蔡寶寧，陸相楊，仇 睿，喬志雄，甘向峰

·論 著·

小干擾RNA下調GPX1基因對食管鱗癌EC9706細胞增殖及順鉑敏感性的影響

蔡寶寧，陸相楊，仇 睿，喬志雄，甘向峰

目的 探討靶向下調谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)對人食管鱗狀細胞癌細胞株(EC9706)增殖和順鉑敏感性的影響。方法 合成針對GPX1的siRNA，分別用Lipofectamine 2000脂質體瞬時轉染人食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706。Western Blot法檢測轉染后GPX1蛋白表達，用MTS檢測法測定轉染后細胞的增殖活力和順鉑敏感性。結果 siRNA干擾EC9706細胞后在36、48、60及72 h對細胞增殖活性較對照組明顯抑制(P<0.05)。經siRNA干擾GPX1表達下調，在由不同濃度的順鉑作用后同對照組相比，細胞對順鉑的敏感性明顯上升(P<0.05)，[IC50(siGPX1)=3.8 μmol/L，IC50(陰性對照)=6.1 μmol/L，IC50(空白對照)=6.9 μmol/L]。結論 siRNA下調GPX1表達可以抑制人食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706的增殖能力，以及上調其對順鉑的敏感性。

食管鱗狀細胞癌；谷胱甘肽過氧化物酶1；小干擾RNA；順鉑

食管癌是最常見的胸部惡性腫瘤之一,目前對食管癌的發(fā)病原因和機制仍不十分明確[1-2]。研究結果提示，乳腺癌、肺癌、肝癌等腫瘤中均存在不同程度的氧自由基(ROS)活性異常[3-5]。谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)是一種抗氧化酶，是抗氧化酶家族的重要成員[6-8]，在體細胞惡變時會出現(xiàn)表達異常，并引起細胞內ROS活性失調[9-10]。本研究旨在利用RNA干擾技術使食管鱗狀癌細胞內GPX1表達下降，研究其生物學行為的變化及作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料：食管癌細胞株EC9706購自中科院上海細胞庫；胰蛋白酶、RPMI 1640細胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；羊抗兔IgG二抗、兔抗人GAPDH抗體、兔抗人GPX1抗體購自Cell Signaling公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司，轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；RIPA組織細胞裂解液購自碧云天公司。小干擾RNA(siRNA)由上海吉瑪制藥公司合成，siGPX1：5’-GGUACUACUUAUCGAGAAUTT-3’；5’-AUUCUCGAUAAGUAGUACCTT-3’。陰性對照Scramble：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT T-3’； 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.2 細胞培養(yǎng)及siRNA的轉染：細胞置于含10%胎牛血清無抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，待細胞生長至60%～80%常規(guī)傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。siRNA轉染前待細胞生長至50%～60%，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒操作步驟進行轉染，根據(jù)實驗需要收集細胞。

1.3 Western Blot：siRNA干擾48 h后，用PBS緩沖液漂洗細胞2遍。收集細胞，用RIPA裂解細胞，置于冰上30 min，后離心提取蛋白質，BCA試劑盒測定蛋白質濃度。10 % SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉膜，25 mL封閉緩沖液中室溫封閉1 h，加入GPX1及GAPDH單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖：轉染后36 h，取各組EC9706細胞用胰酶消化后制成單細胞懸液，按照每孔500個細胞接種于96孔板上，每組設置5個復孔。培養(yǎng)1～3 d后，采用CCK-8細胞增殖檢測試劑盒測定吸光度(OD)值，計算平均值，繪制各組細胞生長率情況折線圖。實驗均重復5次。

1.5 CCK-8檢測細胞對順鉑的敏感性：轉染后36 h，將各組細胞按照每孔5 000個細胞接種于96孔板上，培養(yǎng)過夜后按照0、2.5、5、10、20、40 μmol/L濃度梯度培養(yǎng)各組細胞，每組細胞每個濃度梯度設置5個復孔。培養(yǎng)48 h后采用CCK-8法檢測96孔板OD值，繪制順鉑對細胞生長抑制情況折線圖。實驗均重復5次。

1.6 統(tǒng)計學方法：應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用t檢驗或單因素方差分析。

2 結果

2.1 siGPX1抑制EC9706細胞GPX1蛋白表達：利用Western Blot法檢測各組轉染48 h后細胞中GPX蛋白表達，結果顯示與空白對照組及陰性對照組比較，siGPX1干擾組GPX1蛋白表達水平明顯減低，說明siRNA特異性抑制GPX1蛋白表達。

2.2 siGPX1抑制EC9706細胞增殖：利用CCK-8法檢測轉染1～3 d 后各組EC9706細胞的活性，結果顯示轉染siGPX1后EC9706細胞增殖受到明顯抑制，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 siGPX1增加EC9706細胞對順鉑敏感性：不同濃度順鉑作用72 h后，利用CCK-8法檢測EC9706細胞活性。結果顯示，相同順鉑濃度時，轉染siGPX1后EC9706細胞對其敏感性高于空白對照組及陰性對照組，其中，當順鉑濃度為2.5 μmol/L及5 μmol/L時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他濃度時差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

近些年食管癌的診斷和手術技術不斷發(fā)展，但是其5年生存率依舊不能令人滿意，雖然近些年分子生物學相關領域研究發(fā)展迅速，但食管癌的發(fā)生發(fā)展機制仍不十分明確[1-2,11]。在人體細胞新陳代謝過程中不斷產生的ROS可以破壞細胞各種膜結構、細胞器、DNA等，影響細胞結構及功能的完整性[12]。谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs)是一個抗氧化酶家族，共有8個家族成員[13]，它們的編碼基因分別位于不同的染色體上，編碼一類能夠高效消除體內ROS的抗氧化酶，避免細胞膜的氧化損傷和高氧條件下DNA的破壞，維系機體或細胞內氧化還原系統(tǒng)平衡[6，8]。

研究提示，在惡性腫瘤病理過程中，當GPX1的表達出現(xiàn)明顯異常時，由ROS介導的細胞毒作用會發(fā)生一系列變化，從而引起惡性腫瘤細胞生物學行為的改變[12，14]。這一點與本研究結果基本一致，轉染siGPX1后EC9706細胞內GPX1表達明顯降低，細胞增殖受到明顯抑制。除此之外，現(xiàn)有研究表明，當順鉑等鉑類化療藥物進入腫瘤細胞后與細胞DNA形成復合物[5，15-16]，在破壞DNA和線粒體結構的過程中產生大量ROS，并通過MAPK-p38通路，使Bad激活，促使Caspase 3和Caspase 9從線粒體中釋放，使腫瘤細胞發(fā)生凋亡[6，14]。我們設想，當細胞內GPX1表達發(fā)生改變后，食管鱗癌EC9706細胞對順鉑的敏感性可能也會發(fā)生相應改變。本研究結果顯示，經由siGPX1轉染使細胞內GPX1表達下降后，原本相對耐藥的EC9706細胞對順鉑的敏感性有所提高[IC50(siGPX1)=3.8 μmol/L，IC50(陰性對照)=6.1 μmol/L，IC50(空白對照)=6.9 μmol/L]，尤其在順鉑濃度為2.5 μmol/L及5 μmol/L時最為明顯，這一發(fā)現(xiàn)目前在食管癌研究中尚未見報道。

本研究結果表明，通過siRNA下調GPX1基因表達，可使食管鱗癌EC9706細胞增殖受到明顯抑制，并且可上調食管鱗癌EC9706細胞對順鉑的敏感性。但對于直接引起GPX1活性改變的上游調控元件，以及GPX1表達改變之后直接引起細胞生物學行為變化的下游作用分子并不十分清楚，仍需要進一步探索。

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Effect of small interfering RNA gene down-regulated GPX1 gene on the proliferation and the cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma EC9706

CAI Baoning,LU Xiangyang,QIU Rui,QIAO Zhixioing,GAN Xiangfeng.

Department of Thoracic Surgery,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

GAN Xiangfeng,Email:foryours.gan@msn.com

Objective To explore the effect of down-regulated GPX1 gene on the proliferation and the cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma EC9706.Methods Lipofectamine 2000 liposomes were used to transfect human squamous cell carcinoma cell line EC9706 transiently for GPX1 synthetized siRNA. GPX1 protein expression was measured by Western Blot,proliferation of cell and sensitivity of cisplatin were measured by MTS.Results The proliferation were inhibited than that in control group when EC9706 were interfered with siRNA at 36 h,48 h,60 h and 72 h (P<0.05).Down-regulated by siRNA interference GPX1 after different concentrations of cisplatin as compared with that in control group,cell sensitivity to cisplatin significantly increased (P<0.05),(IC50(siGPX1)=3.8,IC50(Scramble)=6.1 umol/L,IC50(Blank)=6.9 umol/L).Conclusion siRNA down-regulated GPX1 gene can inhibit the proliferation of human esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706 and increase its sensitivity to cisplatin.

Esophagealsquamouscellcarcinoma;Glutathioneperoxidase-1;SmallinterferingRNA;Cisplatin

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0596

寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院胸外科，寧夏 銀川 750004

蔡寶寧(1981-)，男，寧夏籍，大學本科，主治醫(yī)師，主要從事胸心外科研究。

甘向峰，Email:foryours.gan@msn.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.016.html

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2017-01-03 [責任編輯]李 潔