小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，阻滯小膠質(zhì)細(xì)胞遷移和神經(jīng)炎癥，歐洲藥物管理局孤兒藥品委員會(huì)于2016年8月授予馬賽替尼治療ALS的孤兒藥地位。

本研究發(fā)現(xiàn)，患者血漿中激活EGFR信號(hào)通路的EGF TGF-α水平明顯高于正常對(duì)照組，對(duì)患者亞組分析發(fā)現(xiàn)，各患者亞組與正常對(duì)照相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，病程>12個(gè)月的比病程≤12個(gè)月的血漿TGF-α水平明顯升高(P<0.05)，且指標(biāo)與病程呈正相關(guān)，可以推斷血漿TGF-α在ALS的炎癥機(jī)制中起到一定作用，可能隨著病程的增加，血漿TGF-α水平增加，可能使星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中EGF受體C端的酪氨酸殘基自身磷酸化作用加強(qiáng)，增強(qiáng)EGFR信號(hào)通路的激活，促進(jìn)疾病進(jìn)展。不同的起病部位、性別、年齡之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該指標(biāo)與起病部位、性別、年齡無(wú)相關(guān)性。而且，該指標(biāo)與疾病嚴(yán)重程度之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與受試者數(shù)量相對(duì)較少有關(guān)，今后應(yīng)增加更多的入組病例數(shù)。

目前尚未有ALS患者血漿TGF-α水平研究的相關(guān)報(bào)道，本研究可以推斷血漿TGF-α在ALS炎癥機(jī)制中起到一定的作用，并可能起到加速病情進(jìn)展的作用，該指標(biāo)可能成為推斷疾病進(jìn)展的生物標(biāo)記。本研究可以嘗試為酪氨酸激酶抑制劑治療ALS提供更多的理論依據(jù)。目前，以EGFR作為藥物靶點(diǎn)的創(chuàng)新藥物研究，多集中在腫瘤領(lǐng)域[12]，近年針對(duì)ALS病理機(jī)制的藥物研究層出不窮，本研究可以為今后應(yīng)用EGFR抑制劑作為ALS治療的藥物靶點(diǎn)邁出嘗試的一步。ALS作為一種罕見(jiàn)病，發(fā)病率相對(duì)較低，該疾病標(biāo)本的留取存在一定困難，進(jìn)一步研究需要更大的群組研究和更多的患者亞組，開(kāi)展縱向研究，今后將對(duì)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)作進(jìn)一步完善。

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