鄭晨鈺 溫賢浩 郭玉霞 管賢敏 于 潔 肖劍文

重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院 兒童醫(yī)院兒科研究所 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室兒科學重慶市重點實驗室（重慶 400014）

·論 著·

EVI1基因在兒童急性髓細胞白血病中的表達及意義

鄭晨鈺 溫賢浩 郭玉霞 管賢敏 于 潔 肖劍文

重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院 兒童醫(yī)院兒科研究所 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室兒科學重慶市重點實驗室（重慶 400014）

目的探討EVI1基因表達與兒童急性髓細胞白血?。ˋML）臨床表現(xiàn)及預后的關系。方法檢測AML患兒EVI1基因表達，分析EVI1陽性AML患兒臨床和實驗室檢查特點以及預后。結果145例AML患兒中EVI1陽性38例，占26.21%。與陰性組相比，陽性組患兒的年齡、性別、血紅蛋白量、白細胞及血小板計數(shù)、細胞形態(tài)學FAB分型、異常核型檢出率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；陰性組復雜核型檢出率高于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.50，P=0.019）。38例陽性患兒中，14例化療與7例異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）患兒的無事件生存（EFS）率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.00，P=0.045）。陽性組與陰性組患兒化療完全緩解率差異無統(tǒng)計學意義（91.67%對91.18%，P＞0.05），陽性組患兒復發(fā)率高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（64.29% 對22.22%，P=0.009）；兩組EFS率差異也有統(tǒng)計學意義（χ2=5.76，P=0.015）。2例陽性組患兒骨髓復發(fā)時EVI1基因仍陰性。結論EVI1基因是兒童AML的不良預后因素，allo-HSCT可改善EVI1陽性AML患兒預后。定量檢測EVI1基因表達可能不適用于微小殘留病監(jiān)測。

急性髓細胞白血?。?EVI1基因； 預后； 兒童

急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種異質性很強的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，目前認為克隆性染色體異常所形成的融合基因可干擾造血調控，在AML發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。 EVI1（ecotropic virus integration site-1）基因是一種定位于人類染色體3q26的原癌基因，該基因可編碼一種鋅指蛋白并特異性地結合基因啟動子DNA序列，其過度表達在AML發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[2]。文獻報道成人AML患者EVI1基因高表達提示預后不良，但兒童AML中EVI1基因表達及臨床意義的報道不多[3,4]。本研究就EVI1高表達對兒童AML臨床表現(xiàn)及與預后的影響進行探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2012年12月至2015年12月重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤中心收治的145例兒童AML患兒為研究對象。入選標準：①年齡 5個月～ 14歲9個月；②均為首診患兒；③所有患兒均經骨髓形態(tài)學、細胞組織化學染色、細胞免疫分型、細胞遺傳學及分子生物學檢測確診。排除標準：治療相關性白血病，21-三體綜合征相關性白血病，慢性髓細胞白血病急性變，混合細胞性白血病及急性早幼粒細胞白血病，初診時有中樞神經系統(tǒng)白血病，合并其他腫瘤或未按WHO-2008標準[5]完善檢查者。入選研究對象根據(jù)初診EVI1基因檢測結果，分為陽性組（EVI1基因高表達）和陰性組（EVI1基因陰性）。

本研究得到重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準并經患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集研究對象的性別、年齡、初診血常規(guī)、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、骨髓檢查結果及療效等資料。

1.2.2 EVI1基因檢測 骨髓涂片分類計數(shù)并結合組織化學染色（包括過氧化酶、糖原染色、非特異性酯酶及氟化鈉抑制試驗等）進行細胞形態(tài)學FAB分型；EDTA抗凝骨髓液采用4色流式細胞儀（FCM）進行免疫分型；骨髓液短期培養(yǎng)后G顯帶技術進行核型分析，參照ISCN2005標準進行核型描述[6]，染色體核型存在3種以上異常定義為復雜核型。骨髓分離單個核細胞提取RNA，采用多重巢式逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測包括EVI1基因在內的29種融合基因[7]。EVI1基因陽性者采用實時定量PCR（RQ-PCR）測定EVI1表達量，ABL作為內參[3]。 EVI1表達量= 2-ΔΔCt（ΔΔCt= ΔCt患兒- ΔCt正常人，ΔCt正常人= Ct正常人EVI1- Ct正常人ABL，ΔCt患兒= Ct患兒EVI1- Ct患兒ABL）。2-ΔΔCt≤ 8為EVI1陰性，8 ＜ 2-ΔΔCt≤ 32為EVI1陽性低表達，2-ΔΔCt＞ 32為EVI1陽性高表達。其他陽性基因使用單獨RT-PCR復核確認[8]。

1.2.3 治療方案及療效評估 參考《兒童AML診療建議》[9]進行化療和鞘內注射藥物預防中樞神經系統(tǒng)白血病。①誘導化療：2個療程DAE方案，即柔紅霉素（DNR）40 mg/(m2·d)，d1-3，靜滴30 min；阿糖胞苷（Ara-C）200 mg/(m2·d)，d1-7，分2次，q12h，皮下注射；依托泊苷(VP16)100 mg/(m2·d)，d1-3，靜滴3～4 h。②鞏固化療：3個療程中大劑量Ara-C+DNR(或VP 16)：DNR 40mg/(m2·d)，d1-2，靜滴30 min或VP 16 100mg/(m2·d)，d1-2，靜滴3～4h；Ara-C2g/m22，q12h，d1-3，靜滴2～3h或AraC1g/m2，q12h，d1-4，靜滴2～3h；2個療程HA方案，高三尖杉酯堿（HRT）3 mg/(m2·d)，d1-7，靜滴30 min，Ara-C 200 mg/(m2·d)，d1-7，分2次，q12h，皮下注射。③強化化療：2～3個療程中大劑量Ara-C+DNR(或VP16)：DAR 40mg/(m2·d)，d1-2，靜滴30min或VP16 100mg/(m2·d)，d1-2，靜滴3～4h；Ara-C 2g/m2，q12h，d1-3，靜滴2～3h或AraC1g/m2，q12h，d1-4，靜滴2～3h。根據(jù)家屬意愿，部分患兒接受異基因造血干細胞移植（allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）。兩次誘導方案后及鞏固、強化階段化療前均行骨髓細胞學檢查，使用FCM進行微小殘留?。╩inimal resident disease，MRD）監(jiān)測，MRD＜10-4定義為陰性[10]。RQ-PCR和RT-PCR技術分別檢測EVI1基因和其他陽性基因表達情況[8]。1.2.4 隨訪 隨訪時間截至2016年5月30 日。中位隨訪時間25.65個月（0 ～ 50個月）。無事件生存（eventfree survival，EFS）期定義為從診斷到第1次事件（包括復發(fā)、在完全緩解期間死亡）或末次隨訪的時間。參照《血液病診斷及療效標準》[11]，完全緩解（complete remission，CR）定義為骨髓增生活躍或明顯活躍，白血病細胞＜5%；復發(fā)定義為骨髓白血病細胞≥20%。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法；生存分析應用Kaplan-Meier生存曲線，多組生存率的比較應用Log-Rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

145例患兒中男84例、女61例，平均年齡為（42.76±46.84）月（5個月 ～ 14歲9個月），其中38例檢出EVI1基因且均為高表達（占26.21%），107例為EVI1基因低表達。與陰性組相比，陽性組初診年齡、性別、血紅蛋白量、白細胞及血小板計數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 骨髓檢查

結合免疫分型，陽性組FAB分型以AML-M5型最為常見，與陰性組相比，AML各亞型分布差異無統(tǒng)計學意義（P=0.410）。見表2。

陽性組2例患兒未見分裂相；其余36例中，13例正常核型，23例異常核型（包括復雜核型10例），異常核型和復雜核型檢出率分別為63.89%和27.78%。陽性組2例患兒3號染色體異常，分別為t(3;13)(q22;q13)和t(3;17)(p26;q23)。陰性組10例患兒未見分裂相；其余97例中，25例正常核型，72例異常核型（包括復雜核型49例），異常核型和復雜核型檢出率分別為74.23%和50.51%。陰性組和陽性組的異常核型檢出率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.37，P=0.241），但陰性組的復雜核型檢出率高于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.50，P=0.019）。38例陽性組患兒中，9例（23.68%）檢出其他白血病基因，包括MLL/AF9（4例）、MLL/ AF1q（2例）、AML/ETO（2例）和CBFβ/MYH11（1例）。2.3 療效分析

38例陽性組患兒中，1例確診前死亡，13例放棄治療，24例接受化療。接受化療的24例陽性組患兒中，21例首次誘導治療后CR，3例未獲CR患兒中2例接受第二療程誘導治療（1例CR），1例直接予allo-HSCT，誘導治療共22例患兒CR（占91.67%）；22例誘導治療獲CR的患兒中2例放棄治療，14例繼續(xù)接受化療，6例接受allo-HSCT。14例繼續(xù)化療患兒中，復發(fā)9例（骨髓復發(fā)8例，中樞復發(fā)1例），復發(fā)率64.29%；失訪2例；中位EFS時間（11.00±15.70）月，3年EFS率為（41.10±0.16）%。7例接受allo-HSCT患兒均為外周血allo-HSCT（HLA相合同胞移植2例、無關供者1例、HLA半相合親緣供者4例），復發(fā)1例，復發(fā)率14.29%，無治療相關死亡，中位EFS時間（24.14±15.87）月。38例陽性組患兒中，14例化療與7例allo-HSCT患兒的EFS率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.00，P=0.045）。見圖1。

107例陰性組患兒中，3例確診前死亡，28例放棄治療，8例按其他方案治療，共68例接受與陽性組患兒相同誘導方案化療。53例首次誘導治療后CR；15例未CR患兒中12例接受第二療程誘導治療，9例CR，2例未CR，1例失訪。誘導治療共62例患兒CR（占91.18%），其中45例接受化療，13例接受allo-HSCT，4例放棄治療。45例化療患兒中，骨髓抑制合并感染死亡4例，復發(fā)10例（骨髓復發(fā)9例、睪丸復發(fā)1例），復發(fā)率22.22%，失訪4例，中位EFS時間（23.67± 15.40）月。

陽性組與陰性組患兒相比，化療CR率差異無統(tǒng)計學意義（91.67% 對91.18%，χ2=0.00，P=1.000）；陽性組患兒復發(fā)率高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（64.29% 對22.22%，χ2=6.83，P=0.009）；兩組EFS率差異也有統(tǒng)計學意義（χ2=5.76，P=0.015）。見圖2。

陽性組24例經誘導治療后共22例達CR。CR患兒中15例行FCM-MRD檢測，12例陰性，3例陽性；12例復查EVI1基因，8例陰性，2例陽性低表達，2例陽性高表達。陽性組14例單純化療患兒中共8例骨髓復發(fā)，復查EVI1基因2例陰性，2例陽性低表達，4例陽性高表達。陽性組接受allo-HSCT組移植的6例CR患兒中4例EVI1陰性，1例陽性高表達，1例陽性低表達；1例移植前未CR患兒為EVI1陽性低表達，1例移植復發(fā)患兒為移植前細胞學CR且EVI1陰性。

3 討論

AML臨床表現(xiàn)及預后差異較大。一般認為與兒童AML預后相關的危險因素包括診斷年齡、初診白細胞計數(shù)及細胞遺傳學改變等，其中特殊基因異常表達是重要的預后影響因子[9]。人類EVI1基因定位于染色體3q26，該基因高表達可抑制粒系細胞對集落刺激因子的反應，還能抑制轉錄因子GATA-1誘導的基因轉錄，阻礙紅細胞生成素誘導的紅系祖細胞分化，從而阻礙髓系細胞成熟分化[2]。

本研究顯示，初診AML患兒EVI1基因陽性高表達比例為25.50%，高于文獻報道[3,4]，可能與本研究未納入慢性髓細胞白血病急性變、急性早幼粒細胞白血病等有關。EVI1陽性患兒的發(fā)病年齡、性別、血紅蛋白、白細胞及血小板水平與EVI1陰性患兒的差異無統(tǒng)計學意義，與文獻相符[4]。EVI1激活常發(fā)生于AML的M0、M1和M2亞型[3]，但本組患兒除AML-M0外各亞型均有分布，AML-M5型最常見。本研究中染色體異常核型及復雜核型檢出率分別達63.89%和27.78%，但與EVI1陰性組比較無顯著差異。EVI1基因常見于t(3;3)(q21;q26)和inv(3q21;q26)，但本組患兒中僅2例檢出3號染色體異常（占5.56%）且均非上述改變，提示缺乏3號染色體異常的AML患兒也可檢出本基因[2]。本研究中合并其他白血病基因比例為23.68%，既有提示預后不良的MLL重排相關基因，也有提示預后較好的AML/ETO和CBFβ/MYH11基因[12]，而EVI1基因利用其兩個含鋅指樣結構的區(qū)域與DNA發(fā)生作用并抑制啟動子合成，提示EVI1基因可能通過調節(jié)其他基因表達而在AML的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[13]。

本研究顯示，EVI1陽性AML患兒誘導治療CR率91.67%，與EVI1陰性組無差異，也與本中心前期研究（總CR率87.8%）結果相似[14]。但EVI1陽性組接受化療患兒復發(fā)率高，EFS低于EVI1陰性組，中位生存時間僅13個月，相關研究也表明EVI1基因高表達提示兒童AML預后不佳[4]。本研究包括未CR在內共7例EVI1陽性患兒接受allo-HSCT，復發(fā)率14.29%，與EVI1陽性化療組比較療效有顯著差異，相關研究也報道EVI1陽性且接受allo-HSCT的年輕成人患者2年EFS達47%[3]，提示allo-HSCT可提高EVI1陽性患兒生存率，且EVI1基因是否轉陰可能不影響allo-HSCT療效。

值得注意的是治療后EVI1基因表達與細胞學和FCM檢測結果不同步，化療后細胞學及FCM均達CR的患兒部分仍有不同程度EVI1基因表達，而8例化療后骨髓細胞學已達復發(fā)標準時仍有2例（25%）患兒EVI1基因為陰性。相關研究顯示，AML復發(fā)時EVI1基因表達水平雖高于誘導治療后但低于初診時的表達[15]。以上研究均提示隨訪EVI1基因表達可能不能作為MRD監(jiān)測指標。但本研究樣本量較小，還需進一步擴大樣本量、延長隨訪時間證實該推論。

[1] Engen CB, Hajjar E, Gjertsen BT. Development of personalized molecular therapy for acute myeloid leukemia [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2016, 17(1)： 20-29.

[2] De Braekeleer M, Le Bris MJ, De Braekeleer E，et al. 3q26/ EVI1 rearrangements in myeloid hemopathies： a cytogenetic review [J]. Future Oncol, 2015, 11(11)： 1675-1686.

[3] Gr?schel S, Lugthart S, Schlenk RF，et al. High EVI1 expression predicts outcome in younger adult patients with acute myeloid leukemia and is associated with distinct cytogenetic abnormalities [J]. J Clin Oncol, 2010, 28(12)：2101-2107.

[4] Jo A, Mitani S, Shiba N, et al. High expression of EVI1 and MEL1 is a compelling poor prognostic marker of pediatric AML [J]. Leukemia, 2015, 29(5)： 1076-1083.

[5] Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. WHO classi fi cation of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues [M]. Lyon： IARC Press, 2008.

[6] 周艷芬, 金潤銘. 伴[t(2;13)(q37;q12),t(8;21)(q22;q22)]特殊染色體易位的M2型急性髓系白血病1例報告 [J]. 臨床兒科雜志, 2015, 33(5)： 497-498.

[7] Pallisgaard N, Hokland P, Riish?j DC, et al. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia [J]. Blood, 1998, 92(2)： 574-588.

[8] Radmacher MD, Marcucci G, Ruppert AS, et al. Independent confirmation of a prognostic gene-expression signature inadult acute myeloid leukemia with a normal karyotype：a Cancer and Leukemia Group B study [J]. Blood, 2006, 108(5)： 1677-1683.

[9] 中華醫(yī)學會兒科學分會血液學組, 中華兒科雜志編輯委員會. 兒童急性髓細胞白血病診療建議 [J]. 中華兒科雜志, 2006, 44(11)： 877-878.

[10] 張之南, 沈悌. 血液病診斷及療效標準 [M]. 3版. 北京：科學出版社, 2008.

[11] Kusenda J, Fajtova M, Kovarikova A. Monitoring of minimal residual disease in acute leukemia by multiparametric flow cytometry [J]. Neoplasma, 2014, 61(2)： 119-127.

[12] Angelova S, Spassov B, Nikolova V, et al. Is the ampli fi cation of c-MYC, MLL, and RUNX1, genes in AML and MDS patients with trisomy 8, 11 and 21 a factor for a clonal evolution in their karyotype? [J]. Tsitol Genet, 2015, 49(3)： 165-172.

[13] Gr?schel S, Schlenk RF, Engelmann J, et al. Deregulated expression of EVI1 de fi nes a poor prognostic subset of MLL-rearranged acute myeloid leukemias： a study of the German-Austrian Acute Myeloid Leukemia Study Group and the Dutch-Belgian-Swiss HOVON/SAKK Cooperative Group [J]. J Clin Oncol, 2013, 31(1)： 95-103.

[14] 張銀娟, 于潔, 憲瑩, 等. 兒童急性髓細胞白血病163例臨床分析 [J]. 中國小兒血液與腫瘤雜志, 2014, 19(2)： 73-77.

[15] Smol T, Nibourel O, Marceau-Renaut A, et al. Quanti fi cation of EVI1 transcript levels in acute myeloid leukemia by RT-qPCR analysis： a study by the ALFA Group [J]. Leuk Res, 2015, 39(12)： 1443-1447.

Expression of EVI1 gene and its clinical significance in pediatric acute myeloid leukemia

ZHENG Chenyu, WEN

Xianhao, GUO Yuxia, GUAN Xianmin, YU Jie, XIAO Jianwen
(Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Pediatric Research Institute of Children’s Hospital, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Chongqing Key Laboratory of Pediatrics, Chongqing 400014, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between EVI1 gene expression and clinical features and prognosis of children with acute myeloid leukemia (AML).MethodsEVI1 gene was detected in AML children, correlation of clinical and lab features, prognosis of AML children with EVI1 gene were analyzed.ResultsEVI1 expression is positive in 38 of 145 children with AML. There were no significant differences in age, gender, hemoglobin concentration, leukocytes and platelet count, subtype of morphology, ratio of chromosomal anomaly and complex karyotypes between EVI1 positive and EVI1 negative group (P＞0.05); coexist genes were detected in 9 cases (23.68%) of EVI1 positive group. Rate of complete remission (CR) was 91.67% in 24 cases of EVI1 positive patients received chemotherapy. Relapse rate was 64.29% and 14.29% in EVI1 positive patients who received chemotherapy and allo-hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), retrospectively and signi fi cant differences were found (P＜0.05). There was no signi fi cant difference in CR but signi fi cant difference was found in event free survival (P＜0.05) for EVI1 positive and EVI1 negative patients who received chemotherapy. EVI1 gene kept negative when bone marrow relapse occurred in two patients with EVI1 positive at diagnosis.ConclusionEVI1 gene may play adverse role in pediatric AML; prognosis of EVI1 positive AML patients can be improved by allo-HSCT; follow-up of EVI1 transcript levels is insuf fi cient to monitoring of minimal residual disease.

acute myeloid leukemia; EVI1 gene; prognosis; child

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.05.003

2016-05-15)

(本文編輯：蔡虹蔚)

重慶市衛(wèi)生計生委醫(yī)學科研項目（No.2015msxm042）

肖劍文 電子信箱：tomahawk6502@sohu.com